Name: 在蝾螈肢体再生过程中通过全皮瓣手术抑制伤口表皮的形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: 了解蝾螈肢体再生中通过全皮瓣手术抑制伤口表皮形成的方法。该技术使用Ambystoma mexicanum模型，可结合分子与功能分析，为研究再生机制提供可靠工具。

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作者感谢Doug的持续鼓励和坚定支持，同时感谢Melton实验室成员对稿件提供的有益反馈和意见。作者还感谢哈佛大学动物资源办公室（OAR）在动物护理方面的辛勤工作。

所有动物实验均按照哈佛大学的IACUC（方案编号：11-32）和AAALAC指南进行。
1. 麻醉与恢复用溶液的配制及准备工作
<ol>
	<li>准备新鲜的0.1%三卡因溶液用于麻醉，以及0.5%磺胺嘧啶钠盐溶液用于术后恢复。根据相关研究机构批准的IACUC方案，使用适合墨西哥钝口螈饲养的水（例如改良的霍尔特弗雷特溶液）配制溶液37。确保溶液充分混匀，并配制足够体积以完全浸没整只墨西哥钝口螈。
	<ol>
		<li>配制0.1%三卡因溶液时，将1 g三卡因和1 g碳酸氢钠溶于1 L水中。可根据此配方按比例放大配制。</li>
		<li>配制0.5%磺胺嘧啶钠盐溶液时，将5 g磺胺嘧啶钠盐溶于1 L水中。可根据此配方按比例放大配制。磺胺嘧啶溶液是一种抗生素，可在手术恢复期间预防细菌感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Clidox-S或70%乙醇喷洒消毒手术区域。通过高压灭菌对手术器械（镊子、解剖剪、弹簧剪）进行灭菌。若需进行多次手术，每次更换实验动物之间须使用热珠灭菌器对手术器械进行灭菌。</li>
	<li>设置恢复区域时，将一个直径15 cm的培养皿或任何可容纳墨西哥钝口螈的容器置于装有湿冰的桶上。在培养皿中加入少量0.5%磺胺嘧啶钠盐溶液，液面高度以不完全浸没墨西哥钝口螈为宜。术后将动物置于冰上恢复可减缓其苏醒期间的活动，使缝合部位得以相对不受干扰地愈合。 
	注：研究人员可根据可用材料对此设置进行适当调整。</li>
</ol>
2. 实施完整的皮瓣手术操作
<ol>
	<li>将墨西哥钝口螈浸入含有0.1% 三卡因溶液的容器中进行麻醉，过程大约需要15–20分钟。通过轻捏尾部确认墨西哥钝口螈是否完全麻醉；若无反应，则可开始手术。 
	注意：本手术应选用较年长、体型较大的墨西哥钝口螈（体长至少15 cm）。在整个手术过程中，需使用塑料移液器定期以墨西哥钝口螈饲养系统用水润湿皮肤，确保其皮肤保持充分湿润。术前须用无菌PBS冲洗手术区域，以无菌方式准备手术部位。手术过程中应将动物置于无菌手术单上。</li>
	<li>使用解剖剪在中段骨骼（zeugopodial skeletal elements）远端进行肢体截肢（图1.1）。</li>
	<li>使用弹簧剪在皮肤腹侧部分做一个小切口（约2 mm）（图1.2）。</li>
	<li>使用镊子小心地将皮肤向中线方向剥离，范围约至中段骨骼结构的中线位置，以暴露其下方的肢体组织（肌肉、骨骼等）（图1.3）。注意避免损伤皮肤。参见步骤2.8后的说明。</li>
	<li>使用手术剪在中段骨骼的中线位置截除已暴露的深层肢体组织（图1.4）。</li>
	<li>用手术剪将肌肉组织向后推，并修剪暴露的骨骼。 
	注意：此步骤至关重要，有助于促进愈合，并提高手术成功率；若骨骼突出，可能在缝合皮瓣后对缝合处造成摩擦，破坏完整皮肤皮瓣的结构完整性。</li>
	<li>使用镊子小心地将多余的全层皮肤拉过截肢平面，覆盖暴露的深层组织，并通过与腹侧全层皮肤缝合固定（图1.5）。</li>
	<li>将皮瓣剩余的右侧和左侧边缘与下方完整的腹侧皮肤进行缝合。可采用“交叉”方式缝合皮瓣两侧（推荐）（图1.6-1.9），或直接将皮瓣边缘垂直缝合至腹侧皮肤。缝合时使用镊子和弯头弹簧剪。确保无任何深层组织暴露，且缝线结扎牢固（至少打结三次）。 
