单肌纤维隔离与文化从埃默里-德雷福斯肌肉萎缩的早期后纳塔尔发展穆林模型
July 1st, 2020
在这里，我们提出了一种方法，从同源突变Lamin+8-11小鼠模型，一个非常严重的模型Emery-Dreifus肌肉萎缩症（EDMD）在出生后早期发育阶段有效地获得单肌肉纤维。
存在许多将单肌与成年小鼠骨骼肌隔离的协议。我们的协议是为非常年轻的老鼠和小老鼠与非常脆弱的米奥菲布设计的。这种标准化程序可用于研究肌纤维辅助肌肉干细胞在产后发育期间或小鼠模型的疾病，使肌纤维特别容易受到机械应力。
该程序将由博士生格洛丽亚·佩戈利和博士后费德里卡·卢西尼（Federica Lucini）在实验室进行演示。对于肌肉解剖和收获，使用针固定一个后肢从安乐死，非常年轻或非常小的小鼠解剖板上，并使用锋利的钳子，以提升前脚踝高度的头骨的下肌腱。切肌腱，并使用精细剪刀切割所有围绕肌肉到肌腱在帕泰拉的水平。
将肌肉放入消化液管中，抬起外向数字耳长的下肌腱，轻轻向上拉向肌腱，将外向数字肌肉与其他肌肉分离。切割和收获肌肉。旋转腿部查看背部肌肉并抬起跟腱。
胃部肌肉会自动与其他肌肉分离。切上肌腱在背部的帕泰拉和把肌肉在消化溶液。抬起腿部的外肌腱，将钳子卷到肌腱下，轻轻地将肌腱与肌肉分开。
然后，切割收获肌肉，并收集相同的肌肉从另一条腿以相同的方式。收集所有肌肉后，将收集管放入37摄氏度的水浴中，45至50分钟，每10分钟大力反转管10次。当肌肉开始松动，肌黄素变得可见时，最后一次摇动样品，然后小心地将消化悬浮液转移到含有10毫升洗涤溶液的预加热或血清涂层的100毫米培养皿中。
要分离单个肌黄体，将盘子放在解剖显微镜下，并使用马血清涂覆的200微升移液器尖端来分离单个肌肉纤维。将可行的肌黄素转移到马血清涂层的35毫米培养皿中，含有5毫升预热洗涤溶液。收集到所有可行的米奥菲伯时，将细胞培养箱中的米奥纤维样本平衡五分钟。
如果需要更多的肌黄体，使用大孔玻璃移液器三角的剩余肌肉组织样本，直到额外的纤维被机械释放。收集到足够的 myofibers 后，将该菜放入细胞培养箱中一小时，以进行额外的平衡期。在孵育结束时，将个体肌纤维转移到含有适当培养基的新的预热马血清涂层盘中，然后将盘子返回细胞培养箱。
对于 myofibers 的免疫荧光分析，在交叉链接后，去除除足够全的上清液外的所有纤维，不要去除任何纤维，并在 PBS 中加入同一管 0.5%Triton X-100 的一毫升，进行 5 分钟的温和搅拌孵育。在孵育结束时，让纤维沉淀五分钟，然后用1.5毫升PBS替换上清液。轻轻搅拌五分钟后，让纤维再沉淀五分钟，然后用一毫升的阻解溶液替换上清液。
经过一个小时的温和搅拌后，用含有感兴趣的原抗体的新鲜阻断溶液替换阻塞溶液，在四摄氏度下用温和搅拌进行过夜孵育。第二天早上，用三个五分钟洗涤纤维在PBS的新鲜0.25%Tween 20的一毫升，用温和的搅拌和5分钟的沉积在室温洗涤。上次洗涤后，用适当的氟铬结合二次抗体标记纤维，在室温下稀释一小时，在室温下轻轻搅拌，免受光线影响，随后在PBS中加0.1%Tween中洗涤，防止光线。
最后一次洗涤后，用一毫升DAPI溶液更换上清液，在室温下用温和的搅拌进行5分钟的孵育，防止光线。在孵育结束时，清洗纤维，并使用带切尖的阻塞溶液涂覆移液器收集纤维，并小心地将纤维铺在玻璃滑梯上。将幻灯片放在解剖显微镜下，仅使用镜子反射的自然光，使用新的 200 微升移液器尖端轻轻铺开纤维并去除多余的溶液。
去除多余的溶液后，让幻灯片在黑暗中干燥 10 到 15 分钟，直到仅保留非常小的溶液量。然后，在纤维上添加适当体积的安装介质，然后小心地在组织上放置盖滑。为了检索足够数量的长，可行的纤维，可以生存96小时的生长因子丰富的介质，四种不同的肌肉通常收获和消化。
只有最完整的纤维才能转移到培养介质上。应丢弃破损的纤维和其他碎屑。经过72小时的培养，激活的卫星细胞产生与灭活纤维绑定的细胞聚合。
我们观察到，细胞培养来自拉明三角洲8个11双负性小鼠是由少数细胞形成的。96小时后，卫星细胞表达 MyoG，在细胞群中可见，开始分化新 myofibers。值得注意的是，与野生型小鼠相比，在同源突变拉明敲击小鼠中观察到卫星细胞分化的延迟动力学。
一定要练习肌肉解剖步骤，因为快速和精确的肌肉收获是实验成功的关键。该技术允许在激活和分化期间跟踪单个卫星细胞，促进研究不同生理和病理条件下肌肉生长和再生的关键过程。
概述
本文介绍了一种从年轻的纯合子突变体 Lamin Δ8-11 小鼠中分离单一肌纤维的方法，该小鼠是Emery-Dreifuss 肌营养不良症（EDMD）的模型。该协议旨在适应非常年轻的小鼠中肌纤维的脆弱性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肌肉生物学
- 发育生物学
背景
- 分离单一肌纤维对于研究肌肉发育至关重要。
- 现有协议主要集中在成年小鼠。
- 年轻小鼠由于肌纤维脆弱而呈现独特的挑战。
- 在疾病模型中了解肌纤维的行为至关重要。
研究目的
- 开发一种从年轻小鼠中分离肌纤维的标准程序。
- 促进出生后发育过程中肌肉干细胞的研究。
- 调查肌营养不良模型中的肌纤维反应。
使用的方法
- 从年轻小鼠中解剖后肢肌肉。
- 使用消化液分离肌纤维。
- 在解剖显微镜下分离可行的肌纤维。
- 免疫荧光分析用于研究肌纤维特性。
主要结果
- 成功从年轻小鼠中分离单一肌纤维。
- 观察到突变小鼠中卫星细胞分化延迟。
- 肌纤维对机械应力表现出独特的反应。
- 该协议允许进一步研究肌肉再生。
结论
- 开发的方法对于研究年轻小鼠中的肌纤维是有效的。
