大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养

研究表明，来源于颅面骨的骨髓间充质干细胞（BMSCs）比来源于轴向骨和附肢骨的具有更优越的能力。因此，下颌骨BMSCs被认为是开发颅面疾病未来治疗手段的首选资源。本方案结合了全骨髓贴壁法和荧光细胞分选技术的优势，可在短时间内获得大量高纯度的下颌骨BMSCs。

如果您是首次尝试本实验方案，我认为理解大鼠下颌的解剖结构及其功能运动非常重要，可通过观看本视频或阅读相关文献来实现。处死大鼠后，将其置于洁净的通风橱内，保持仰卧位。从双侧口角沿下颌后缘切开皮肤及颊肌。

用双手拇指将大鼠的上颌和下颌门齿向相反方向推，以张开其口腔，暴露附着在下颌骨上的下颌牙齿。完全分离附着在喙突和下颌骨下缘的颊肌及肌腱。然后按压下颌后牙，并向后下方旋转，直至两侧的髁突清晰暴露。

将下颌骨体与颅骨分离，并用湿纱布清除骨表面附着的软组织。将骨组织置于盛有预冷的α最小必需培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）的10厘米无菌玻璃皿中，并置于冰上，以保持组织活性。从下颌骨体第一磨牙近中缘处切断前方骨组织，然后沿第三磨牙远中缘切除包含喙突和髁突的下颌支，以暴露骨髓腔。

用10毫升含10% FBS的α-MEM填充一个10厘米的无菌玻璃培养皿。用10毫升注射器吸出培养基，然后将针头插入骨髓腔，反复冲洗骨髓至培养皿中。分别从骨的近端和远端两侧各至少冲洗骨髓腔三次，直至骨骼变为白色。

将含有冲洗细胞的培养基转移至15毫升离心管中，在800 RPM条件下离心5分钟。弃去上清液，用3毫升含10%胎牛血清的α-MEM重新悬浮细胞。将细胞接种至新的10厘米培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育。

吸去培养基，用 PBS 洗涤培养皿。在培养皿中加入 2 毫升含 0.02% EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶溶液，在 37°C 下消化细胞 5 分钟。然后加入 4 毫升含 10% FBS 的 α-MEM 以终止反应。

将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在800 RPM条件下离心5分钟。离心后，用含有10%胎牛血清（FBS）的120微升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞。取100微升细胞悬液转移至新的微量离心管中。

在4°C条件下，用1微升抗CD16至CD32抗体封闭细胞悬液，孵育15分钟；然后在避光条件下，于4°C用PE标记的抗CD45抗体、FITC标记的抗CD90抗体以及APC标记的抗CD29抗体对细胞进行染色，孵育1小时。另取20微升细胞悬液作为未染色的阴性对照。将各管在800 RPM下离心5分钟。

弃去上清液，将细胞重悬于 0.5 毫升含 10% FBS 的 PBS 中。在分析前 10 分钟加入 10 微升浓度为 0.01 毫克/毫升的 DAPI。在离心管上放置 40 纳米滤膜过滤细胞，然后使用荧光激活细胞分选仪分析细胞。

首先通过圈选DAPI阴性细胞从总细胞数中去除死细胞，然后在选定的细胞中圈选CD29阳性、CD90阳性、CD45阴性的细胞，以获得目标mBMSCs。将分选后的mBMSCs收集到含有5毫升含10%FBS的alpha-MEM的15毫升离心管中。以800 RPM离心5分钟，弃去收集缓冲液。

加入一毫升新鲜培养基重悬细胞，然后将细胞接种至六厘米的培养皿中。采用本方案，在初次培养后的第三天，大部分细胞已贴壁。再经过三至四天的培养，细胞融合度达到70%至80%。采用荧光细胞分选技术纯化mBMSCs，其在P0代细胞中约占81.1%。

将P2代小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）在六孔板中培养一周后，观察到大量集落形成单位。为评估mBMSCs的多向分化潜能，将其分别诱导分化为成骨、成软骨和成脂谱系。碱性磷酸酶（ALP）活性增强、茜素红染色下出现红色钙化结节，以及成骨特异性基因Runx2、Alp、Bsp和Ocn的表达水平升高，表明成骨诱导成功。

采用油红O染色法鉴定成脂分化。诱导九天后可见大量富含脂质的空泡。此外，成脂特异性基因Ppar-gamma-1和Cebpa的表达水平升高。

在显微镜下观察软骨分化时，样品显示阿利新蓝染色呈阳性。此外，使用抗II型胶原抗体进行免疫染色显示软骨基质的积累增加。在此方案中，确保小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的活力非常重要。

通过选择合适的实验动物、在冰上操作以及缩短实验时间，可以实现这一目的。利用该体外模型，可获得大量具有增殖能力的下颌骨骨髓间充质干细胞（BMSCs），这有助于研究下颌骨BMSCs的生物学特性、对微环境的后续反应及其他相关应用。