Name: 通过集成活细胞监测，自动生产人类诱导多能干细胞衍生皮质神经元和多巴胺神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解自动化培养与分化人诱导多能干细胞为皮质神经元和多巴胺神经元的方法。该系统实现标准化流程，减少实验变异并确保高表型重现性，适用于神经科学研究与药物开发。

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作者衷心感谢为本研究提供生物材料的患者及其家属。本研究使用的细胞系来自罗格斯大学的NINDS收藏库（ND41865，即iPS#1）以及Tilo Kunath博士的实验室（iPS#2）。本工作部分得到了NOMIS基金会（PH）、RiMod-FTD（欧盟神经退行性疾病研究联合计划，JPND）（PH）、德国神经退行性疾病中心I2A计划（AD）、PD-Strat项目（由ERA-Net ERACoSysMed资助）（PH）以及帕金森病基础数据倡议项目（FOUNDIN-PD）（PH, EB）的支持。FOUNDIN-PD是迈克尔·J·福克斯基金会PATH to PD计划的一部分。作者感谢Steven Finkbeiner和Melanie Cobb（格拉德斯通研究所）在建立手动mDA神经元分化方案方面的贡献，以及Mahomi Suzuki（横河电机株式会社）在神经突生长分析设置中提供的协助。

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我们没有需要披露的内容。

我们推出一种集成了成像功能的自动化细胞培养系统，用于标准化人诱导多能干细胞（hiPSC）的培养与神经元分化。由于人为干预极少，实验变异程度低，可确保细胞在分化过程中细胞表型的高度可重复性。基于日程的日程调度器支持实验的组织与并行操作，允许在灵活的时间点开展实验。现有方法可轻松适配，且可不断扩展可用方法的范围。此外，系统兼容多种规格的检测板格式，进一步增强了灵活性。最小化系统由CO2培养箱、机械臂、明场细胞计数仪和液体处理工作站组成，构成进行hiPSC培养与分化所需的基本单元，其成本可被学术研究实验室所接受。将自动化细胞培养系统与用于储存化合物、RNAi文库或CRISPR/Cas9文库的自动化-20 °C存储系统相结合，并集成高内涵/高通量显微镜，可&#160;实现表型筛选的自动化执行。
在本研究中，自动细胞培养系统使用一次性吸头，培养基需手动补充至储液槽中，因此限制了液体处理工作站用于换液及其他培养操作（尤其是过夜操作）的应用。为克服这一限制，可将方法调整为使用金属针头替代一次性吸头，并在安装连接培养基管路与存放在冰箱中的培养基袋之间的管路后，通过加热元件预热新鲜培养基，实现储液槽的自动补充。这将减少因手动更换吸头、补充培养基及交换储液槽所引起的人为干扰。
我们的自动化细胞培养系统具有多项优势。其一是条形码追踪系统。系统中加载的培养板通过唯一的条形码进行识别，该条形码由系统读取并保存，从而可在方法执行期间及之后追踪样本。另一优势是可创建用户特定的项目。在此，可将系统中加载的培养板分配至特定项目，并按批次分组。按批次进行组织可简化对同一批次中所有培养板执行相同操作的过程，因为无需单独选择每个培养板。此外，液体类型编辑器允许针对每次液体转移步骤调整移液速度和高度，以及吸液和分液参数。每个操作过程均记录在日志文件中，以便追溯针对特定培养板或检测板执行了哪些任务。
由人类诱导性多能干细胞（hiPSC）分化而来的神经元及其他细胞类型，是在体外研究特定患者群体中神经退行性疾病机制的有用工具（例如，帕金森病研究中的多巴胺能神经元），并为个性化药物筛选提供了可能。hiPSC的培养非常耗时，需要经过培训的专业人员执行复杂的分化方案，通常仅限于小规模生产。我们将无饲养层的hiPSC培养体系适配至自动化培养系统，并实现了两种神经元分化方案：一种是基于四环素诱导启动子（tet-on）驱动Neurogenin-2（NGN2）过表达的快速皮层神经元分化方案10,11，另一种是基于小分子的长期分化方案，用于生成中脑多巴胺能（mDA）神经元13。手动培养与分化方案在自动化系统中的直接转移与可重复性，使该自动化培养系统极具应用价值。在自动化细胞培养系统中培养的人hiPSC表现出稳定的干细胞形态，并一致表达关键的多能性标志物，且在不同独立实验间具有可重复性。此外，hiPSC培养方案的自动化有利于并行培养和扩增更多数量的细胞系。系统可安排在夜间自动进行汇合度检测，节省了时间，使白天的系统资源可用于用户在实验室期间执行的下游操作步骤（例如，细胞收获或手动重铺用于分化）。当细胞达到用户设定的汇合度阈值时，系统将自动传代并将细胞重铺至自动化细胞培养系统堆栈器中的细胞外基质包被板中。每次传代过程约需70分钟，由一个母板生成四个单孔板，相当于每天可完成20次传代操作。
