Name: 通过CD47衍生肽固定，缓解血系细胞附着到金属植入物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解将CD47衍生肽固定到金属植入物表面的化学策略，用于改善不锈钢支架的生物相容性并减少炎症细胞附着。该方法可应用于多种金属生物材料。

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本论文中所述的实验方案开发与研究工作得到了美国国立卫生研究院（NBIB）R01基金（# EB023921）对IF和SJS的资助，以及美国国立卫生研究院（NHLBI）R01基金（# HL137762）对IF和RJL的资助。

本实验所用所有人源样本均按照费城儿童医院机构审查委员会（IRB）的规定获取。所有动物实验均经费城儿童医院动物护理与使用委员会（IACUC）批准后进行。
1. 使用 PEI-PDT 涂覆裸金属表面
<ol>
	<li>用异丙醇清洗不锈钢箔片试样（1 cm × 1 cm 或 0.65 cm × 1 cm）或不锈钢网片 &#160;在摇床中（60 °C，200 rpm）振荡 5 分钟。此步骤重复 2 次。随后用氯仿洗涤 2 次，每次 10 分钟（60 °C，200 rpm）。</li>
	<li>将清洗后的不锈钢样品置于 220 °C 的烘箱中加热 30 分钟。</li>
	<li>通过将25 mg含潜伏性巯基的聚烯丙基胺双膦酸盐（PABT）和5 mg碳酸氢钾（KHCO₃）溶解于5 mL溶液中，配制0.5% PABT溶液。3在5 mL去离子水中溶解，并在72 °C、200 rpm条件下于摇床中孵育30分钟。 
	注意：PABT 的合成请参考先前发表的文献18.</li>
	<li>将焙烧后的箔片或网状圆盘浸入0.5%的PABT水溶液中，在摇床中孵育1小时（72 °C，转速200 rpm）。</li>
	<li>用去离子蒸馏水（DDW）洗涤经PABT修饰的样品5次，将样品转移至新离心管中，再用DDW洗涤5次。</li>
	<li>将60 mg的三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）溶解于5 mL的0.1 M乙酸缓冲液（含冰醋酸0.57 mL、醋酸钠820 mg，加ddH₂O定容至100 mL）中，配制总体积为5 mL、浓度为12 mg/mL的TCEP溶液。</li>
	<li>在摇床中于室温（RT）下用TCEP处理PABT修饰的样品15分钟。 &#160; 
	注意：TCEP 用于脱保护巯基。</li>
	<li>使用真空发生装置（如冷冻干燥机）对圆底烧瓶中的去离子水进行脱气，并用脱气的去离子水将经TCEP处理的箔片或网格圆片清洗5次。将样品转移至新的小瓶中，并再用脱气的去离子水清洗5次。 
	注意：必须迅速操作，以防止大气中的氧气氧化金属表面的巯基。</li>
	<li>通过将212.5 µL的PEI-PDT储备液和125 µL的0.4 M醋酸钠溶液加入去气的双蒸水中，配制5 mL的1% PEI-PDT溶液。同时进行步骤1.9和步骤1.8，以尽量减少样品暴露于空气中的时间。 
	注意：PEI-PDT 的合成方法见于先前已发表的文献18.</li>
	<li>将清洗后的不锈钢样品与1% PEI-PDT孵育。用氩气置换空气，密封瓶口，于室温下在摇床中混合反应1小时。可立即进行肽偶联反应，或在4 °C保存最多1周。</li>
</ol>
2. 使用荧光显微镜和荧光测定法对金属表面荧光标记肽段pepCD47的结合及定性/定量评估
<ol>
	<li>按照上述第1节中1.1–1.10步骤制备的箔片试样或网片圆盘，用去离子水（DDW）清洗5次。将样品转移至新样品瓶中，再用去离子水额外清洗5次。最后用脱气乙醇清洗2次，再用脱气二甲基甲酰胺（DMF）清洗2次。</li>
