人诱导多能干细胞来源的皮层神经元和多巴胺能神经元的自动化生产及整合活细胞监测

本研究的总体目标是展示如何实施自动化流程，用于将人诱导多能干细胞（hiPSC）培养并分化为神经细胞系，以及对其进行自动化成像。标准化的自动化流程可在确保高表型可重复性的同时，降低实验变异。此外，该系统还可适用于新实验方案的开发。

演示这些操作的将是本实验室的博士后 Joachim Tager 和 Elisangela Bressan。在自动化系统的图形用户界面中，点击资源仪器流程视图并选择相应的资源仪器流程。点击运行仪器流程，然后运行 HEPA 通风柜和重新加载流程。

选择要加载的资源，打开舱门，根据弹出图像的指示将细胞培养板和一次性吸头放置在相应位置。然后用70%乙醇对舱门进行去污处理，关闭舱门后运行去污程序。系统将通过紫外线照射灭菌30分钟。

为向培养板中加入培养基或解离试剂，执行 HEPA 去污步骤并打开液体处理工作站的门。使用 70% 乙醇消毒后，将储液槽放置在指定位置并移除盖子。关闭液体处理工作站的门，然后运行 InitHepaHood 资源仪器程序以关闭 HEPA 去污系统。

要执行自动培养方法，在图形用户界面的日历视图中，单击“添加操作步骤”并选择实验中要使用的细胞系。使用向导选择项目并标记要使用的批次。单击右侧箭头，进入向导的下一页，以选择要执行的操作步骤。

在向导的最后一页，安排实验并设置运行该方法所需的适当参数细节变量，然后点击“确定”。将含有人iPS细胞悬液的50毫升管装入后，在支架上装载包被好的培养板以接收细胞，并执行从管中接种培养板的方法。为在明场成像细胞计数仪中对细胞进行计数，需在平台上自动制备含有细胞悬液的384孔计数板，并使用机械臂将384孔计数板从平台转移至明场成像细胞计数仪。

计数完成后，系统会将培养板移回原始位置，并从支架上转移一块包被的培养板或检测板至移液工作台。随后，系统将按照用户设定的数量和体积，向培养板中接种细胞，并通过移液操作进行混匀。接种完成后，培养板将被移至工作台内置摇床，在500转/分钟的条件下振荡10秒以促进细胞分布，随后转移至二氧化碳培养箱中。

为评估自动化的细胞融合度，执行检测融合度方法，并选择包含至少一个培养板且不含检测板的批次。在参数详情部分，于成像分析设置中输入 iPSCf_2020 以进行图像采集。系统将随后把第一块培养板从培养箱转移至明场成像细胞仪，并对细胞融合度进行成像。

更换细胞培养或检测板的培养基时，执行培养板换液方法，并选择仅包含培养板的批次。系统将把培养板转移至操作台面，倾斜培养板以允许吸除上清液。上清液将被排入废液收集模块，移除移液吸头后，向每块培养板加入12毫升新鲜培养基。

系统将重新盖上培养板的盖子，并将培养板放回细胞培养箱中。或者，如需更换检测培养板的培养基，请执行检测培养板的换液方法。如需对细胞进行传代培养，请执行贴壁细胞传代培养方法，并选择包含需要传代培养的培养板的批次。

弃去培养基后，系统将每孔加入 8 毫升 PBS 洗涤细胞一次，随后向细胞中加入 8 毫升 0.5 毫摩尔 EDTA。在振荡平台上孵育 8 分钟并启用倾斜功能后，将每孔 EDTA 替换为 12 毫升新鲜培养基。系统将以每分钟 2,000 转的速度振荡培养板 1 分钟，以使细胞集落脱落，随后通过移液吹打 5 个循环，将集落分散为直径 50 至 80 微米的细胞团块。

随后将细胞转移至甲板上的50毫升离心管中，按1:7的传代比例接种。对于自动化的高内涵、高通量细胞成像，执行成像方法并选择包含至少一块检测板且无培养板的批次。系统将随后把检测板转移至自动共聚焦显微镜进行成像。

执行所需的操作步骤时，务必选择正确的批次和孔板编号。应每天监测hiPSC培养物的生长情况，并利用明场成像细胞仪分析其汇合度百分比。传代后，无论是手工培养还是自动化系统培养，细胞均表现出典型的干细胞和多能性标志物表达。

在自动培养系统中分化的神经元表现出与手动培养神经元相似的形态及神经网络结构。分化六天后，自动分化的皮层神经元呈神经元特异性Ⅲ类β-微管蛋白及上层皮层标志物阳性。八天后，细胞还表达微管相关蛋白2、神经细胞黏附分子、突触素Ⅰ以及皮层神经元标志物。

在hiPSC中，这些标志物的表达极低或无表达。该系统还可用于建立活细胞自动化的神经突生长检测，可在11天的分化过程中无需人工干预地连续测量神经突长度。利用自动培养系统在65天的培养周期中进行培养基更换，可促进hiPSC向中脑多巴胺能神经元分化，并形成预期的细胞结构和形态。

除了轴突生长外，还可利用这种高通量、高内涵的检测模式探索其他与神经退行性变研究相关的自动化表型检测方法，例如 TDP-43 转位、RNA 焦点以及 α-突触核蛋白纤维的摄取。