Name: 通过表达GFP的骨细胞的小鼠颅骨分割获得原代骨细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 了解利用dmp1-topaz转基因小鼠模型和荧光激活细胞分选技术高效分离表达GFP的原代骨细胞的方法。该方案显著缩短操作时间并提高细胞产量，为骨细胞生物学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由日本学术振兴会（JSPS）科研费资助（资助编号：19K10397，负责人H.K.；资助编号：18K09862，负责人I.M.）。

所有动物实验操作和动物护理均按照东北大学的规定和要求进行。
1. 新生 dmp1-topaz 小鼠颅盖骨的解剖
<ol>
	<li>本实验方案使用出生6‒7天的C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J小鼠幼崽。通过吸入5%异氟烷处死小鼠，随后将幼崽转移至70%乙醇中。</li>
	<li>将已处死的幼崽转移至未经处理的培养皿中。</li>
	<li>使用剪刀和镊子，在颅骨基部抓住皮肤并做一切口。</li>
	<li>以第一个切口为起点，沿耳前颅骨两侧剪开，去除皮肤，暴露颅顶骨。</li>
	<li>从鼻梁处握住头部，沿人字缝剪开颅顶骨。沿顶骨的侧缘剪切，并向前延伸至额部。</li>
	<li>将颅顶骨与下方脑组织分离。 
	注意：为确保获得干净且软组织残留最少的骨性颅顶骨，切勿深入骨组织内部；作为参考，应能观察到剪刀在骨片下方形成的阴影。</li>
	<li>将颅顶骨转移至磷酸盐缓冲液（PBS，整个实验过程中pH保持7.4）。确保其凹面朝上。</li>
</ol>
2. 新生小鼠颅盖骨的分级分离
<ol>
	<li>将最多5个颅盖骨转移至含有5 mL 2 mg/mL胶原酶溶液的50 mL锥形管中。使用使用前新鲜配制的胶原酶溶液。
	<ol>
		<li>配制新鲜胶原酶溶液时，将胶原酶粉末加入分离缓冲液（70 mM NaCl、10 mM NaHCO3、60 mM山梨醇、3 mM K2HPO4、1 mM CaCl2、1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、5 mg/mL葡萄糖和25 mM HEPES）中，使其终浓度为2 mg/mL，并在磁力搅拌器上溶解胶原酶粉末。</li>
		<li>将胶原酶溶液通过0.22 μm无菌滤器过滤至50 mL离心管中，并在整个操作过程中置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将颅盖骨在37 °C、300 rpm振荡条件下孵育20分钟，以获得第1组分。</li>
	<li>弃去第1组分的消化液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤颅盖骨，然后弃去洗涤液。</li>
	<li>将颅盖骨在5 mL含1 mg/mL BSA的5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）PBS溶液（pH 7.4）中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育15分钟。</li>
	<li>将消化液收集至50 mL锥形管中。用5 mL PBS洗涤颅盖骨，并将洗涤液加入消化液中。 
	注意：每次收集消化液和洗涤时，均应使用移液器反复吹打骨组织及其溶液，以使细胞从骨组织上脱落，并防止细胞双联体和细胞聚集体形成。</li>
	<li>为获得第2组分，将消化液在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于8 mL α-最低必需培养基（MEM）中，该培养基含有10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素。接种至10 cm培养皿中。将第2组分在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>将颅盖骨在5 mL胶原酶溶液中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育20分钟。</li>
	<li>为收集第3组分，重复步骤2.5–2.6。将第3组分在37 °C、5% CO2条件下孵育。 
	注意：此时骨组织会变小并碎裂成片段。为防止骨碎片意外被吸入消化液中导致细胞损失，收集消化液时应使用小头移液器（1000–200 μL枪头）。</li>
	<li>将颅盖骨在5 mL胶原酶溶液中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育20分钟。</li>
	<li>为收集第4组分，重复步骤2.5–2.6。将第4组分在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>将颅盖骨在5 mL含1 mg/mL BSA的5 mM EDTA PBS溶液（pH 7.4）中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育15分钟。</li>
	<li>为收集第5组分，重复步骤2.5–2.6。将第5组分在37 °C、5% CO2条件下孵育。骨细胞可在当天进行分选，或在分选前培养最多24小时。</li>
</ol>
3. 荧光激活细胞分选用骨细胞的制备
<ol>
	<li>吸弃每种细胞组分的培养基，并用 10 mL PBS 轻柔洗涤两次。</li>
	<li>加入 5 mL 含 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 的 PBS，于 37 °C 孵育 5 分钟。加入 5 mL 含 10% FBS 的 α-MEM，用移液器轻柔吹打使细胞脱落。通过 40 μm 细胞筛过滤，将各组分的细胞收集至 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>用 10 mL PBS 洗涤细胞，并通过 40 μm 细胞筛过滤收集至 50 mL 圆锥形离心管中。在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，向细胞沉淀中加入含 10% FBS 的 α-MEM。将细胞浓度调整至约 1 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞通过带盖的 35 μm 尼龙滤网管过滤。此时细胞已准备好进行流式细胞分选（FACS）。</li>
	<li>本实验方案使用 100 μm 喷嘴。收集液应为含 10% FBS 的 α-MEM。分选过程中，尽可能将待分选样品保持在振荡状态并置于 4 °C 环境中。</li>
	<li>分选前，通过调节侧向散射（SSC）面积和前向散射（FSC）面积优化门控以去除杂质和非目标细胞。通过调节 SSC-宽度 vs SSC-高度以及 FSC-面积 vs FSC-宽度排除双联体。应使用 GFP 阴性的骨细胞作为对照，以调整分选仪器的参数。</li>
	<li>细胞收集完成后，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。用 PBS 洗涤细胞，再在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>重新悬浮细胞，并使用含 10% FBS 的 α-MEM 将细胞数量调整至所需浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+...+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