	注意：在步骤2.4、2.7–2.8中，必须避免损伤完整皮肤。我们发现，全层皮肤的损伤与手术失败相关，因为受损区域仍可能形成小型伤口表皮。如有可能，在操作全层皮肤皮瓣时建议使用较钝的镊子。</li>
	<li>在对侧肢体进行截肢（可选作动物自身对照），使用手术剪在中段中轴骨水平处进行截肢，并用手术剪将肌肉组织向后推，修剪暴露的骨骼。 
	注意：可在同一动物中设置对侧肢体作为内部对照，以便在步骤4中更准确地评估手术效果。但也可使用另一只动物的同侧肢体截肢作为对照。</li>
</ol>
3. 术后恢复与护理
<ol>
	<li>手术完成后，在容器或培养皿底部放置一张Kimwipe纸或无菌纸巾并将其润湿。将动物放入盛有湿冰的容器中，并用Kimwipe纸或纸巾的湿润末端轻轻包裹动物顶部，以确保其充分接触磺胺嘧啶溶液，保持湿润。将动物置于湿冰上30分钟至1小时，以确保其在麻醉恢复期间活动最少。</li>
	<li>将动物转移至静水饲养容器中，加入0.5%磺胺嘧啶溶液。墨西哥钝口螈必须在此溶液中饲养至少24小时，以预防感染。</li>
	<li>将墨西哥钝口螈转移至常规系统水中，并每日监测其健康状况。确保每日检查缝线未脱落，因为缝线脱落可能导致形成小伤口表皮，从而干扰实验结果。 
	注意：确保饲养容器为墨西哥钝口螈提供足够的活动空间，并尽量减少缝合肢体与容器壁接触的可能性。这有助于保证缝线保持原位，尤其是在术后第一周内。</li>
</ol>
4. 在体视显微镜下评估手术成功率
注意：我们建议每周至少在体视显微镜下检查动物一次，以评估全层皮瓣的完整性及手术成功率。
<ol>
	<li>按照步骤2.1，将墨西哥钝口螈置于0.1%三卡因中进行麻醉。确保容器中有足够的空间，以便墨西哥钝口螈能够自由活动。</li>
	<li>若在手术后前两周内进行检查，应使用体视显微镜观察缝合的肢体，确认缝线未脱落，且无任何部位出现透明的薄层伤口表皮。若在术后第三周或更晚时间检查，需确认未形成芽基，并与正常对照截肢肢体（来自同一动物或不同动物）在再生过程中的进展情况进行比较（例如，是否已形成芽基）。</li>
	<li>检查完毕后，将墨西哥钝口螈放回正常的系统水体和饲养条件下。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在墨西哥钝口螈肢体上进行全层皮瓣手术以抑制伤口表皮形成的实验方案。尽管与其他抑制伤口表皮形成的方法相比，该手术相对简单且技术上可重复，但仍有一些关键步骤会影响手术的成功率。首先，在将完整的全层皮瓣拉伸覆盖于暴露的深层组织时，必须确保皮瓣的全层皮肤未受到任何损伤。皮瓣的损伤仍可能导致小范围伤口表皮的形成，进而引发类似芽基的小型出芽样生长。其次，需确保术后护理期间缝线不脱落，因为缝线脱落同样可能诱发小范围伤口表皮的形成。为此，在术后尤其是术后第一周内，应尽量减少缝合肢体与任何表面的接触。为防止此类情况发生，可采取多种措施，例如将墨西哥钝口螈饲养并麻醉于足够大的容器中，以确保其在术后有足够的活动空间。
该手术也存在若干局限性。其中最显著的是，手术成功与否仅能通过两种方式评估：在手术后的前两周内使用解剖显微镜检查是否存在伤口表皮缺失和/或在三周内观察芽基是否形成。尽管这些方法有效，但通量相对较低。未来若能开发出针对伤口表皮特异性标记物的转基因报告轴突蝾螈，将有助于更快地区分手术成功与失败的个体。此外，该手术在较年轻的动物上操作难度更大，因为其完整皮肤更为脆弱。因此建议使用亚成体或成体轴突蝾螈进行操作。
虽然该手术最初是在N. viridiscens19中开发的，但已可轻松适用于墨西哥钝口螈25,39，并可能也适用于其他蝾螈物种。总之，将该技术应用于未来的肢体再生研究，将有助于研究人员开发更多工具以深入探究伤口表皮的生物学特性，并揭示其在启动芽基形成过程中的潜在作用机制。