	<li>通过将四甲基罗丹明（TAMRA）标记的pepCD47粉末溶于脱气二甲基甲酰胺（DMF）中，配制终浓度为1 mg/mL的TAMRA标记pepCD47储备液。将储备液分装为每份1 mL。在氩气氛围下密封保存于-20 °C。</li>
	<li>使用脱气DMF稀释1 mg/mL的TAMRA标记pepCD47储备液，配制以下浓度的荧光标记pepCD47溶液：10、30、100和200 µg/mL。 
	注意：若发现TAMRA标记pepCD47出现沉淀，可将储备液与TCEP beads按1:1比例混合，在室温下反应20分钟进行还原处理。注意在加入TAMRA标记pepCD47前，需先对TCEP beads溶液进行离心，弃去上清液后再加入TAMRA标记pepCD47。</li>
	<li>将PEI-PDT修饰的箔片试样分别与10、30、100或200 µg/mL的TAMRA标记pepCD47溶液在氩气氛围下室温振荡孵育1小时，每种条件设三个重复。同时将PEI-PDT修饰的网片圆盘以及仅完成1.2步骤处理的未修饰网片圆盘（裸金属对照）分别与100 µg/mL的TAMRA标记pepCD47溶液在氩气氛围下室温振荡孵育1小时，每组设三个重复。 
	注意：从本步骤开始，所有样品瓶均需用铝箔包裹以避光。</li>
	<li>按以下顺序清洗荧光标记pepCD47包被的表面，以去除非共价结合的多肽：DMF（3次）、DMF/DDW（1:1，1次）、DDW（3次）、含0.3% SDS的20 mM Tris缓冲液（pH 7.4）（3次，每次5分钟，70 °C振荡）、DDW（3次），更换样品瓶后进行最后一次DDW清洗。</li>
	<li>将对照组及共价结合的网片圆盘置于显微镜载玻片上，加入50 µL PBS缓冲液，盖上盖玻片。使用配备罗丹明滤光片组的倒置荧光显微镜观察网片圆盘，并在100倍放大倍数下拍摄代表性图像。</li>
	<li>将180 mg TCEP溶于甲醇与0.1 M乙酸缓冲液按1:1体积比配制的混合液中，配制15 mL浓度为12 mg/mL的TCEP溶液。</li>
	<li>将每次清洗后的箔片试样与1 mL TCEP溶液在室温下振荡孵育15分钟。</li>
	<li>使用TCEP溶液作为稀释液，对TAMRA标记pepCD47储备液（1 mg/mL）进行系列稀释，配制以下标准品：100 µg/mL、10 µg/mL、1 µg/mL、0.1 µg/mL和0.01 µg/mL。</li>
	<li>采用荧光分光光度法，在激发波长544 nm、发射波长590 nm条件下，根据上述标准品建立的标准曲线，分析从金属表面释放的TAMRA标记pepCD47含量。</li>
</ol>
3. 将人源 pepCD47 连接到 PEI-PDT 修饰的表面
<ol>
	<li>将按照上述第1节步骤1.1–1.10所述方法制备的PEI-PDT包被样品用脱气去离子水洗涤5次，更换离心管后，再用脱气去离子水洗涤5次。</li>
	<li>通过将人源pepCD47粉末溶解于脱气的50%乙酸中，配制浓度为1 mg/mL的人源pepCD47储备液。</li>
	<li>将500 µL人源pepCD47储备液溶于4,500 µL脱气的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制工作浓度为100 µg/mL的人源pepCD47溶液。</li>
	<li>将洗涤后的PEI-PDT包被样品在室温下以100 µg/mL pepCD47溶液振荡孵育1小时。</li>
	<li>按以下顺序洗涤人源pepCD47包被样品，以去除过量肽段：PBS（3次）、DDW（3次）、0.2% Tween-20（3次，每次5分钟）、DDW（3次），更换离心管后进行最后一次DDW洗涤。 
	注意：人源pepCD47包被的表面可在4 °C干燥保存长达6个月。</li>
</ol>
4. 在 PEI-PDT 修饰的表面涂覆随机序列（Scr）
<ol>
	<li>将乱序序列粉末溶于脱气的0.1%乙酸中，配制浓度为1 mg/mL的储存液。</li>
