经济高效且适应性强的划痕迁移检测

该协议为一种老技术提供了一种新方法，并将为大量基础科学研究人员提供一种新方法。这种技术的主要优点是具有成本效益，以及其适应性，可被更广泛的科学受众所利用。要准备迁移板，请使用浅色永久标记在 48 井板的每个井的背面下画一条线，并绘制三个哈希标记，将每个井划分为三个单独的感兴趣区域。

然后板1.5至2倍10至第四单通道心脏成纤维细胞进入每个井，并在正常培养条件下培养细胞24至48小时，直到达到90至95%的汇合。当细胞准备就绪时，从每一个井中去除上流液，并使用无菌的P200移液器尖端沿绘制的线条进行一个通划痕。用低血清介质冲洗油井，去除任何未连接的心脏成纤维细胞，并在每口井中加入 500 微升低血清介质。

如果使用药理剂，请将药剂添加到相应的井中。接下来，使用具有 20 倍目标的倒置显微镜，使用标记将每井定位，以使刮伤线的上半部分成像，每井捕获两个零小时图像。然后移动板，将划痕线的下半部分放置到视图中，以收集第二个图像，并在细胞培养培养箱中放置板 24 小时。

在孵化结束时，用非无菌 PVS 清洗每一个井，并在烟罩中向每一个井中加入 500 微升 4%的甲状甲醛。在室温下10分钟后，用新鲜PBS清洗每井三次，每次洗涤5分钟。上次洗涤后，每井用300微升的渗透溶液渗透细胞，并在室温下轻轻摇动30分钟。

在孵育结束时，用1%的Kumasi亮蓝色污渍取代渗透溶液，在室温下轻轻摇动，进行10分钟的孵育。接着是三，五分钟洗在PBS与摇摆。上次洗涤后，向每井添加 300 微升 PBS，并小心地将板定位在与零小时图像相同的位置，然后捕获两张 24 小时图像，然后演示。

在实验结束时，打开图像和适当的成像分析软件程序，并在零小时图像上创建新图层。双击可更改新图层线图层的名称并选择画笔工具。将像素大小更改为 10，将颜色更改为红色，并绘制两条单独的线条来勾勒划痕。

线条不应接触任何单元格。打开成像软件中的 24 小时图像并选择移动工具。按住控制按钮，同时单击线条和背景图层，单击零小时图像的中心，然后将两个图层拖动到 24 小时图像的中间。

在 24 小时图像中，单击零小时背景图层并将不透明度更改为 50% 按住控制按钮，单击零小时背景图层和线图层，然后单击编辑和自由变换以自由变换使用自由变换图层，将零小时背景和线图像与 24 小时背景图像对齐，以便区域迁移线在 24 小时图像中正确定位。成功覆盖线图层后，右键单击以删除零小时背景图层。剩余的线图层可用于确定在 24 小时内迁移到暂存区域的单元格数。

然后将新的迁移映像同时保存为 Photoshop 和 TIFF 或 JPEG 文件。要量化迁移单元格的数量，请打开迁移图像和接受 TIFF 或 JPEG 文件的程序，并手动计算位于两个井的两个图像的单元格数并触摸两个红线。然后记录每个图像的迁移单元格数。

要确定迁移区域，请打开在映像软件中包含迁移行的 24 小时图像，然后将图像保存为迁移区域图像。保存后，单击背景图层并右键单击以删除图层。使用画笔工具填充暂行之间的区域，颜色与线条的颜色相同，然后单击图像、模式和灰度将图像更改为黑白。

保存图像并打开迁移区域图像和适当的图像分析软件程序。单击"编辑"并反转。要确定迁移行的区域，请单击图像、调整和阈值。

黑色迁移区域将变红，百分比区域将在阈值框中指示。然后记录迁移行的百分比区域，并确认此值与同一图像的迁移单元格数配对。在这项分析中，来自非糖尿病心脏的46个成纤维细胞和来自糖尿病心脏的129个成纤维细胞在24小时实验期间迁移。

对迁移面积的测量表明，非糖尿病划痕面积占测量总面积的24.78%，糖尿病迁移划痕面积占测量总面积的16.77%。规范化到迁移区域可以更好、更严格地评估单元格迁移，并否定潜在的人为错误。例如，如果仅比较迁移的成纤维细胞数量，则在此分析中会出现在此井中迁移的细胞数是第二井中迁移细胞数量的两倍。

然而，当划痕区域用于使数据正常化时，在两口井中观察到成纤维细胞与迁移区的比率几乎相同。请务必在 24 小时图像中重新捕获迁移区域，就像在零小时图像中捕获的一样。按照这个程序，免疫组织化学可以进行，以检查细胞内的蛋白质表达。

我们认为，这种对划痕迁移测定的较新的方法将允许更多的科学研究途径开辟以前没有的渠道。