整体动物成像 黑腹果蝇 使用显微计算机断层扫描

该方案可实现对完整或柔软实验室样本的微米级分辨率无损成像。可用于研究动物生理学、解剖学和发育机制。由于果蝇在无需组织解剖的情况下以完整状态进行成像，组织和器官的空间结构得以保持在其天然状态，便于直接观察。

Micro CT 是研究在果蝇中模拟人类疾病或理解影响生活质量的发育缺陷的理想工具。它在其他学科中也已被证明具有实用价值，例如工程学、物理学、材料科学、地质学和人类学。选择好用于成像的发育时间点后，将 5 至 20 只动物转移至含有 1 毫升 PBST 的 1.5 毫升微量离心管中，在室温下孵育 5 分钟，并周期性轻敲管壁，以促进疏水涂层的去除，使动物完全浸入液体中。

孵育结束后，将 PBST 替换为 1 毫升 Bouin 溶液，并轻敲管壁以确保果蝇完全浸没。对于幼虫和蛹样本，在室温孵育 2 小时后，用新鲜 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，每次使用 1 毫升新鲜 PBS。最后一次洗涤后，将样本转移至多孔解剖培养皿中，每孔加入新鲜 PBS，并在解剖显微镜下操作；使用固定在持针器上的细小昆虫针，在每个样本的前部和后部体壁上穿刺小孔，注意避免损伤下方的软组织。

穿透角质层后，将样品置于新的1.5毫升离心管中，加入1毫升新鲜的Bouin溶液，在室温下孵育24小时，随后用1毫升微CT洗涤缓冲液洗涤样品三次，每次30分钟。最后一次洗涤后，向管中加入1毫升适当的染色溶液，并在室温下孵育样品2至7天。若需更长时间保存图像，则需将样品置于1毫升乙醇中，按递增浓度的乙醇系列进行脱水处理，每个浓度孵育1小时，具体步骤如所示，以准备进行临界点干燥。

对于临界点干燥样品的安装，应先将样品放入塑料或玻璃毛细管中，再将毛细管安装到旋转台样品 holder 上。对于水合样品的安装，用 P10 移液枪吸头吸取水，并用石蜡膜封住吸头的窄端。使用镊子将单个样品转移至移液枪吸头内，再用细长物体小心地将样品推入吸头，直至其刚好接触吸头内壁，以固定样品位置。

盖上移液枪的敞口端后，将 P10 移液枪安装到专为旋转台卡槽设计的支架上。进行扫描时，在扫描软件中点击“打开门”图标，以进入旋转台卡槽，然后拧紧样品 holder 底部的卡箍以固定样品。在软件中设置最佳分辨率和对比度的扫描参数，点击“选项”和“X 射线源”以打开 X 射线源电源控制。

使用滑动条将X射线电压设置为30至40千伏，电流设置为100至110微安，以产生功率为3至4瓦、焦点尺寸较小的X射线束。要设置扫描过程中采集的投影图像数量，请选择“选项”和“采集模式”，将相机曝光时间设为500至800毫秒，并使用滑动条根据相机设置和位置设定所需的图像像素尺寸。点击并拖动滑动条，使样品沿其360度旋转路径移动，同时确保样品保持在视野范围内。

单击开始采集图标。此时将弹出一个对话框，可设置额外的扫描参数。为文件命名，并指定扫描结果将保存到的输出文件夹。

将随机运动设为10，平均帧数设为四到六帧。旋转步长将根据所使用的相机设置自动计算，然后点击“确定”开始采集。此时将出现显示扫描时间的进度条对话框，扫描仪将开始沿旋转路径采集样品的一系列投影图像。

为生成断层图像，请在重建软件中打开投影图像，并选择偏移校正算法以进行初始图像对齐。选择能够正确对齐投影图像的最佳值，然后点击精细调节，以优化每个重建参数。系统将生成一系列预览图像，可用于选定正确的参数值。

确认最优参数值已显示在“设置”选项卡中，并在“输出”选项卡中调整文件参数，如位深度、文件名以及数据保存的文件夹。可使用感兴趣区域仅重建感兴趣的结构。如果需要进行多次重建，可单击“开始”并选择“添加到批处理”，将当前图像添加至批处理管理器，然后对剩余图像重复重建过程。

对于重建图像的形态计量分析，在“Segment”选项卡下，于合适的形态计量分析软件程序中，点击“Basic”和“New”，为图像命名，并选择适当的颜色。勾选“Define range”框，调节滑块以调整涵盖目标结构的阈值范围。若要绘制由阈值定义的区域，请在按住鼠标左键的同时按住 Control 键。

若要移除某一区域，请在按住鼠标左键的同时按住 Shift 键。确保在信息面板中显示感兴趣网格区域的测量值，以进行基础形态计量分析。渲染网格对象及整个断层图像，并在三维中可视化结果图像，然后单击右键选择“显示动画制作工具”，以从查看器中提取的单帧图像生成该对象的视频。

在这些图像中，可以观察到经碘染色并在水中使用商用台式扫描仪成像的胚胎、三龄幼虫、铁期蛹以及成年雌性果蝇。组织保存完好，染色均匀，细微结构清晰可见，所有主要器官均可轻易辨认。此处展示了同一成年果蝇头壳分别在慢速和快速投影扫描模式下获取的图像对比。

重要的是，尽管慢速扫描图像的分辨率更高，但慢速扫描与快速扫描之间的形态计量分析结果并无差异。利用重建软件，可对任何感兴趣的组织或器官系统进行分割，并用于形态计量分析和三维可视化。在这些图像中，可以观察到经磷钨酸染色的果蝇腹部，其在X射线显微镜下分别于水合状态或临界点干燥后成像。

使用磷钨酸染色，可清晰分辨中肠的单个上皮细胞以及睾丸内的精子束。虽然临界点干燥样品的图像分辨率较水合样品略有提高，但水合样品能更好地保存精细组织的超微结构，例如靠近角质层的脂肪细胞。为获得最佳分辨率，应尽量减少样品移动和额外振动。

将样品固定在载物台上对此至关重要，但可能需要发挥创造力和灵活性才能实现。可将其他成像方法（如光学显微镜和电子显微镜）纳入成像工作流程，以从纳米尺度到整个生物体水平理解特定基因突变。