	<li>取500 µL上述储存液溶于4,500 µL脱气的0.1%乙酸中，制备浓度为100 µg/mL的乱序肽溶液。</li>
	<li>在室温下，将清洗后的PEI-PDT样品与100 µg/mL乱序肽溶液共同孵育，振荡处理1小时。</li>
	<li>为去除未结合的乱序肽，依次用以下溶液洗涤表面：0.01%乙酸（3次）、去离子水（3次）、0.2% Tween-20（3次，每次5分钟）、去离子水（3次），更换离心管后再进行一次去离子水洗涤。</li>
</ol>
5. 用于分析细胞在金属表面黏附的钱德勒循环系统
<ol>
	<li>根据第1节及第3或第4节所述方法，将人源pepCD47或乱序肽分别包被于金属箔片（0.65 cm × 1 cm）上。</li>
	<li>将¼英寸PVC管剪成三段，每段长38 cm。</li>
	<li>在三个不同的管中分别插入最多8片未经修饰、乱序肽修饰或pepCD47修饰的金属箔片。</li>
	<li>根据机构IRB协议，从健康人类供体采集30 mL血液，供体应未使用任何抗血小板药物。在注射器中预先加入1 mL 4%柠檬酸钠，以防止采集的血液发生凝固。</li>
	<li>使用10 mL注射器将10 mL血液注入每根管中，并用金属接头连接管的两端。将装有血液的管子放置于Chandler环路装置的转轮上。</li>
	<li>在37 °C条件下，以计算出可产生25 dyns/cm2剪切力的速度旋转转轮，使血液流经金属箔片，持续4小时。</li>
	<li>从管中排出血液，并根据IRB要求妥善处理废弃血液。</li>
	<li>使用手术刀切割管子，从每根管中取出箔片。</li>
	<li>取10 mL 4%戊二醛溶液，加入10 mL含0.1 M氯化钠的钠卡可代缓冲液稀释，配制2%戊二醛溶液。</li>
	<li>将箔片在2%戊二醛溶液中孵育15分钟，随后于4 °C过夜保存。分析前用PBS洗涤金属箔片3次。</li>
</ol>
使用 CFDA 染料分析细胞在金属表面的黏附
<ol>
	<li>将8 mL PBS加入15 mL离心管中，在设定为37 °C的水浴中预热。</li>
	<li>按以下步骤配制CFDA（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯）染料溶液：向一支CFDA染料小瓶中加入90 µL DMSO，得到10 mM的储存液浓度。接着，取75 µL上述CFDA储存液加入8 mL预热的PBS中，配制成93.75 µM的工作浓度。通过反复倒置混匀数次，并用铝箔包裹管口。 
	注意：建议每次使用前新鲜配制CFDA染料溶液。</li>
	<li>在24孔板中，每孔加入1 mL CFDA染料溶液并放入金属箔片。用铝箔覆盖板子，于37 °C孵育15分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤金属箔片3次，以去除多余的染料。使用倒置荧光显微镜进行成像。</li>
</ol>
7. 单核细胞在 pepCD47 修饰表面与裸金属表面的黏附及巨噬细胞的扩增
<ol>
	<li>在处死一只400–450 g雄性Sprague-Dawley大鼠期间，通过腔静脉穿刺采集10 mL外周血。立即加入1,000 IU肝素钠以防止凝血。</li>
	<li>将10 mL密度梯度介质移入50 mL锥形管中。将血液与5 mL PBS混合，使用巴斯德吸管将稀释后的血液小心地铺在密度梯度介质上方。在摆动桶转子中以800 x g、18–25 °C离心20分钟，加速度和减速度设置为最低。</li>
	<li>使用巴斯德吸管收集血浆与Ficoll界面处不透明的白膜层。用PBS按1:3比例稀释白膜层，然后在4 °C、550 x g条件下离心10分钟，以收集白膜层细胞。</li>
	<li>将白膜层细胞重悬于3 mL ACK裂解缓冲液中，以裂解污染的红细胞。冰上孵育4分钟。加入12 mL细胞分离缓冲液（CSB；含0.5% BSA、0.5% FBS、2 mM EDTA的PBS）。</li>
