小鼠模型中缺血再灌注损伤后延迟的心肌内干细胞递送

缺血性损伤会诱导产生一种具有敌意的促炎性环境，影响移植细胞的存活。本方案提出了一种绕过损伤初期免疫反应的生物制剂递送替代方法。该方案的主要优势在于，可在损伤后一周给予治疗干预，从而模拟临床治疗环境。

我们的主要研究重点是缺血再灌注损伤模型以及干细胞的移植。然而，该方法也可用于涉及引入生物治疗的炎症性疾病模型。首先对所有手术器械进行高压灭菌。

若在同一手术过程中需进行多个手术操作，应在每只动物手术后清洁器械，并使用高温珠式灭菌器重新灭菌。皮下注射镇痛剂，称量动物体重，并将体重数值输入呼吸机。剃除左侧胸部从胸骨至肩部水平区域的毛发，并涂抹脱毛膏以去除残留毛发。

为防止肺塌陷，在缺血再灌注操作过程中维持呼气末正压为2厘米水柱，并在延迟细胞注射操作过程中将其调整为3厘米水柱。麻醉小鼠后，使用20号气管导管进行气管插管，并将其转移至可控加热垫上，以维持体温在35至37摄氏度。将小鼠置于侧卧位，头端朝左，尾端朝右。

用聚维酮碘和酒精棉片交替擦拭手术区域，共三次，并在双眼涂抹眼用软膏。使用10号刀片在视野中左侧最外侧乳头右侧2.5毫米处做一垂直切口，然后用剪刀剪开浅层肌肉层，直至露出肋间肌和肋骨。在提起肋骨及周围组织的同时，剪开第四与第五肋骨之间的肋间间隙，随后将眼睑拉钩插入打开的空间中。

使用弯头镊子向后牵拉心包膜，将肺组织向上移出视野。在左心耳远端2.5毫米处、位于LAD冠状动脉下方的心肌组织中穿入9-0尼龙缝线，操作时保持动作平稳连贯，避免撕裂组织或刺破主要血管。打一个松散的方结，然后将一段1厘米长的聚乙烯导管置于该松散结内。

用缝线固定导管并确认缺血，观察到苍白和心室心律失常后，35分钟后松开。移除导管后，等待5分钟以确认心肌再灌注。将一根24号静脉留置导管插入胸腔，位置位于切口右侧一个肋间隙处。

使用6-0可吸收缝线以单纯间断缝合方式关闭肋间切口，以连续缝合方式关闭肌肉层。缝合浅层肌肉层后，在用1毫升结核菌素注射器抽出胸腔内空气的同时拔除胸腔引流管。使用6-0可吸收缝线以连续水平褥式缝合方式关闭皮肤切口。

操作结束后，皮下注射1.5毫升温热的生理盐水，并在切口部位涂抹三联抗生素软膏以预防感染。将小鼠转移至无垫料的笼子或垫料被覆盖的笼子中，置于35至37摄氏度的加热垫上，直至其完全恢复。按照前述方法完成小鼠的准备和插管后，使用剪刀和镊子拆除皮肤层的缝线，然后用10号手术刀片在前次手术相同位置做切口。

继续切开瘢痕组织，直至可见肌层缝线，然后使用剪刀和镊子拆除缝线并切开肌层。拆除固定肋骨的缝线，并从先前的切口处继续切开肋间肌。将眼睑拉钩置入肋间间隙，找到先前结扎的部位。

将300,000个悬浮于20微升PBS中的间充质干细胞加入30号胰岛素注射器中，并将针头轻微弯曲，以获得合适的注射角度。从心尖向心脏基底部方向移动，将注射器插入梗死周边区域，直至针头开口完全进入心肌，然后缓慢将细胞注入心肌，等待3秒后拔出针头。密切观察心脏3分钟，确保细胞注射未引起心室颤动等异常反应。

三分钟后，在切口右侧的相邻肋间隙处将一根24号静脉导管插入胸腔。缝合肋间肌和皮肤层，并按照前述方法拔除胸管。皮下注射1.5毫升温热生理盐水，并在切口部位涂抹三层抗生素软膏以预防感染。

将小鼠转移至无垫料的笼子或垫料被覆盖的笼子中，并置于加热垫上，直至其完全恢复。在干细胞移植前一日进行术后超声心动图和心电图检查，确认心肌梗死及心室收缩功能下降。进一步数据分析显示，接受缺血性损伤的小鼠射血分数和缩短分数均降低，而舒张末期和收缩末期容积增加。

损伤后7天的心肌组织Masson三色染色显示，接受缺血损伤的小鼠心脏中胶原沉积增加，且左心室壁变薄。在间充质干细胞（MSC）移植后的次日进行活体生物发光成像（BLI）。与仅诱导缺血再灌注损伤但未接受MSC移植的小鼠相比，BLI信号表明MSC成功递送。

进行该方案时，需注意在切开肋间肌、结扎血管以及注射细胞时进行微小而有控制的移动，这对于防止视野中心脏或肺部受到不必要的损伤至关重要。这些操作可实现通过超声成像监测移植后的心脏功能、通过生物发光成像评估细胞活力，或根据所采用的治疗手段，进一步应用其他分子或生化技术进行分析。