NGN2 分化方案的自动化已成功实现，能够在不同传代过程中生成均一的神经元细胞群体，其效果与手动分化相当。此外，由于分化速度加快，涉及多个细胞系的大规模筛选研究或包含数千种测试条件/化合物的筛选实验的成本将得以降低。包括活细胞神经突生长测量在内的经济高效且高通量的检测方法可被轻松开发、实施并用作疾病建模的表型读出指标，此前已有研究展示过此类应用14,15,16。因此，我们进一步优化了 NGN2 协议，采用稳定过表达 GFP 的小分子诱导神经前体细胞（smNPC）。smNPC 细胞具有更多优势，包括培养基成本更低（仅为 iPSC 培养成本的三分之一）以及实验扩增所需时间更短。smNPC 的细胞产量比 iPSC 高出 7 至 10 倍。通过完全自动化的成像流程，成功对正在分化的神经元进行了连续数天的监测和成像，无需手动抗体染色或化学标记，从而节省了手动操作（包括成像本身）所需的时间和成本。目前，对 96 孔板中内侧 60 个孔进行成像（每孔拍摄 25 个视野）约需 16 分钟/板，这意味着基于成像的 1000 种化合物筛选实验的数据可在一天内完成采集与分析。未来，该检测方法可用于化合物筛选研究，以挽救神经突生长缺陷。
此外，我们还展示了将一种从诱导多能干细胞（iPSC）生成中脑多巴胺能（mDA）神经元的手动分化方案进行转移。该基于小分子的分化方案耗时65天，由于涉及多次重铺板步骤以及频繁的培养基更换（通常每2天一次），工作量较大，限制了同时生产mDA神经元的iPSC细胞系数量。自动化的mDA分化方案具有显著优势，可将分化规模扩大至数十个iPSC细胞系，最多可同时对30个细胞系进行平行分化。由于分化过程主要依赖于培养基更换，几乎整个分化过程均可&#160;在无人工干预的情况下完成。利用自动化系统的基于日历的调度程序，我们可以根据分化步骤规划培养基更换时间。然而，在处理大量细胞系和培养板时存在一个局限性，即无法实现过夜培养基更换，主要原因在于我们的系统采用一次性吸头，并需人工补充培养基，这一操作需要实验人员在实验室现场完成。为简化培养基更换流程，系统中加载的培养板被分配至特定项目并分批处理，批次大小则根据可用的一次性吸头数量和培养基体积进行调整。如前所述，通过引入可重复使用/可清洗的针头以及实现培养基的自动补充，这一限制可轻易克服。如iPSC所示，细胞的自动传代/重铺板是本自动化细胞培养系统提供的便利功能之一。我们已在分化第25天测试了mDA神经元的自动重铺板。然而，mDA神经元的解离需要比iPSC（8分钟）更长时间（40分钟）的解离酶孵育，导致每个细胞系的自动重铺板过程延长至1小时以上。因此，同一天内完成30个细胞系的自动重铺板变得不可行。通过加快自动重铺板过程中的其他步骤（如板的运输、移液）并改进系统以支持针头和培养基管路的过夜运行，可解决此问题。尽管存在上述不足，我们仍成功将手动方案转移至自动化mDA神经元分化流程，获得了含有大量MAP2（神经元）和TH（mDA神经元）阳性细胞的培养物。
并行分化数十个诱导多能干细胞（iPSC）细胞系对于研究包括帕金森病在内的神经退行性疾病分子机制的项目具有重要意义。然而，如何更快、更少出错且以更低的成本完成任务仍是一个巨大挑战。由于本文所述方案（iPSC、smNPC 和 mDA 神经元）实现了自动化，我们能够在项目中加快进度、降低成本并提高可重复性。涉及数百个患者细胞系的 FOUNDIN-PD 项目（https://www.foundinpd.org/wp/）的发展表明，对自动化细胞培养与分化方案存在迫切需求。我们未来的目标是将手动的三维（3D）细胞培养模型转移至该自动化系统。通过对孔板定义设置进行微小调整并使用适配器，即可兼容适用于 3D 培养的商用或定制孔板以及微流控腔室。此外，引入自动化的无标记成像模型将使我们能够实时追踪神经元生长，并将神经突生长、神经元排列结构及细胞死亡的变化转化为对疾病机制的更深入理解。