	<li>在4 °C、550 x g条件下离心10分钟。将沉淀重悬于10 mL CSB中。</li>
	<li>在4 °C、200 x g条件下离心10分钟以去除血小板。重复该步骤两次。</li>
	<li>将沉淀重悬于500 µL CSB中。加入以下每种小鼠抗大鼠抗体各10 µg：CD8a（克隆OX-8）、抗CD5（克隆OX-19）、抗CD45RA（克隆OX-33）和抗CD6（克隆OX-52）。</li>
	<li>在4 °C下于垂直管旋转仪上孵育1小时。加入9.5 mL CSB。在4 °C、300 x g条件下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL CSB中，并重复离心一次。</li>
	<li>将沉淀重悬于500 µL CSB中。加入150 µL羊抗小鼠IgG磁珠。在4 °C下于垂直管旋转仪上孵育20分钟。加入9.5 mL CSB。在4 °C、300 x g条件下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液。将沉淀重悬于1 mL CSB中。</li>
	<li>将LS柱安装至磁力分离器上。&#160; 用3 mL CSB预处理LS柱。弃去穿流液。加入步骤7.10所得的1 mL重悬细胞沉淀。开始收集穿流液。待液体流尽后，加入5 mL CSB，并持续收集穿流液直至流尽。</li>
	<li>将含有阴性筛选单核细胞的穿流液（6 mL）在4 °C、300 x g条件下离心10分钟。将所得少量沉淀重悬于2 mL RPMI-1640培养基中，培养基中添加10%胎牛血清（FCS）、1%青霉素-链霉素（pen/strep）和100 ng/mL大鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数单核细胞。将单核细胞浓度调整至5 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>将1 mL单核细胞悬液分别加入12孔板的各个孔中，每孔含有未处理的不锈钢箔样品（N=3）或经大鼠pepCD47修饰的不锈钢样品（N=3），样品制备依据步骤1.1–1.10和3.1–3.6。</li>
	<li>在接种后第3天和第5天更换培养基。接种后第6天，用PBS洗涤细胞，并在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。用PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>取出不锈钢箔片，分别转移至新的12孔板中。注意不要翻转箔片。</li>
	<li>用含0.5% Tween-20的PBS孵育15分钟以通透细胞。用PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>用含10%山羊血清的PBS封闭20分钟。吸除血清，不进行洗涤。加入小鼠抗大鼠CD68抗体（用含1% BSA的PBS按1:100稀释）。室温孵育1小时。用PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>加入羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 546抗体（用含1% BSA的PBS按1:200稀释）。室温避光孵育45分钟。用PBS洗涤5分钟。用1 µg/mL Hoechst 33342染料在室温下避光复染10分钟。用PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>翻转箔片，使用倒置光路的荧光显微镜进行成像。使用200倍放大倍数，结合蓝色和红色滤光片设置采集图像。</li>
	<li>在各图像中计数贴壁的单核细胞，并计算各组的平均值和标准差。</li>
</ol>