自1768年拉扎罗·斯帕兰扎尼（Lazzaro Spallanzani）首次报道以来1，蝾螈肢体再生一直是生物学界长期着迷且研究最为深入的自然再生现象之一。成功的肢体再生依赖于一种未分化的细胞结构——胚基（blastema）的形成、外生生长以及后续的模式构建。研究人员在解析胚基的细胞组成，以及明确哪些支持性组织和细胞类型对其形成至关重要方面已取得显著进展2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。然而，不同组织与细胞类型之间协调作用、从而启动胚基形成的信号机制，目前仍知之甚少。
成功形成芽基并实现再生的一个关键条件是伤口表皮，这是一种短暂且特化的上皮组织，可在截肢后12小时内覆盖截肢平面10。截肢后，来自损伤部位近端完整皮肤的上皮细胞迅速迁移至截肢平面，形成一层薄的伤口上皮14。随着接下来几周内芽基的形成，早期的伤口表皮逐渐发育为更厚的上皮信号结构，称为顶端上皮帽（apical epithelial cap, AEC）15。正常的全层皮肤由上皮层和真皮层组成，两者之间由基底膜分隔；而伤口表皮/AEC仅包含上皮层，缺乏基底膜16,17。由于缺少基底膜和真皮层，伤口上皮细胞能够与下方组织直接接触，从而促进这两个区室之间的双向信号交流，这种信号交流对于芽基的形成和维持至关重要17,18。
经典的实验研究设计了多种创新的外科方法，通过抑制伤口表皮/活化表皮帽（AEC）的形成来探究其功能和必要性。这些方法包括在截肢平面缝合19或移植全层皮肤20,21，立即将截肢的肢体缝合进体腔22，以及连续每日清除或照射早期伤口表皮和AEC23,24。总体而言，这些实验不仅确立了伤口表皮/AEC的重要性，还进一步明确了其在早期组织溶解以及在整个再生过程中维持前体细胞增殖和芽基外生中的作用13。
然而，以往的这些研究在很大程度上局限于组织学染色以及使用氚标记的胸苷脉冲来追踪细胞增殖。事实上，直到最近才开始利用现代测序技术和功能学方法重新研究这些经典实验，从而在蝾螈中发现了伤口表皮在调控炎症反应以及再生早期阶段细胞外基质（ECM）的降解与沉积方面所发挥的额外作用25。随着多种蝾螈基因组和转录组序列的发布26,27,28,29,30,31,32,33,34，以及适用于蝾螈物种的功能学研究方法日益增多11,35,36,37,38，研究人员目前已处于有利位置，可逐步揭示驱动伤口表皮形成、功能发挥以及表皮帽（AEC）发育的分子机制。
遗憾的是，这些用于抑制伤口表皮形成的经典方法中，有多种在技术上具有挑战性，导致同一实验中不同生物学重复之间的可重复性较差。例如，维持皮肤移植物较为困难，因为移植物最终可能从宿主肢体上脱落，而且每天去除伤口表皮或顶端上皮帽（AEC）的操作在不损伤深层组织的情况下难以实现。此外，将截肢残端缝合至体腔内操作复杂，且在插入部位会造成额外的组织损伤。相比之下，将全层皮肤直接缝合覆盖于截肢平面则相对简单，技术上易于重复，且造成的组织损伤最小。这种全层皮瓣（FSF）外科手术方法最早由Anthony Mescher于1976年在成年蝾螈（Notophthalmus viridiscens）中建立。他证明，FSF手术通过阻止上皮细胞向截肢平面迁移以及阻断上皮细胞与下方组织的直接接触，从而抑制了伤口表皮的形成与功能。
本文以墨西哥钝口螈肢体为例，逐步展示该手术操作流程。结合现代分子生物学与测序技术，该方法可为研究人员深入理解肢体再生过程中伤口表皮/顶端上皮帽（AEC）的形成及其功能提供重要帮助。