- 获得的见解可以增强对肌营养不良的理解。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上开发治疗方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation and culture of single myofibers from early post-natal murine models of Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) enables direct interrogation of muscle stem cell function within a physiologically relevant niche. This approach supports mechanistic de-risking and target validation for regenerative strategies in muscle disease portfolios. The method provides a standardized platform for evaluating satellite cell behavior and regenerative capacity under disease-relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of satellite cell activation, proliferation, and differentiation in disease models.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the impact of genetic mutations on muscle regeneration.
- Facilitates target validation by allowing direct observation of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Provides a physiologically relevant ex vivo system for assay development focused on muscle stem cell biology.
- Enables reproducible preparation of viable myofibers and associated satellite cells for downstream screening.
- Supports quantitative analysis of cell fate decisions and regenerative outcomes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in muscular dystrophy research.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation of regenerative interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive data on muscle repair capacity.
Pipeline & Workflow Integration
This single myofiber isolation and culture protocol integrates into the early discovery and preclinical validation continuum for muscle disease research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on satellite cell dysfunction and regenerative failure in EDMD models.
- Screening: Provides standardized, reproducible myofiber preparations for evaluating candidate interventions.
- Analytics: Enables quantitative measurement of satellite cell activation, proliferation, and differentiation.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by maintaining disease-relevant cellular context.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for comparative studies across genetic backgrounds and therapeutic candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of muscle regeneration.
- Operational Value: Standardizes isolation and culture of fragile myofibers, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for regenerative medicine programs targeting muscle diseases.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on functional regenerative outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in precise muscle dissection and handling of fragile post-natal tissues.
- Demands access to specialized dissection tools, cell culture infrastructure, and imaging capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of isolation and culture protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different murine models or developmental stages.
- Limited by the viability and yield of intact myofibers from very young or diseased animals.