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<li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li>
<li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li>
<li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871(2014).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

我们展示并描述了一种相对新颖的化学策略，旨在将治疗性肽片段连接到不锈钢表面，其总体目标是降低该表面与血液中炎症细胞的反应性。本文所述的双膦酸盐化学涉及PABT的金属氧化物与双膦酸盐基团之间形成配位键。在金属表面形成的聚双膦酸盐单层厚度不超过5 nm18，因此不会产生厚聚合物涂层可能引发的潜在促炎效应20。PABT脂肪族侧链中潜伏的巯基去保护后，可使金属表面具备进一步与巯基反应性化合物进行化学修饰的条件。PEI-PDT是一种支化的聚乙烯亚胺（平均分子量Mw=25,000），其中约20%的乙烯亚胺连接位点被修饰为具有巯基反应性的吡啶二硫基团。由于在与PABT衍生的巯基反应过程中仅消耗了PEI-PDT中少数的PDT基团，因此在PEI-PDT接枝后，表面化学性质仍保持巯基反应性，从而能够连接含巯基的肽段18。该化学策略已在本实验室开发并广泛用于将多种生物分子（如重组蛋白14、肽段14,<...

经皮冠状动脉介入治疗是治疗冠状动脉疾病（CAD）的首选疗法，主要通过对病变动脉进行支架置入来实现。然而，支架内再狭窄（ISR）和支架内血栓形成是支架植入后常见的并发症1血液与支架界面的相互作用表现为血浆蛋白几乎立即在金属表面吸附，随后血小板和炎症细胞发生黏附与活化2活化的炎性细胞释放炎性细胞因子和趋化因子，可导致血管中膜层的血管平滑肌细胞（VSMCs）发生表型改变，并触发其向内膜腔室的向心性迁移。活化的VSMC在内膜层中增殖，引起内膜增厚、管腔狭窄以及支架内再狭窄。3药物洗脱支架（DES）的研发旨在抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖；然而，这些药物对内皮细胞具有脱靶性的细胞毒性作用。4,5因此，晚期支架内血栓形成是药物洗脱支架（DES）常见的并发症6,7由可生物降解聚合物（如聚-L-丙交酯）制成的支架在动物实验和早期临床试验中显示出良好前景，但在“真实世界”临床应用中因其性能劣于第三代金属药物洗脱支架而最终被召回rd 生成DES8因此，有必要提高金属裸支架的生物相容性，以改善患者的临床预后。
CD47 是一种广泛表达的跨膜蛋白，当其与相应的受体信号调节蛋白α（Signal Regulatory Protein alpha, SIRPα）结合时，可抑制先天免疫反应9。SIRPα受体含有免疫细胞酪氨酸抑制基序（immune cell tyrosine inhibitory motif, ITIM）结构域，SIRPα与CD47相互作用所触发的信号传导事件最终导致炎性细胞活化的下调10,11,12,13。本实验室的研究表明，重组CD47或其肽段衍生物（对应于CD47胞外区22个氨基酸组成的Ig结构域，即pepCD47）能够降低宿主对多种临床相关生物材料的免疫反应14,15,16。近期，我们已证实pepCD47可被固定于不锈钢支架表面，并显著减轻与再狭窄相关的病理生理反应。值得注意的是，经pepCD47修饰的表面可耐受长期储存和环氧乙烷灭菌等实际应用条件17。因此，pepCD47可能是解决血管内支架临床应用局限性的一个有效治疗靶点。
将 pepCD47 共价连接至金属表面的策略涉及对金属表面进行一系列新颖的化学修饰。首先，用含有潜伏性巯基的聚烯丙胺双膦酸盐（PABT）包覆金属表面，随后脱保护暴露出巯基，并连接带有吡啶二硫基团（PDT）的聚乙烯亚胺（PEI）。未参与与脱保护后 PABT 巯基反应的 PEI 上的 PDT 基团，进一步与含有末端半胱氨酸残基巯基的 pepCD47 反应，从而通过二硫键将 pepCD47 结合到金属表面14,17,18。我们使用荧光素标记的 pepCD47（TAMRA-pepCD47）来确定能够实现肽在表面最大固定量的肽投入浓度。最后，分别采用钱德勒循环装置（Chandler loop apparatus）和单核细胞黏附/巨噬细胞扩增实验，在离体条件下评估了包被 pepCD47 的金属表面的急性和慢性抗炎能力。
本文提供了一套系统的实验方案，用于将巯基化肽段固定到金属表面；测定肽段的最大固定密度；以及评估覆盖有pepCD47的金属表面在接触全血和分离的单核细胞时的抗炎特性。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>pH - 7.5</td></tr><tr><td>4% 戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16539-07</td><td></td></tr><tr><td>4% 柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>S5770</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Quality Biologicals</td><td>118-156-721</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD45RA 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-19）</td><td>Biolegend</td><td>202301</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD5 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-19）</td><td>Biolegend</td><td>203501</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD6 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-52）</td><td>BD Biosciences</td><td>550979</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD68 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 ED-1）</td><td>BioRad</td><td>MCA341</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD8a 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-8）</td><td>Biolegend</td><td>201701</td><td></td></tr><tr><td>氯仿，ACS 认证级</td><td>Fisher Chemical</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Alfa Aesar</td><td>39117</td><td></td></tr><tr><td>Embra 不锈钢载网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>E200-SS</td><td>不锈钢网状圆盘</td></tr><tr><td>Ficoll Hypaque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>ACROS organic</td><td>148930025</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 标记的山羊抗小鼠 IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>402-01</td><td></td></tr><tr><td>人源 pepCD47</td><td>Bachem</td><td>4099101</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A426P-4</td><td></td></tr><tr><td>金属接头</td><td>Leur Fitting</td><td>6515IND</td><td>单通接头 316 不锈钢 1/4&quot;-5/16&quot; 水嘴端</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>RICCA chemical company</td><td>4829-32</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾（KHCO3）</td><td>Fisher Chemical</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>PVC 管</td><td>Terumo-CVS</td><td>60050</td><td>1/4&quot; × 1/16 8'</td></tr><tr><td>含 0.1 M 氯化钠的二甲胂酸钠缓冲液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11653</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠（C2H3NaO2）</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184</td><td></td></tr><tr><td>Src 肽段</td><td>Bachem</td><td>4092599</td><td></td></tr><tr><td>带管腔的圆柱形不锈钢（AISI 304）样品</td><td>Microgroup, Medway, MA</td><td>20097328</td><td>1 cm × 6 mm 外径</td></tr><tr><td>不锈钢箔片（AISI 316L）</td><td>Goodfellow, Coraopolis, PA</td><td></td><td>100 mm × 100 mm × 0.05 mm</td></tr><tr><td>TAMRA 标记的 pepCD47（TAMRA-pepCD47）</td><td>Bachem</td><td>4100277</td><td></td></tr><tr><td>TMB（3,3&amp;rsquo; ,5,5&amp;rsquo; -四甲基联苯胺）底物及三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）</td><td>Thermo Scientific</td><td>PG82089</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFDA SE 细胞示踪试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