人类诱导多能干细胞（hiPSC）具有自我更新能力，几乎可以分化为任何成体细胞类型。这些特性使hiPSC成为基础研究和药物发现中疾病建模的有力工具1。人类iPSC保留了供体的遗传背景，因此能够获得在疾病进程中最受影响或起关键作用的疾病相关细胞类型，例如神经退行性疾病中的不同神经元亚型2,3。此外，hiPSC克服了动物模型和细胞过表达模型的一些局限性，可在人类生理背景下模拟疾病，并实现生理水平的蛋白质表达，已被证明在单基因病、复杂性疾病、表观遗传疾病以及迟发性疾病的建模中具有重要价值4。
尽管具有上述优势和机遇，hiPSC 仍存在若干局限性亟待解决。目前的 hiPSC 培养与分化方案成本较高，难以标准化，且劳动强度大。人工培养步骤可能导致细胞得率和表型出现较大差异，原因在于 hiPSC 的生长状态和自发分化程度存在差异。因此，需要通过采用更加标准化的操作技术并简化实验流程来减少实验者依赖性变异，而自动化技术的应用可实现这一目标5。建立自动化的 hiPSC 培养与分化方案将为学术界和工业界的研究项目设立通用标准，并有助于构建具有生物学意义的疾病模型，获得更可重复的实验结果。
先前的研究已尝试对 hiPSC 培养进行自动化6,7,8，但这些方案仅限于依赖特定系统的细胞培养板格式，缺乏对不同检测体系的适应性。此类系统在细胞扩增方面具有实用性，但可能不适用于特定细胞类型的自动化分化、疾病表型分析及筛选研究。此外，已有研究报道了一种用于成纤维细胞提取、hiPSC 生成与分化的大型自动化平台9，但其规模仅适用于致力于细胞系生产的高通量实验室，虽具吸引力，但对于许多学术实验室而言可能难以负担。
我们开发了一套完全自动化的细胞培养系统，该系统基于液体处理工作站，置于高效微粒空气（HEPA）过滤环境中，并结合大容量CO2培养箱、明场成像细胞仪以及用于板转运的机械臂。这些组件为稳定且可重复的hiPSC培养与分化提供了基础。我们还为系统配备了自动化的-20 °C储存系统，用于化合物或病毒的存储，并集成了一台高速旋转盘共聚焦活细胞成像仪。通过定制化协议，实现了细胞接种、换液、融合度检测、细胞扩增以及带样品处理和板成像的检测板制备等步骤的自动化，使系统适用于高内涵/高通量筛选。该自动化细胞培养与成像系统通过控制软件及定制的图形用户界面（GUI）进行操作。GUI允许用户导入包含方法执行所需细胞系特异性参数的CSV文件。此外，GUI还支持通过内置日历视图按任意顺序安排大量实验，从而精确控制每个方法的启动时间。
我们的自动化细胞培养系统采用标准化的移液速度、传代时间、汇合度阈值、接种密度和培养基体积，并可灵活地在多种孔板格式（96、48、24、12、6 或 1 孔板）中进行细胞培养。我们优化了一种近期发表的短期分化方案，可将人诱导性多能干细胞（hiPSC）转化为神经元，在6天内获得TUBB3阳性神经元10,11。此外，我们建立了小分子神经前体细胞（smNPC）向神经元分化的自动化分化与成像流程，其中smNPC在EF1a启动子驱动下持续表达GFP12；同时，我们也实现了hiPSC向中脑多巴胺能（mDA）神经元的自动化分化，该流程基于先前发表的双SMAD抑制方案13，可在65天内获得mDA神经元。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;分销商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;稀释&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;iPSC 多能性标志物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287</td><td>1 至 33</td></tr><tr><td>兔抗 Oct3/4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>1 到 200</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGN2神经元标志物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 TUBB3</td><td>R &amp;与 D</td><td>MAB1195</td><td>1 到 500</td></tr><tr><td>兔抗 BRN2</td><td>NEB</td><td>12137</td><td>1 到 1,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mDA 神经元标志物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡抗-TH</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>12137</td><td>1 至 750</td></tr><tr><td>小鼠抗 MAP2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74421</td><td>1 至 750</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgY，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td>1 至 2,000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1 至 2,000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td>1 到 2,000</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 至 2,000</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 到 2,000</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>1 到 2,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞核复染&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1 至 8,000</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;分销商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;描述/应用&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>安捷伦 TapeStation 系统</td><td>安捷伦科技</td><td>4200</td><td>自动化电泳&lt;br/&gt; 用于DNA和RNA样品</td></tr><tr><td>自动化 -20 &amp;deg;C 储存系统</td><td>Hamilton Storage&lt;br/&gt; 技术</td><td>样本获取管理器&lt;br/&gt; (SAM -20C, 3200 系列)</td><td>试剂储存</td></tr><tr><td>条形码读取器</td><td>霍尼韦尔</td><td>条形码读取器 Orbit</td><td>条形码扫描仪</td></tr><tr><td>明场细胞自动培养系统</td><td>Nexcelom</td><td>Celigo</td><td>融合度检查和&lt;br/&gt; 细胞计数</td></tr><tr><td>CellVoyager 7000</td><td>横河</td><td>CellVoyager 7000</td><td>自动化共聚焦显微&lt;br/&gt; 显微镜</td></tr><tr><td>Cytomat 细胞培养系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Cytomat 24 C, CU</td><td>12 层堆栈间距 28 mm，&lt;br/&gt; 12 个堆叠器，节距 23 mm&lt;br/&gt; （共 456 块培养板）</td></tr><tr><td>用于解冻样本的Cytomat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 2-LIN, 60 DU&lt;br/&gt; （干燥单元）</td><td>2个堆叠器间距28 mm&lt;br/&gt; （共42块板）</td></tr><tr><td>HEPA 过滤器</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Hood Flow Star UV</td><td>由 Hamilton 修改&lt;br/&gt; 机器人技术</td></tr><tr><td>液体处理工作站</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Microlab Star</td><td>通道：8个1毫升，4个5毫升&lt;br/&gt; 和 96 通道 MPH</td></tr><tr><td>培养基储液槽</td><td>Hamilton Robotics</td><td>188211APE</td><td>培养基/试剂储液槽</td></tr><tr><td>纯水系统</td><td>威立雅水务</td><td>ELGA PURELAB Classic</td><td>提供纯水&lt;br/&gt; 针头清洗站</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量PCR系统&lt;br/&gt; PCR系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSTUDIO12KOA</td><td>实时荧光定量PCR仪</td></tr><tr><td>机械臂</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Rackrunner</td><td>培养板的转运</td></tr><tr><td>转盘</td><td>Hamilton Robotics</td><td>转盘</td><td>调整培养板方向</td></tr><tr><td>不间断电源</td><td>APC</td><td>Smart UPS RT 单元，&lt;br/&gt; 10000 VA 电源供应器</td><td>备用电源供应</td></tr><tr><td>VIAFLO-移液器</td><td>Integra</td><td>4500</td><td>电子移液器</td></tr><tr><td>ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453545</td><td>实时荧光定量PCR仪</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;分销商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;注意事项&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1孔培养板（84 