使用微计算断层扫描的 果蝇黑色素加斯特 全动物成像

提出了一个协议，允许使用微计算断层扫描在任何发展阶段对完整的 果蝇黑色素加斯特 进行可视化。

该协议允许对完整或软实验室微米分辨率进行无损成像。它可用于了解动物生理学、解剖学和发育的机制。由于果蝇在完整状态下成像，无需组织解剖，因此组织和器官的空间结构保持其自然状态，易于观察。

显微 CT 是研究苍蝇人类疾病或了解影响生活质量的发育缺陷的理想工具。它还被证明在其他学科中很有用，例如工程、物理学、材料科学、地质学和人类学。选择感兴趣的发育时间点进行成像后，将 5 至 20 只动物转移到 1.5 毫升微量离心管中的 1 毫升 PBST 中，并在室温下孵育管 5 分钟，定期敲击以帮助去除疏水涂层并让动物完全浸没。

孵育结束时，用 1 毫升 Bouin 溶液替换 PBST，然后轻敲试管以将果蝇完全浸没。对于幼虫和蛹样品，在室温下孵育 2 小时后，将动物洗涤 3 次，每次 5 分钟，每次洗涤 1 毫升新鲜 PBS。最后一次洗涤后，在解剖显微镜下将样品转移到每孔含有新鲜 PBS 的多孔解剖皿中，并使用连接到支架上的小细针在每个样品的前角质层和后角质层上戳一个孔，注意不要破坏下面的软组织。

穿透角质层后，将样品在新的 1.5 毫升试管中放入 1 毫升新鲜 Bouin 溶液中，在室温下孵育 24 小时，然后洗涤样品 3 次，每次 30 分钟，每次洗涤 1 毫升 1 毫升微量 CT 洗涤缓冲液。最后一次洗涤后，向试管中加入 1 毫升适当的染色液，并在室温下孵育样品 2 至 7 天。如果需要更长的图像保存时间，请如图所示，将升序乙醇系列中的样品在 1 毫升乙醇中脱水 1 小时，以准备用于临界点干燥的样品。

要封片临界点干燥的样品，请将样品放入塑料或玻璃毛细管中，然后再将试管安装到旋转载物台支架上。对于水合样品封片，将 P10 移液器吸头装满水，并用石蜡膜固定窄端。使用镊子将单个样品转移到移液器吸头上，并使用细长的物体小心地将样品向下推入吸头，直到它刚好接触吸头壁以将样品固定到位。

盖上移液器的开口端后，将 P10 移液器安装到设计用于安装在旋转载物台楔块内的支架上。扫描时，单击扫描仪软件中的 Open Door 图标以访问旋转载物台楔块，并拧紧样品架底座周围的套环以连接样品。在软件中设置扫描参数以获得最佳分辨率和对比度，然后单击选项和 X 射线源以打开 X 射线源功率控制。

使用滑块将 X 射线电压设置为 30 至 40 千伏，将电流设置为 100 至 110 微安，以产生功率为 3 至 4 瓦且光斑尺寸较小的 X 射线束。要设置扫描期间要采集的投影图像数量，请选择选项和采集模式，将相机曝光时间设置为 500 到 800 毫秒，并使用滑块根据相机设置和位置设置所需的图像像素大小。单击并拖动滑块，沿其 360 度旋转路径移动样品，使样品保持在视野内。

单击 begin acquisition 图标。将出现一个对话框，允许设置其他扫描参数。命名文件和扫描内容将保存到的输出文件夹。

将随机移动设置为 10，将平均值设置为 4 到 6 帧。旋转步长将根据使用的相机设置自动计算，然后单击 Ok 开始采集。将出现一个显示扫描时间的进度条对话框，扫描仪将开始沿旋转路径获取标本的一系列投影图像。

要生成断层照片，请在重建软件中打开投影图像，然后选择移位校正算法以执行初始图像对齐。选择正确对齐投影图像的最佳值，然后单击 Fine tuning 以微调每个重建参数。将生成一系列预览，可用于选择正确的值。

确认最佳参数值显示在 Settings 选项卡中，然后在 Output 选项卡中调整文件参数，例如位深度、文件名和将保存数据的文件夹。感兴趣区域只能用于重建感兴趣结构。如果需要多次重建，请单击 Start 和 Add to batch 将当前图像添加到批处理管理器，然后对其余图像重复重建。

对于重建图像的形态学分析，在 Segment 选项卡下，在适当的形态学分析软件程序中，单击 Basic 和 New，为图像命名新名称，然后选择适当的颜色。选中 Define range 框并调整滑块以调整包含感兴趣结构的阈值范围。要绘制由阈值定义的区域，请在按住鼠标左键的同时按住 Ctrl 键。

要删除区域，请在按住鼠标左键的同时按住 Shift 键。确保感兴趣网格区域的测量值显示在信息面板中，以进行基本形态测量分析。渲染网格对象和整个断层图图像，并以 3D 形式可视化生成的图像，然后右键单击以选择 Show Movie Maker 以使用查看器中的各个帧生成对象的视频。

在这些图像中，可以观察到胚胎、第三龄幼虫、铁酸盐成虫阶段的蛹以及用碘染色并使用商用台式扫描仪在水中成像的成年雌性苍蝇。脆弱组织的出色保存和均匀染色是显而易见的，因此可以很容易地识别所有主要器官。在这里，显示了在慢速和快速投影扫描模式下获得的相同成年苍蝇头套的比较。

重要的是，尽管慢速图像的分辨率更高，但慢速和快速扫描之间的形态测量分析没有差异。使用渲染软件，可以分割任何感兴趣的组织或器官系统，并将其用于形态测量分析和 3D 可视化。在这些图像中，可以观察到用磷钨酸染色并在水合时或在 X 射线显微镜上临界点干燥后成像的苍蝇腹部。

使用磷钨酸，很容易分辨中肠的单个上皮细胞和睾丸内的精子束。虽然与水合样品相比，临界点干燥图像的分辨率略有提高，但水合样品可以更好地保留脆弱组织的超微结构，例如角质层附近的脂肪细胞。为获得最佳分离度，请限制样品移动和过度振动。

为此，将样品固定在载物台上至关重要，尽管要实现这一目标可能需要创造力和足智多谋。其他成像方法（如光学和电子显微镜）可用作成像工作流程的一部分，以了解从纳米级到整个生物体的给定基因突变。