<table><tbody><tr><td>弯头弹簧剪</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>需两把</td></tr><tr><td>尼龙单丝缝合线（9-0）</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>磺胺二甲嘧啶钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

通过全皮瓣手术抑制美西螈肢体再生过程中伤口表皮的形成

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

在过去一个世纪中，关于蝾螈再生生物学的经典实验早已证实，伤口表皮是一种关键的信号传导结构，可在截肢后迅速形成，并为肢体再生所必需。然而，在过去几十年中，由于蝾螈模型系统中缺乏精确的功能研究技术以及基因组信息，人们在分子水平上深入研究其确切功能的能力一直受限。令人振奋的是，近年来测序技术的迅猛发展，多种蝾螈基因组的发布，以及包括CRISPR在内的功能遗传学检测方法的出现，使得以前所未有的分子分辨率重新审视这些基础性实验成为可能。本文中，我将介绍如何在成年墨西哥钝口螈中实施经典的全层皮瓣（FSF）手术，以在截肢后立即抑制伤口表皮的形成。正常情况下，伤口表皮通过截肢平面附近皮肤上皮细胞向远端迁移而形成，从而将伤口与外界环境隔离。该手术操作包括立即用包含表皮层和真皮层的全层皮肤覆盖截肢平面，以阻碍上皮细胞的迁移及其与下方受损间充质组织的接触。成功的手术可导致芽基形成及肢体再生被抑制。将该手术方法与现代下游分子和功能分析技术相结合，研究人员有望逐步揭示伤口表皮在肢体再生过程中的分子机制与生物学功能。

本手术方案将完全抑制伤口表皮的形成（图1），从而最终阻止肢体再生。成功的手术结果表现为大约2-3周内不形成芽基，具体时间取决于动物的大小；而作为对照的正常再生肢体应能正常形成芽基。
研究人员应每隔2-3天用肉眼检查缝合的肢体，以确保缝线未脱落且未形成芽基。如果有一根或多根缝线脱落，仍可能形成伤口表皮，导致出现小或大的芽基，从而使手术失败（图2）。此外，研究人员应每周至少在体视显微镜下检查一次缝合肢体，以确保截肢表面任何位置均未出现薄层伤口表皮。作为对照，研究人员还应观察对照组中正在再生的肢体，其截肢平面应覆盖有伤口表皮，并在2-3周内形成芽基。伤口表皮外观呈薄而透明状，而正常皮肤在白化、白子或野生型墨西哥钝口螈中则分别呈现更不透明且淡粉红色（几乎白色）、浅黄色或深绿色。
如果研究人员希望在2-3周的芽基形成阶段之前采集组织，应在取样前检查缝合后的肢体，以确保缝线仍处于原位，并且未形成小的伤口表皮。此外，在任意时间点对缝合肢体组织进行矢状切面切片并进行组织学分析，也可以验证完整皮瓣环绕整个截肢平面的真皮存在，以及伤口表皮的缺失（图3）。
<img alt="外科皮瓣手术示意图，皮肤皮瓣制备与缝合过程的分步指南" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：完整皮肤皮瓣手术各步骤示意图。 
本图展示了该实验方案的各个步骤及其示意图。虚线表示在方案第1步和第3步中的截除平面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="再生结果示意图；手术对比，测量标尺；可见3.3 mm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：全皮瓣手术成功与失败的示例。 
截肢后25天（dpa）时，经历成功手术（左）、失败手术（右）以及未手术对照组正在再生的肢体的代表性明场图像。成功手术的截肢平面平整，全皮瓣已缝合覆盖；而失败手术则出现小型芽基结构。箭头标示截肢平面，白色虚线用于辅助判断：在成功手术中无芽基形成，而在失败手术及对照组再生肢体中可见芽基存在。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="伤口愈合组织学、表皮组织、染色切片、细胞结构比较示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：正常再生与FSF缝合肢体的组织学染色。 
（A-B’）再生（A-A’）和缝合的墨西哥钝口螈肢体（B-B’）在截肢后7天（7 dpa）的苦味酸-亮绿（picro-mallory）染色切片代表性明场图像。A和B中的插图分别在A’和B’中展示。在缝合肢体中，富含胶原蛋白的真皮层沿并覆盖整个截肢平面。截肢平面在A-B中以箭头标示。比例尺为500 µm。本图改编自Tsai等25。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种外科手术方法，通过在截肢平面立即缝合全层皮肤，以抑制墨西哥钝口螈肢体再生过程中伤口表皮的形成。该方法可使研究人员探究伤口表皮在肢体再生早期阶段的功能作用。