首个分离出的骨细胞来自鸡颅骨7，通过使用（OB7.3）或禽类PHEX变体进行分离；然而，该方法受限于可用的有效抗体，因为必须制备既特异于骨细胞又具有物种特异性的抗体。研究人员采用了一种不同的序贯酶消化法改良方案，从小鼠和大鼠的长骨中获取骨细胞；据报道，这些培养物的纯度约为70%9。Cre小鼠模型的发展使得能够对骨细胞进行基因工程改造，使其在表面表达绿色荧光蛋白（GFP）。结合FACS技术，该小鼠模型被用于获得高纯度的原代骨细胞培养物20。
我们省略了第1组分以及第6‒8组分的使用，因为在这些组分中仅有少量骨细胞被分离出来。采用第2‒5组分可在最短的处理时间内获得最佳的骨细胞得率；这缩短了骨细胞的操作时间，并有助于防止细胞在分步分离过程中因受到应激而发生死亡或细胞信号通路的潜在改变。我们还在分选前将骨细胞培养24小时，这一默认步骤可在分选制备过程中排除不贴壁的悬浮细胞（造血细胞）。这可最大程度地减少表达GFP<sup class="xref"...

骨细胞是由成骨前体细胞终末分化而来并包埋于其分泌基质中的细胞1。在骨细胞群体中，骨细胞数量最多且寿命最长。它们位于骨陷窝内，具有典型的星状形态，其树突通过称为骨小管的通道延伸，与周围环境及骨表面形成广泛的通讯和代谢交换网络2。骨细胞协调成骨细胞和破骨细胞在骨重建中的作用，是主要的机械感受细胞，介导骨骼对机械负荷的适应性反应3，参与磷酸盐稳态4和骨基质矿化过程5，并与陷窝-小管系统共同作为内分泌器官向远端组织传递信号6。
骨细胞位于矿化的基质中，这种环境限制了其可及性，使得分离过程具有挑战性，从而阻碍了体外研究。最早描述的分离方法之一是利用骨细胞特异性的单克隆抗体（OB7.3）7从鸡颅骨中分离骨细胞，该抗体后来被确认为PHEX（X染色体上与内肽酶同源的磷酸盐调节基因）的禽类变体8。其他研究人员采用连续消化大鼠9或小鼠10长骨的方法，获得富含骨细胞的组分，据报道其中骨细胞纯度约为70%9。该方法的局限性包括培养物纯度不够理想，存在除骨细胞外的其他细胞类型污染，以及由于骨细胞已丧失分裂能力，在培养过程中可能被其他增殖能力强的细胞过度生长而取代。这些挑战限制了长期培养体系的应用。
为了克服这些局限性，研究人员开发了不同的骨细胞系。其中，MLO-Y4细胞系11和MLO-A5细胞系12是目前研究最为广泛的细胞系，适用于早期骨细胞阶段的研究；然而，由于它们表达的硬化素（sclerostin）和FGF23水平较低——而这两种分子均为成熟骨细胞的标志物——因此在研究成熟骨细胞信号传导方面作用有限13。其他一些细胞系，如IDG-SW314和Ocy45415，能够高水平表达硬化素和FGF23，适用于晚期骨细胞阶段的研究。细胞系作为研究工具具有重要价值，但仍存在局限性，因其无法完全模拟原代细胞的生物学特性。不同的细胞系仅代表骨细胞成熟谱系中的不同发育阶段，且无法反映原代骨细胞的异质性16,17。
为了获得纯化的原代骨细胞培养物，研究人员利用了Cre小鼠模型，其中8-kb的dmp1启动子用于驱动骨细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达18,19。Paic等19建立的双转基因小鼠（pOB-Col 2.3-GFP-cyan和DMP1-GFP-topaz）以及Nakashima等20建立的dmp1-topaz转基因小鼠已被用于获取骨细胞群体。这些研究通过连续消化和荧光激活细胞分选（FACS）分离表达GFP的骨细胞，从而获得原代骨细胞培养物19,20。在10-kb dmp1报告小鼠Ai9中，Cre的方向可激活tdTomato蛋白，该蛋白在骨细胞、成骨细胞、肌肉以及骨髓内的细胞中均有表达。而8-kb dmp1启动子具有相似的表达模式，但仅有部分成骨细胞和骨髓细胞表达该蛋白，表明8-kb dmp1启动子具有更高的特异性21。尽管如此，使用8-kb dmp1启动子所得结果应谨慎解读，并应常规利用骨细胞与成骨细胞特异性标记物进行基因表达谱分析，以确保所获得的细胞群体具有足够高的纯度。
在造血细胞未耗竭与耗竭的骨细胞群体中均检测到破骨细胞标志物OSCAR和Dcstamp，该结果使作者得出结论：通过8-kb dmp1-topaz新生颅骨组织分馏及GFP分选所获得的细胞消化产物中存在造血细胞污染。通过收紧GFP分选门控可减轻造血细胞的污染，因为GFP阳性造血细胞的GFP荧光强度明显低于GFP阳性间充质细胞（骨细胞）22。
