激光捕获显微切割结合RNA测序用于植物时空特异性组织基因表达分析

本方案采用激光显微切割技术结合RNA测序，利用少量生物材料从目标植物的特定细胞中获取空间和时间特异性的转录组信息。激光技术的主要优势在于能够直接可视化正常组织环境中的细胞，从而以无接触的方式精确分离特定细胞。尽管本方案已针对植物细胞的分离进行了优化，但其同样适用于大多数可通过组织学鉴定的细胞类型。

良好的样品制备至关重要。因此，初次进行该技术操作时，在激光显微切割之前，优化组织固定和包埋步骤非常重要。在采集组织样品前，应根据待获取的物种和组织类型，配制适当的固定液。

对于大麦种子，先将种子样品切成两半，然后将其浸入至少10倍体积的冰冻固定液中。采用真空渗透以加速固定液的渗透。组织应在渗透结束时沉降，随后更换新鲜固定液，于4℃孵育过夜，并将样品转移至组织处理盒中进行后续组织处理。

将载有组织的包埋盒放入自动组织处理机的金属篮中，并将金属篮固定在第一腔室上方的支架上。在组织处理机的控制面板上设置程序，然后按下启动键以开始自动处理程序。系统将通过将包埋盒浸入梯度乙醇中对样本进行脱水处理，每个浓度处理时间为90分钟，具体如指示所示。

最后一次乙醇浸入后，系统将样品浸入二甲苯梯度溶液中，每种溶液浸泡90分钟，具体如指示所示。随后在55至60摄氏度的熔融石蜡中浸泡290分钟。次日早晨，从组织处理机中取出已浸透石蜡的包埋盒，并进行石蜡包埋。

第二天早晨，用精细镊子将处理好的样品转移至合适大小的模具中，并在每个样品上加入熔化的石蜡。对于大麦种子，应将样品在石蜡中沿切割方向纵向摆放，以利于获得纵切面。将一个洁净的包埋盒置于模具上，确保包埋盒完全被足量的石蜡覆盖，以牢固固定样品与包埋盒。

然后将模具置于冷板上 10 至 20 分钟，直至石蜡完全凝固，再将蜡块从模具中取出。制备 PEN 膜载玻片时，先将载玻片浸入 RNS 去活化溶液中 3 秒，随后用经 DEPC 处理的水快速洗涤两次。接着将载玻片放入 370 摄氏度的培养箱中烘干，以去除残留液体，并在超净工作台中进行 30 分钟紫外照射处理，以增强其对石蜡的粘附性。

进行组织切片时，将石蜡包埋块置于冷台上，并向水浴中加入经DEPC处理的水，然后加热至42摄氏度。修块至目标区域深度，将石蜡包埋块切成6至10微米厚度的切片。切片良好的包埋块会在刀片边缘形成连续的切片带。

使用精细的镊子将切片条带从切片机轻轻转移至水浴中，注意使条带平展地漂浮在水面上。收集切片时，将载玻片以45度角持握，向上提起动作将条带从水中转移到载玻片上，并用无绒纸巾小心吸去多余的水分。当所有切片收集完毕后，用二甲苯清洗载玻片，每次320秒，随后用100%乙醇清洗230秒，再用70%乙醇清洗230秒。

为了从脱蜡并干燥的组织切片中显微切割目标细胞，将载玻片放入激光捕获显微切割（LCM）显微镜的三个插槽中，并将收集管放入相应的插槽内。移动载物台以定位需要切割的样本区域，并在膜片上切割一段无组织的空白区域。为优化切割速度以及激光压力弹射的能量和聚焦效果。

使用绘图工具勾画出组织中感兴趣区域，并利用优化参数和 Robo LPC 功能将细胞弹射至粘附帽中。从元素列表中选择标记，使用标记工具标注感兴趣区域。点击帽检查按钮以检查粘附帽，确认样本已被捕获。

通常每个子实体需要10到15个切片用于RNA提取。在获取所有样本后，应立即进行RNA提取，以避免RNA降解。在RNA提取和RNA扩增后，根据制造商的说明使用自动电泳系统对反义RNA进行定量和质量评估。

本研究中，采用激光显微切割（LCM）结合RNA测序技术，对萌发过程中48小时时间范围内每8小时取样的胚胎三个器官中的少量细胞进行了分析。正确调整切割参数至关重要，以确保目标组织能够被精确切割并从周围组织中分离，同时避免烧灼所选区域的边缘。在RNA扩增前对总RNA进行完整性检测，可在高质量RNA样本中观察到18S和28S核糖体亚基清晰的电泳条带及荧光峰。

成功合成的反义RNA在经过两轮扩增后，应呈现单峰对称的大小分布，片段长度范围为100至1000个核苷酸，峰值集中在约300个核苷酸处。对种子萌发48小时内不同组织中基因表达的多维尺度作图显示，同一组织的不同样本之间的相似性高于同一时间点但不同组织样本之间的相似性。相对于各组织的零小时时间点，每种组织中差异表达基因的数量在萌发过程中逐步增加。

在此代表性分析中，发现分别有25%的胚芽、34%的胚根和41%的盾片差异表达基因在各自组织中特异性表达。正确调整切割参数至关重要，以实现对目标区域的精确切割和分离，同时避免灼伤所选区域的边缘。随着染色质和蛋白质纯化方法的改进以及质谱仪性能的提升，激光显微切割（LCM）可被用于细胞类型特异性的表观基因组学和蛋白质组学研究。