通过固定cd47衍生肽减少血液来源细胞在金属植入物上的黏附

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

金属裸支架和药物洗脱支架相关的主要并发症分别为支架内再狭窄和晚期支架内血栓形成。因此，提高金属支架的生物相容性仍然是一个重大挑战。本实验方案旨在介绍一种通过生物活性肽对金属表面进行修饰的可靠技术，以提高包括血管内支架在内的血液接触型医用植入物的生物相容性。CD47是一种具有种属特异性的“自我”免疫标志物，具有抗炎特性。研究表明，CD47胞外区免疫球蛋白结构域对应的22个氨基酸肽段（pepCD47）具有与全长蛋白相似的抗炎作用。本实验室在大鼠体内的研究以及在兔和人血液系统中的离体实验表明，将pepCD47固定于金属表面可通过抑制炎症细胞的黏附与活化来改善其生物相容性。本文详细描述了金属表面功能化及肽段固定的逐步操作流程。首先采用含潜伏性巯基的聚烯丙胺双磷酸酯（PABT）对金属表面进行修饰，随后脱保护释放巯基，并通过与含吡啶二硫基团的聚乙烯亚胺（PEI-PDT）反应，扩增巯基反应位点。最后，通过二硫键将含有终端半胱氨酸残基、并通过双8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基间隔臂连接至核心肽序列的pepCD47肽段共价连接至金属表面。该肽段固定方法高效且成本相对较低，因此可广泛应用于多种金属生物材料的生物相容性改良。