体外研究骨细胞的方法为近年来骨细胞生物学领域的丰富信息积累做出了贡献。然而，骨细胞的分离仍然是一项劳动密集且耗时较长的操作，细胞得率较低。目前常用的骨组织消化方法是使用胶原酶和EDTA，通常需进行至第8次分离组分23，整个过程持续数小时，对骨细胞的活力造成一定影响。已有研究报道使用第2至第5组分进行细胞分选20，并证实与成骨细胞相比，骨细胞相关基因的表达谱分析结果可验证纯化骨细胞群体分离的成功20。本文描述了获取第2至第5组分的具体流程，并对从第1至第8组分中各组分的骨细胞得率进行比较，以评估每组分中骨细胞的回收情况。此外，本文还介绍了新生dmp1-topaz小鼠颅盖骨的解剖、颅盖骨的胶原酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化处理，以及用于流式细胞分选（FACS）的细胞制备方法。

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva 软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>数据采集与分析</td></tr><tr><td>BD Falcon 管</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm 带细胞滤网帽的试管，35 &amp;mu;m 尼龙滤网。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td>034-22363</td><td>0.2% (w/v)，来源于 C. histolyticum 的粗制胶原酶混合物。</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td>用含 0.1% BSA 的溶液配制 5 mM EDTA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td></td><td></td><td>70 mM NaCl, 10 mM NaHCO, 60 mM 山梨醇, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) 葡萄糖和 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex 无菌滤器</td><td>Merck Millipore, Ireland</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&amp;mu;m</td></tr><tr><td>尼龙细胞滤网</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&amp;mu;m</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0.5% x10，用 PBS 稀释至 x1</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td></td><td>含 10% 胎牛血清、100 IU/ml 青霉素 G 和 100 &amp;mu;g/ml 链霉素</td></tr></tbody></table>

通过表达gfp的成骨细胞小鼠颅骨分离法获取原代骨细胞

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

骨细胞曾被认为只是骨骼中一种被动存在的细胞，其功能仅限于在幕后感知机械负荷；如今，骨细胞已被推至研究前沿，被证实具有多种重要功能，例如主动修饰细胞外基质，并通过包裹其自身的陷窝-小管系统形成一个内分泌器官，向远端部位传递信号。得益于一系列研究方法的发展，从原代骨细胞的分离到类骨细胞系的建立，使得体外研究骨细胞成为可能，目前人们对骨细胞的兴趣显著增加，关于其结构与功能的知识也迅速积累。然而，骨细胞生物学及其与其他分子组分相互作用的诸多方面仍有待揭示。在本实验方案中，我们详细描述了一种高效分离原代骨细胞的方法：利用表达绿色荧光蛋白的dmp1-topaz新生小鼠颅骨骨细胞，通过细胞分馏结合荧光激活细胞分选技术（FACS）获得原代骨细胞培养物。