cm²）&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>165218</td><td>Nunc OmniTray</td></tr><tr><td>6 孔培养板（9.6 cm²）&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td>TC 经氯胺酮处理</td></tr><tr><td>12孔培养板（3.9 cm）&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665180</td><td>TC 经布比卡因处理</td></tr><tr><td>96孔培养板（0.32 cm²）&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005558</td><td>CellCarrier-96 黑色培养板</td></tr><tr><td>移液提示，50-&amp;micro;L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235987</td><td>50 µL 吸头</td></tr><tr><td>提示，300-&amp;micro;L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235985</td><td>300-&amp;micro;L型吸头</td></tr><tr><td>提示，1000-&amp;micro;L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235939</td><td>1000-&amp;micro;L型枪头</td></tr><tr><td>吸头，5 mL</td><td>Hamilton Robotics</td><td>184022</td><td>5-mL 吸头</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>15 mL 离心管</td></tr><tr><td>50-mL 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50-mL 离心管</td></tr><tr><td>Nalgene 冻存管 2.0 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V5007</td><td>冻存管</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;经销商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;注意事项&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pLV_hEF1a_rtTA3</td><td>Addgene</td><td>61472</td><td>Ron Weiss 惠赠</td></tr><tr><td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td><td>Addgene</td><td>61474</td><td>Ron Weiss 惠赠</td></tr><tr><td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 慢病毒</td><td>Takara Bio</td><td>631983</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;序列（正向）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;序列（反向）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;来源&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;iPSC 多能性&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4（ID 4505967a1）</td><td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td><td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NANOG（ID 153945815c3）</td><td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td><td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td><td>引物银行</td></tr><tr><td>REX1（ID 89179322c1）</td><td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td><td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td><td>引物银行</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGN2神经元&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2（货号 87578393c1）</td><td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td><td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>BRN2（ID 380254475c1）</td><td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td><td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>CUX2（编号 291045458c2）</td><td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td><td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td><td>引物银行</td></tr><tr><td>NCAM1（ID 336285437c3）</td><td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td><td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td><td>引物银行</td></tr><tr><td>SYNAPSIN1（ID 91984783c3）</td><td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td><td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;中脑多巴胺能（mDA）神经元&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH</td><td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td><td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td><td>NCBI 引物-BLAST</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td><td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td><td>NCBI 引物-BLAST</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;管家基因&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td><td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td><td>NCBI 引物-BLAST</td></tr><tr><td>OAZ1</td><td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td><td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td><td>NCBI 引物-BLAST</td></tr><tr><td>RPLPO</td><td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td><td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td><td>NCBI 引物-BLAST</td></tr><tr><td>RPL13A</td><td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td><td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td><td>NCBI 引物-BLAST</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基与试剂&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;分销商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;使用浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;包被基质&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞外基质（Matrigel）</td><td>康宁</td><td>354277</td><td>10 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>康宁</td><td>356008</td><td>2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>5 - 10 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸（PLO）</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPSC 培养基&lt;br/&gt; （Essential 8 Flex 培养基）</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGN2神经元 - NGN2培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0.909 mL（50 &amp;micro;M)</td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL（1%）</td></tr><tr><td>DMEM/F-12，GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331093</td><td>484.75 mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL（2 mM）</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>0.25 mL（2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL（0.5%）</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL（0.5%）</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mDA 神经元 - SRM 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0.5 mL（55 &amp;micro;M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL（2 mM）</td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>409.5 mL</td></tr><tr><td>敲除血清替代物&lt;br/&gt; （血清替代物）</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>75 mL（15%）</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL（1%）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL（1%）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mDA 神经元 - N2 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL（2%）</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL（2 mM）</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL（1%）</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>475 mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL（1%）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mDA 神经元 - 分化培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL（2%）</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL（1%）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGN2 神经元 - 补充剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脑源性神经营养因子&lt;br/&gt; (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021（CHIR）</td><td>R&amp;研发</td><td>4423/10</td><td>2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>多西环素（dox）</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>2.5 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子&lt;br/&gt; (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸&lt;br/&gt; 镁 (AA2)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>64 mg/L</td></tr><tr><td>神经营养因子-3（NT-3）</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Purmorphamine (PMA)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>0.5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma</td><td>P8833-10MG</td><td>0.5 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>默克密理博</td><td>420220-10MG</td><td>2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mDA 神经元 - 补充剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脑源性神经营养因子&lt;br/&gt; (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021（CHIR）</td><td>R&amp;研发</td><td>4423/10</td><td>3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Cayman</td><td>13197</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子8B（FGF-8b）</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子&lt;br/&gt; (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸（AA1）</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>0.2 mM</td></tr><tr><td>LDN193189（LDN）</td><td>Cayman</td><td>11802</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Purmorphamine（Purm）</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>音猬因子/Shh (C24II)&lt;br/&gt; N端（SHH）</td><td>R&amp;研发</td><td>1845-SH</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>SB431542（SB）</td><td>Cayman</td><td>13031</td><td>10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>转化生长因子类型 &amp;szlig;3&lt;br/&gt; （TGF&amp;szlig;3)</td><td>R&amp;研发</td><td>243-B3</td><td>1 ng/mL</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Cayman</td><td>10005583</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;解离试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>单细胞解离试剂&lt;br/&gt; （StemPro Accutase）</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>1x</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Gibco</td><td>11575020</td><td>0.5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA提取与cDNA试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Rneasy MiniKit</td></tr><tr><td>RNA裂解缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>Trizol 裂解缓冲液（RNA&lt;br/&gt; 裂解缓冲液</td></tr><tr><td>逆转录酶（试剂盒）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18080-085</td><td>SuperScript III 逆转录酶&lt;br/&gt; 逆转录酶</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;描述/应用&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>细胞培养框架（CCF）&lt;br/&gt; （图形用户界面，GUI）</td><td>Hamilton Robotics</td><td>定制</td><td>自动化系统的用户界面</td></tr><tr><td>CellPathFinder 软件&lt;br/&gt; （图像分析软件 1）</td><td>横河</td><td>CellPathfinder HCS 软件</td><td>图像分析工具</td></tr><tr><td>CellVoyager 测量系统</td><td>横河</td><td>包含在内&lt;br/&gt; CellVoyager 7000</td><td>显微镜控制&lt;br/&gt; 软件</td></tr><tr><td>Columbus 软件&lt;br/&gt; （图像分析软件 2）</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>图像分析工具</td></tr><tr><td>基于云的 qPCR 应用程序</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>赛默飞云</td><td>分析软件用于&lt;br/&gt; qRT-PCR 数据</td></tr><tr><td>Venus 软件</td><td>Hamilton Robotics</td><td>VENUS Two Dynamic&lt;br/&gt; Schedular 5.1 软件</td><td>控制软件用于&lt;br/&gt; 自动化系统</td></tr></tbody></table>