过去一个世纪中，关于蝾螈再生生物学的经典实验早已证实，伤口表皮是关键的信号...

墨西哥钝口螈肢体再生需要一种特化的伤口表皮。该手术可抑制伤口表皮的形成，并可与分子和功能技术相结合，用于研究肢体再生。本方案的主要优势在于其高效且技术上可重复性强。这种手术方法为研究人员提供了一种工具，用于探究伤口表皮的功能，并加深我们对这一结构为何在再生过程中至关重要的理解。在确认墨西哥钝口螈已完全麻醉后，使用解剖剪在其中段骨骼结构的远端进行肢体截除。随后，使用弹簧剪在皮肤腹侧部分做一个小切口。使用镊子小心地将皮肤从肢骨中段位置向中线方向剥离，暴露下方的肢体组织，同时确保不损伤皮肤。如果可能，在处理全层皮肤瓣时应使用较钝的镊子，以防止损伤。用手术剪在前肢中段位置切断已暴露的下方肢体组织，然后用手术剪将肌肉组织向后推开，并修剪暴露的骨骼。仔细将多余的全层皮肤拉过截肢平面，以覆盖暴露的深层组织，并确保皮瓣保持其结构完整性。将皮瓣缝合至腹侧的全层皮肤。使用镊子和弯头弹簧剪刀，以交叉方式将皮瓣剩余的右侧和左侧部分缝合至下方完整的腹侧皮肤组织。操作完成后，应确保无任何暴露的深层组织可见，且缝线已扎紧并至少打结三次。作为可选的内部对照，使用手术剪在对侧肢体中段中足水平进行截肢，然后用手术剪将肌肉组织向后推开，并修剪暴露的骨骼。将精细操作擦拭纸置于装有冰上磺胺嘧啶溶液的容器底部。然后，将墨西哥钝口螈放入容器中，并轻轻将擦拭布裸露的两端包裹在动物顶部，以保持其充分湿润。将其置于冰上 30 分钟至 1 小时，以确保在从麻醉中恢复期间活动最少。随后将其放入含有 0.5% 磺胺间二甲氧嘧啶溶液的静置饲养容器中。手术后前 24 小时内，墨西哥钝口螈必须一直置于该溶液中，以防止感染。该手术方案可完全抑制伤口表皮的形成，从而最终阻止肢体再生。术后需每天检查缝合的肢体。如果有一根或多根缝线脱落，则可能形成伤口表皮，导致出现小或大的芽基，从而使手术失败。在任意时间点对缝合后的肢体组织进行矢状切面切片并进行组织学分析，也可以验证全层皮瓣的真皮层是否存在，并环绕整个截肢平面，且无伤口表皮覆盖。在实施该操作时，重要的是确保皮瓣保持其结构完整性，并完全覆盖截肢平面。将缝线打结牢固，并确保皮瓣固定稳妥，对于本实验方案的成功也至关重要。该方法可与下游分析技术联用，包括RNA测序或功能性技术（如外源性基因过表达），以鉴定伤口表皮功能及肢体再生中的新型分子调控因子。

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科研

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在蝾螈肢体再生过程中通过全皮瓣手术抑制伤口表皮的形成

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通过全皮瓣手术抑制美西螈肢体再生过程中伤口表皮的形成

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