本实验方案的目的是通过使用胶原酶降解胶原基质、EDTA螯合钙离子的分步分离方法，从dmp1-topaz新生小鼠颅骨中获取原代骨细胞培养物，随后对细胞进行FACS制备，以将骨细胞与其他细胞群体分离。
从新生小鼠颅骨中分离原代骨细胞的方法通常描述使用第1至第8组分进行分选23。为了检验该方法的效率，我们比较了从一只dmp1-topaz小鼠颅骨中获得的骨细胞产量，起始材料涵盖第1至第8组分。将第1至第8组分分别分选，以确定每个组分中骨细胞的比例和产量。分选后，我们将骨细胞在96孔板上培养24小时，以比较接种细胞的密度。结果显示，第2至第5组分中的骨细胞密度高于第1组分，而第6、7和8组分中的骨细胞密度显著下降（图1A）。
尽管在所有组分中获得的骨细胞比例在统计学上无显著差异（图1B），但骨细胞的密度存在显著差异。研究人员20</su...

本方案描述了新生dmp1-topaz小鼠颅骨的解剖，以及通过细胞消化和分级分离方法获取表达绿色荧光蛋白的骨细胞，并制备用于荧光激活细胞分选（FACS）的骨细胞。

通过表达GFP的成骨细胞小鼠颅骨分离法获取原代骨细胞

骨细胞曾被认为只是骨骼中一种被动存在的细胞，其功能仅限于在幕后感知机械负荷，如今这一观点已被……

原代骨细胞的分离是一个耗时较长的过程，常常导致细胞得率较低。本实验方案提供了高效分离大量表达GFP的原代骨细胞的方法。该方案缩短了操作时间，能够在一次实验中获得更高数量的骨细胞，同时最大限度地减少造血细胞或间充质细胞的污染。为分离表达GFP的骨细胞，将安乐死后的出生后第6至7天的转基因小鼠幼崽置于未经处理的培养皿中，使用剪刀和镊子抓住其颅底皮肤。用剪刀在提起的皮肤上做初始切口，随后沿耳前颅骨两侧进行切割。去除皮肤以暴露颅骨，从鼻梁处握住头部，沿人字缝以及顶骨边缘至组织额部切割颅骨。将颅骨从下方的脑组织分离，并将骨片凹面朝上置于 PBS 中。为获得第一部分消化液，将最多五块颅骨放入 50 毫升离心管中，加入 5 毫升新配制的浓度为 2 毫克/毫升的胶原酶溶液，在 37°C、300 转/分钟条件下孵育 20 分钟。孵育结束后，弃去第一部分消化液，并用 5 毫升 PBS 洗涤颅骨。用含有1毫克/毫升牛血清白蛋白的5毫升5毫摩尔EDTA-PBS溶液，在37摄氏度下振荡洗涤15分钟。孵育结束后，将消化液转移至50毫升锥形管中，并用5毫升PBS洗涤颅骨。然后将洗涤液转移至消化液中。为了获得第二组分，将消化液进行离心并弃去上清液。用8毫升含有10%胎牛血清（FBS）及抗生素的α最低必需培养基重悬沉淀，将细胞接种至10厘米的培养皿中。然后将第二组分的细胞放入细胞培养箱中培养。在收集并培养第三和第四组分后，将颅骨置于含有5 mM EDTA并补充有1 mg/mL牛血清白蛋白的5 mL PBS溶液中，于37°C振荡孵育15分钟。孵育结束后，按照第二、第三和第四组分的操作方法收集并培养第五组分。分选前立即收集细胞。或者，在培养24小时后，吸去培养基，每次用10毫升PBS轻柔洗涤细胞，每皿洗涤两次。第二次洗涤后，每孔用5毫升含0.5%胰蛋白酶和EDTA的PBS处理细胞。在37摄氏度下孵育5分钟后，向每块培养板中加入5毫升完全α最低必需培养基，并用移液器轻柔吹打使细胞脱离。为合并各组分中的细胞，将细胞悬液通过40微米细胞滤网过滤至一个50毫升锥形离心管中。用10毫升PBS洗涤细胞后，将其加入该离心管中。通过滤网过滤细胞，并通过离心收集细胞。待细胞沉淀后，将沉淀重悬于完全最低必需培养基中，使细胞浓度达到每毫升培养基含1×10⁷个细胞，然后将细胞通过带有35微米尼龙滤网的带盖试管进行过滤。为检测该方法的效率，将各组分分别分选并培养24小时，以确定每组分中骨细胞的百分比和得率。第2至第5组分中骨细胞的密度高于第1组分，而在第6、第7和第8组分中显著降低。尽管各组分间获得的骨细胞百分比无统计学显著性差异，但不同组分之间的骨细胞密度存在显著差异。此处展示了通过荧光激活细胞分选法从GFP阴性骨细胞中分离GFP阳性骨细胞的设门策略。分选后，可对骨细胞进行感兴趣骨细胞标志物表达的分析。在此分析中，分离得到的GFP阳性骨细胞中骨细胞标志物基因的表达水平高于分选前的第二组分（已知为富含成骨细胞的组分）。此处可以观察到，分选后在塑料培养皿上培养24小时，GFP阳性骨细胞仍保持星状形态，从胞体延伸出树突状突起。吸取消化液时需格外小心，因为颅骨组织将被分解成微小的沉淀颗粒。请务必使用小头移液器，以避免细胞损失。由于骨细胞被埋藏在骨组织中，其特性一直难以捉摸。该技术为研究骨细胞的分子相互作用及其对破骨细胞和成骨细胞的调控作用铺平了道路。