人诱导多能干细胞来源的皮层神经元和多巴胺能神经元的自动化生产及整合活细胞监测

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

人类诱导多能干细胞（hiPSC）的手动培养与分化方案难以标准化，变异程度高，且容易自发分化为非预期的细胞类型。这些方法劳动强度大，难以适用于大规模实验。为克服这些局限，我们开发了一套自动化细胞培养系统，并将其与高通量成像系统相结合，建立了可并行维持多种hiPSC细胞系及进行神经分化的操作流程。本文描述了利用神经原性基因-2（Neurogenin-2, NGN2）过表达实现短期分化方案的自动化，可在6‒8天内获得hiPSC来源的皮层神经元；同时介绍了长期分化方案的实施，可在65天内生成hiPSC来源的中脑多巴胺能（mDA）神经元。此外，我们将NGN2方法应用于小分子诱导的神经前体细胞（smNPC）&#160;（该细胞经GFP慢病毒转导），并建立了活细胞自动化神经突生长检测方法。我们提出了一套适用于常规hiPSC培养及向皮层神经元和多巴胺能神经元分化的自动化系统。该平台适用于长期免手动干预的培养，以及基于hiPSC的高内涵/高通量化合物筛选、RNAi和CRISPR/Cas9筛选，可用于发现新的疾病机制和药物靶点。