通过一系列化学修饰，使金属表面具有硫醇反应活性，从而实现多肽的固定，如图1所示。先用PABT孵育，再经PEI-PDT处理，使金属表面适合多肽的连接。含有C端半胱氨酸残基、并通过柔性双AEEAc连接臂与核心pepCD47序列相连的CD47多肽（pepCD47），可通过二硫键共价结合至具有硫醇反应活性的表面。采用该方案，我们已证明pepCD47可在金属表面稳定结合长达六个月，并能耐受正常的生理剪切力以及灭菌处理17。
通过将TAMRA标记的pepCD47肽连接至金属表面，随后进行充分洗涤以去除非共价结合的肽，再通过还原连接肽与表面的二硫键将TAMRA-pepCD47裂解，并采用荧光定量分析法进行分析，从而确定肽的最大保留量。具体而言，将不同浓度的TAMRA-conjugated pepD47（1 mL，10–200 µg/mL溶液）加入PEI-PDT包被的表面，多次洗涤以去除非共价结合的肽。通过使用还原剂TCEP释放共价结合的肽，并以其荧光强度对照标准品进行定量，从而确定共价结合...

本文介绍了一种利用聚双膦酸盐化学方法将肽CD47（pepCD47）偶联到金属支架上的实验方案。使用pepCD47对金属支架进行功能化修饰可防止炎性细胞的黏附与活化，从而提高其生物相容性。