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过表达GFP的骨细胞的小鼠颅骨分割获得原代骨细胞

对骨折愈合过程中骨祖细胞功能进行定量测量，需要高分辨率的连续成像技术。本文提供了利用活体显微镜结合成骨谱系示踪技术，对内源性成骨干细胞/祖细胞在修复骨骨折过程中的迁移、增殖和分化进行连续成像与定量分析的实验方案。...

依次 体内 骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

用视黄酸处理原代小鼠成骨细胞可获得一群形态和分子特征均呈均一性的分支状骨细胞。该方法克服了在培养中获取和维持原代骨细胞的困难，且有利于研究来自转基因模型的细胞。...

应用视黄酸从小鼠原代成骨细胞获得骨细胞培养

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

破骨细胞是体内主要的骨吸收细胞。能够大量分离破骨细胞，已显著推动了对破骨细胞生物学特性的理解。在本方案中，我们描述了一种分离、培养及定量破骨细胞活性的方法 体外.

小鼠骨髓来源的破骨细胞分化

本文介绍了从小鼠长骨中分离和分化骨髓基质细胞及造血干细胞的方法。提供了两种不同的实验方案，可获得适用于扩增并分化为成骨细胞、脂肪细胞和破骨细胞的不同细胞群体。...

小鼠骨髓基质细胞与破骨细胞前体的分离、培养及分化

破骨细胞是来源于造血干细胞单核-巨噬细胞系的组织特异性多核巨噬细胞。本方案描述了如何分离骨髓细胞，以获得大量破骨细胞，同时降低传统方法中存在的事故风险。...

从大鼠骨髓中分离、纯化及诱导破骨细胞前体细胞分化

本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。...

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在CCL5诱导下的迁移

本文描述了利用双光子显微镜对活体小鼠颅骨骨髓中的巨核细胞及其血小板前体（proplatelets）进行成像的方法。...

体内 小鼠颅骨骨髓中巨核细胞与前血小板的双光子成像

本文介绍了一种活体成像方法，用于观察嵌入性骨细胞在机械刺激下诱导的钙信号传导 体内...

一种用于研究小鼠骨细胞中负荷诱导的钙信号动态变化的荧光活体成像方法

本研究概述了在骨细胞陷窝-管状网络（LCN）中可视化并构建骨细胞三维（3D）模型以进行计算流体动力学（CFD）分析的方法。通过该方法生成的模型有助于理解健康或病变骨骼中骨细胞的力学感知机制。...

骨细胞的分析与成像

活体显微镜技术可实现对组织再生和肿瘤发生等动态生物学过程的研究。颅骨骨髓是一种高度动态的组织，为研究造血作用和血管功能提供了重要线索。通过使用生物相容性3D打印头部固定植入物，可实现重复的纵向成像，从而加深我们对组织动态变化及肿瘤微环境的理解。...

颅骨骨髓血管动态的活体纵向成像

了解利用dmp1-topaz转基因小鼠模型和荧光激活细胞分选技术高效分离表达GFP的原代骨细胞的方法。该方案显著缩短操作时间并提高细胞产量，为骨细胞生物学研究提供可靠工具。

通过表达GFP的成骨细胞小鼠颅骨分离法获取原代骨细胞

探索更多视频