我们展示了与自动化成像和分析兼容的人诱导多能干细胞（hiPSC）培养及神经元分化的自动化流程。

人类诱导性多能干细胞（hiPSC）的手工培养与分化方案难以标准化，变异程度高，且易发生向非目标细胞类型的自发分化。这些方法劳动密集，难以适用于大规模实验。为克服这些局限性，我们开发了一种自动化细胞培养系统，并与高通量成像系统相耦合，建立了可并行维持多种hiPSC系及进行神经分化的方案。本文描述了利用神经源性基因-2（Neurogenin-2, NGN2）过表达的短期分化方案的自动化流程，可在6–8天内获得hiPSC来源的皮层神经元；同时实现了在65天内生成hiPSC来源的中脑多巴胺能（midbrain dopaminergic, mDA）神经元的长期分化方案。此外，我们将NGN2方法应用于经GFP慢病毒转导的小分子诱导神经前体细胞（small molecule-derived neural precursor cells, smNPC），建立了活细胞自动化神经突生长检测方法。我们提出了一套适用于hiPSC常规培养及向皮层神经元和多巴胺能神经元分化的自动化系统。该平台适用于长期无手动干预的培养，以及基于hiPSC的高内涵/高通量化合物、RNAi和CRISPR/Cas9筛选，可用于发现新的疾病机制和药物靶点。

本研究的总体目标是展示如何实施自动化流程，用于将人诱导多能干细胞（hiPSC）培养并分化为神经细胞系，以及对其进行自动化成像。标准化的自动化流程可在确保高表型可重复性的同时，降低实验变异。此外，该系统还可适用于新实验方案的开发。演示这些操作的将是本实验室的博士后 Joachim Tager 和 Elisangela Bressan。在自动化系统的图形用户界面中，点击资源仪器流程视图并选择相应的资源仪器流程。点击运行仪器流程，然后运行 HEPA 通风柜和重新加载流程。选择要加载的资源，打开舱门，根据弹出图像的指示将细胞培养板和一次性吸头放置在相应位置。然后用70%乙醇对舱门进行去污处理，关闭舱门后运行去污程序。系统将通过紫外线照射灭菌30分钟。为向培养板中加入培养基或解离试剂，执行 HEPA 去污步骤并打开液体处理工作站的门。使用 70% 乙醇消毒后，将储液槽放置在指定位置并移除盖子。关闭液体处理工作站的门，然后运行 InitHepaHood 资源仪器程序以关闭 HEPA 去污系统。要执行自动培养方法，在图形用户界面的日历视图中，单击“添加操作步骤”并选择实验中要使用的细胞系。使用向导选择项目并标记要使用的批次。单击右侧箭头，进入向导的下一页，以选择要执行的操作步骤。在向导的最后一页，安排实验并设置运行该方法所需的适当参数细节变量，然后点击“确定”。将含有人iPS细胞悬液的50毫升管装入后，在支架上装载包被好的培养板以接收细胞，并执行从管中接种培养板的方法。为在明场成像细胞计数仪中对细胞进行计数，需在平台上自动制备含有细胞悬液的384孔计数板，并使用机械臂将384孔计数板从平台转移至明场成像细胞计数仪。计数完成后，系统会将培养板移回原始位置，并从支架上转移一块包被的培养板或检测板至移液工作台。随后，系统将按照用户设定的数量和体积，向培养板中接种细胞，并通过移液操作进行混匀。接种完成后，培养板将被移至工作台内置摇床，在500转/分钟的条件下振荡10秒以促进细胞分布，随后转移至二氧化碳培养箱中。为评估自动化的细胞融合度，执行检测融合度方法，并选择包含至少一个培养板且不含检测板的批次。在参数详情部分，于成像分析设置中输入 iPSCf_2020 以进行图像采集。系统将随后把第一块培养板从培养箱转移至明场成像细胞仪，并对细胞融合度进行成像。更换细胞培养或检测板的培养基时，执行培养板换液方法，并选择仅包含培养板的批次。系统将把培养板转移至操作台面，倾斜培养板以允许吸除上清液。上清液将被排入废液收集模块，移除移液吸头后，向每块培养板加入12毫升新鲜培养基。系统将重新盖上培养板的盖子，并将培养板放回细胞培养箱中。或者，如需更换检测培养板的培养基，请执行检测培养板的换液方法。如需对细胞进行传代培养，请执行贴壁细胞传代培养方法，并选择包含需要传代培养的培养板的批次。弃去培养基后，系统将每孔加入 8 毫升 PBS 洗涤细胞一次，随后向细胞中加入 8 毫升 0.5 毫摩尔 EDTA。在振荡平台上孵育 8 分钟并启用倾斜功能后，将每孔 EDTA 替换为 12 毫升新鲜培养基。系统将以每分钟 2,000 转的速度振荡培养板 1 分钟，以使细胞集落脱落，随后通过移液吹打 5 个循环，将集落分散为直径 50 至 80 微米的细胞团块。随后将细胞转移至甲板上的50毫升离心管中，按1:7的传代比例接种。对于自动化的高内涵、高通量细胞成像，执行成像方法并选择包含至少一块检测板且无培养板的批次。系统将随后把检测板转移至自动共聚焦显微镜进行成像。执行所需的操作步骤时，务必选择正确的批次和孔板编号。应每天监测hiPSC培养物的生长情况，并利用明场成像细胞仪分析其汇合度百分比。传代后，无论是手工培养还是自动化系统培养，细胞均表现出典型的干细胞和多能性标志物表达。在自动培养系统中分化的神经元表现出与手动培养神经元相似的形态及神经网络结构。分化六天后，自动分化的皮层神经元呈神经元特异性Ⅲ类β-微管蛋白及上层皮层标志物阳性。八天后，细胞还表达微管相关蛋白2、神经细胞黏附分子、突触素Ⅰ以及皮层神经元标志物。在hiPSC中，这些标志物的表达极低或无表达。该系统还可用于建立活细胞自动化的神经突生长检测，可在11天的分化过程中无需人工干预地连续测量神经突长度。利用自动培养系统在65天的培养周期中进行培养基更换，可促进hiPSC向中脑多巴胺能神经元分化，并形成预期的细胞结构和形态。除了轴突生长外，还可利用这种高通量、高内涵的检测模式探索其他与神经退行性变研究相关的自动化表型检测方法，例如 TDP-43 转位、RNA 焦点以及 α-突触核蛋白纤维的摄取。