通过固定CD47衍生肽减少血液来源细胞在金属植入物上的黏附

与金属裸支架和药物洗脱支架相关的主要并发症分别为支架内再狭窄和晚期支架内血栓形成。因此，……

本方案包含一种新颖的化学策略，可将治疗性肽段连接到金属表面，有望提高多种金属生物材料的生物相容性。这是一种通用且稳健的技术，可用于将肽段和治疗性蛋白质连接至生物植入物的裸露金属表面。我们已利用该技术通过在金属支架表面连接CD47肽段，以预防支架植入引发的炎症反应，从而改善其生物相容性。首先将不锈钢箔片试样或网状圆片置于摇床中，用异丙醇-2清洗5分钟。重复此步骤两次，随后用氯仿清洗样品两次，每次10分钟。将清洗后的不锈钢样品放入220摄氏度的烘箱中加热30分钟。将焙烧后的箔片或网状圆片浸入0.5%的PABT水溶液中，在摇床中孵育一小时。用去离子蒸馏水洗涤PABT修饰的样品五次。将样品转移至新的小瓶中，并重复洗涤步骤。将样品加入TCEP后，在摇床中室温孵育15分钟。使用真空装置（如冷冻干燥机）对圆底烧瓶中的去离子蒸馏水进行脱气，并用脱气后的水洗涤箔片或网状圆片五次。将样品转移至新的小瓶中，并重复洗涤步骤。通过将212.5微升的储备PEI-PDT溶液和125微升0.4摩尔的醋酸钠溶液加入脱气水中，配制5毫升1%的PEI-PDT溶液。将清洗后的不锈钢样品与1% PEI-PDT溶液孵育，用氩气置换空气，密封瓶口，于摇床中反应一小时。立即进行肽偶联，或将样品在4°C下保存最多一周。通过将人源肽CD47粉末溶解于脱气的50%乙酸中，配制1毫克/毫升的人源肽CD47储备液，然后将500微升储备液溶解于4.5毫升脱气的PBS中，制备工作液。将洗涤后的PEI-PDT包被样品与肽CD47工作液在室温下振荡孵育一小时。实验结束后，按照文稿中的描述清洗CD47肽段包被的样品。将金属箔分别用CD47肽段或乱序肽段包被后，将四分之一英寸的PVC管切成三段，每段38厘米长，并将最多八片未经修饰、乱序肽段修饰或CD47肽段修饰的金属箔分别插入三个不同的管中。从健康人类供体采集30毫升血液，供体应未使用任何抗血小板药物，并在采血前用1毫升4%柠檬酸钠预填充注射器，以防止血液凝固。使用10毫升注射器将10毫升血液注入每根试管中，并用金属接头连接两端。将装有血液的试管放置在Chandler循环装置的转轮上，通过转轮旋转使血液在37摄氏度条件下沿金属箔流动4小时。从试管中排出血液，并根据机构审查委员会（IRB）的要求进行处理，然后用手术刀切割试管以取出金属箔。通过将70%的戊二醛溶液用含0.1摩尔氯化钠的二甲胂酸钠缓冲液稀释，配制2%戊二醛溶液。将金属箔片置于2%戊二醛溶液中孵育15分钟，并在4摄氏度下保存过夜。在分析金属箔片前，用PBS洗涤三次。将8毫升PBS置于37摄氏度水浴中预热。通过向一支CFDA小瓶中加入90微升DMSO来配制10毫摩尔的CFDA储备液，然后将75微升CFDA储备液加入预热的PBS中，配制工作液。轻轻颠倒混匀数次，并用铝箔纸包裹管子。将每片金属箔放入24孔板中的1毫升CFDA染料中。用铝箔覆盖24孔板，并在37°C下孵育15分钟，随后用PBS洗涤金属箔3次，然后使用荧光显微镜观察成像。通过定量共价结合的TAMRA标记肽CD47的浓度，确定该肽在金属表面的最大固定密度。最大肽保留量约为每平方厘米180纳克，该值在输入浓度为100微克/毫升时达到。通过荧光显微镜进一步证实了TAMRA标记的CD47肽在修饰金属表面的固定化，结果显示经TAMRA标记的CD47肽处理的网状圆片表面发出均匀的荧光。而在未经修饰的对照组网格表面仅检测到极微弱的荧光，从而排除了非特异性结合的TAMRA标记CD47肽作为主要荧光来源的可能性。还证实，与随机序列修饰及未修饰肽对照相比，CD47肽包被表面显著减少了血液来源细胞的黏附。从大鼠血沉棕黄层细胞中分离的单核细胞被培养在裸金属以及CD47肽修饰的不锈钢箔上。在功能化表面上，急性单核细胞黏附、其向巨噬细胞的转化以及巨噬细胞增殖均减少了58%。在进行本方案时，使用脱气水或试剂的步骤必须尽快完成，并尽量减少与氧气的接触。我们的技术可选择性地调控细胞与金属表面的相互作用，且该技术可兼容典型的细胞类型鉴定实验，如RT-PCR、流式细胞术和免疫荧光。当该技术被应用于多种生物活性肽时，可在组织与材料界面处显著提升生物相容性。

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生物工程

通过CD47衍生肽固定，缓解血系细胞附着到金属植入物

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本方案描述了使用激光切割神经血管植入物对血液接触类器械进行全面血液相容性评价的方法。采用新鲜肝素化人血构建循环流动模型以模拟血液流动。灌注后，分析多种血液学指标，并与采血后立即测得的数值进行比较，以评估被测器械的血液相容性。...

模拟人体血流的循环流动模型中血液接触型植入物的血液相容性测试

血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成

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用于植入物的金属与关节软骨对磨的生物摩擦学测试与分析

在此，我们介绍一种从血小板裂解物（PL）中分离细胞外囊泡（EVs）并将其用于钛（Ti）种植体表面涂层的方法。我们描述了液滴涂覆法、EVs从表面的释放曲线，以及 体外...

血小板来源的细胞外囊泡对钛植入物的功能化修饰

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小鼠植入物相关感染的动物模型

了解将CD47衍生肽固定到金属植入物表面的化学策略，用于改善不锈钢支架的生物相容性并减少炎症细胞附着。该方法可应用于多种金属生物材料。

通过固定CD47衍生肽减少血液来源细胞在金属植入物上的黏附

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