通过固定CD47衍生肽减少血液来源细胞在金属植入物上的黏附

本方案包含一种新颖的化学策略，可将治疗性肽段连接到金属表面，有望提高多种金属生物材料的生物相容性。这是一种通用且稳健的技术，可用于将肽段和治疗性蛋白质连接至生物植入物的裸露金属表面。我们已利用该技术通过在金属支架表面连接CD47肽段，以预防支架植入引发的炎症反应，从而改善其生物相容性。

首先将不锈钢箔片试样或网状圆片置于摇床中，用异丙醇-2清洗5分钟。重复此步骤两次，随后用氯仿清洗样品两次，每次10分钟。将清洗后的不锈钢样品放入220摄氏度的烘箱中加热30分钟。

将焙烧后的箔片或网状圆片浸入0.5%的PABT水溶液中，在摇床中孵育一小时。用去离子蒸馏水洗涤PABT修饰的样品五次。将样品转移至新的小瓶中，并重复洗涤步骤。

将样品加入TCEP后，在摇床中室温孵育15分钟。使用真空装置（如冷冻干燥机）对圆底烧瓶中的去离子蒸馏水进行脱气，并用脱气后的水洗涤箔片或网状圆片五次。将样品转移至新的小瓶中，并重复洗涤步骤。

通过将212.5微升的储备PEI-PDT溶液和125微升0.4摩尔的醋酸钠溶液加入脱气水中，配制5毫升1%的PEI-PDT溶液。将清洗后的不锈钢样品与1% PEI-PDT溶液孵育，用氩气置换空气，密封瓶口，于摇床中反应一小时。

立即进行肽偶联，或将样品在4°C下保存最多一周。通过将人源肽CD47粉末溶解于脱气的50%乙酸中，配制1毫克/毫升的人源肽CD47储备液，然后将500微升储备液溶解于4.5毫升脱气的PBS中，制备工作液。将洗涤后的PEI-PDT包被样品与肽CD47工作液在室温下振荡孵育一小时。

实验结束后，按照文稿中的描述清洗CD47肽段包被的样品。将金属箔分别用CD47肽段或乱序肽段包被后，将四分之一英寸的PVC管切成三段，每段38厘米长，并将最多八片未经修饰、乱序肽段修饰或CD47肽段修饰的金属箔分别插入三个不同的管中。从健康人类供体采集30毫升血液，供体应未使用任何抗血小板药物，并在采血前用1毫升4%柠檬酸钠预填充注射器，以防止血液凝固。

使用10毫升注射器将10毫升血液注入每根试管中，并用金属接头连接两端。将装有血液的试管放置在Chandler循环装置的转轮上，通过转轮旋转使血液在37摄氏度条件下沿金属箔流动4小时。从试管中排出血液，并根据机构审查委员会（IRB）的要求进行处理，然后用手术刀切割试管以取出金属箔。

通过将70%的戊二醛溶液用含0.1摩尔氯化钠的二甲胂酸钠缓冲液稀释，配制2%戊二醛溶液。将金属箔片置于2%戊二醛溶液中孵育15分钟，并在4摄氏度下保存过夜。在分析金属箔片前，用PBS洗涤三次。

将8毫升PBS置于37摄氏度水浴中预热。通过向一支CFDA小瓶中加入90微升DMSO来配制10毫摩尔的CFDA储备液，然后将75微升CFDA储备液加入预热的PBS中，配制工作液。轻轻颠倒混匀数次，并用铝箔纸包裹管子。

将每片金属箔放入24孔板中的1毫升CFDA染料中。用铝箔覆盖24孔板，并在37°C下孵育15分钟，随后用PBS洗涤金属箔3次，然后使用荧光显微镜观察成像。通过定量共价结合的TAMRA标记肽CD47的浓度，确定该肽在金属表面的最大固定密度。

最大肽保留量约为每平方厘米180纳克，该值在输入浓度为100微克/毫升时达到。通过荧光显微镜进一步证实了TAMRA标记的CD47肽在修饰金属表面的固定化，结果显示经TAMRA标记的CD47肽处理的网状圆片表面发出均匀的荧光。而在未经修饰的对照组网格表面仅检测到极微弱的荧光，从而排除了非特异性结合的TAMRA标记CD47肽作为主要荧光来源的可能性。

还证实，与随机序列修饰及未修饰肽对照相比，CD47肽包被表面显著减少了血液来源细胞的黏附。从大鼠血沉棕黄层细胞中分离的单核细胞被培养在裸金属以及CD47肽修饰的不锈钢箔上。在功能化表面上，急性单核细胞黏附、其向巨噬细胞的转化以及巨噬细胞增殖均减少了58%。

在进行本方案时，使用脱气水或试剂的步骤必须尽快完成，并尽量减少与氧气的接触。我们的技术可选择性地调控细胞与金属表面的相互作用，且该技术可兼容典型的细胞类型鉴定实验，如RT-PCR、流式细胞术和免疫荧光。当该技术被应用于多种生物活性肽时，可在组织与材料界面处显著提升生物相容性。