automated-production-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过集成活细胞监测，自动生产人类诱导多能干细胞衍生皮质神经元和多巴胺神经元

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。...

在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

本视频展示了一种将人类神经前体细胞（NPCs）分化为神经元的方法。将NPCs接种至已建立的小鼠星形胶质细胞-大鼠皮层神经元共培养体系中，以促进NPCs向神经元分化。通过共聚焦显微镜观察细胞形态，验证分化效果。...

一种用于将人类神经前体细胞共培养诱导分化为神经元的技术

该视频展示了一种从人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成兴奋性皮层神经元的方法。在多西环素诱导下，hiPSCs 过表达神经基因2（neurogenin-2），即一种神经特异性转录因子。通过使用特定培养基并结合星形胶质细胞共培养，该过程可促进 hiPSCs...

在微电极阵列上将人诱导多能干细胞分化为神经元

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。...

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。...

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

本方案详细描述了人干细胞来源神经元的重悬与培养步骤，这些神经元此前已在体外由神经前体细胞分化数周。该操作流程适用于基于成像的检测方法，可对神经突、突触以及晚期表达的神经元标志物进行分析，且兼容光学显微镜和高内涵筛选实验体系。...

人多能干细胞来源神经元的分化后重接种，用于神经突起形成和突触成熟的高内涵筛选

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

现有的多能干细胞（PSC）向功能性细胞分化的体系目前受到严重的细胞系间和批次间变异性的阻碍。本文以心肌细胞分化为主要示例，介绍了一种基于图像的机器学习方法，用于智能监测和调控PSC分化过程的实验方案。...

一种基于活细胞成像的机器学习策略用于监测多能干细胞分化

了解自动化培养与分化人诱导多能干细胞为皮质神经元和多巴胺神经元的方法。该系统实现标准化流程，减少实验变异并确保高表型重现性，适用于神经科学研究与药物开发。

人诱导多能干细胞来源的皮层神经元和多巴胺能神经元的自动化生产及整合活细胞监测

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