Name: 牛磺胆酸钠诱导C57BL / 6小鼠严重急性胰腺炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习使用牛磺胆酸钠逆行灌注法在C57BL/6小鼠中诱导急性胆源性胰腺炎，研究早期炎症反应及胰腺组织病理变化。该方法可快速复制人类胰腺炎病理特征，适用于药物干预和免疫反应研究。

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作者感谢圣保罗大学临床医学研究生项目、高等教育人员培训协调机构（CAPES）以及圣保罗大学医学院（FMUSP）的支持。

本方案已获得圣保罗大学医学院动物使用伦理委员会批准，项目编号：1343/2019-CEUA：FMUSP。本方案使用6周龄、体重为20 ± 2 g的C57BL/6小鼠（n = 9/组）。
1. 开腹手术
<ol>
	<li>使用赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮溶液（80 mg/kg）进行皮下注射（0.1 mL/10g 体重），注射器规格为1 mL，针头规格为26G ½（13x0.45mm），以麻醉动物。通过夹捏脚趾检查麻醉深度是否足够。使用加热垫控制体温。确保所有手术器械均处于无菌状态。</li>
	<li>用5%聚维酮碘溶液清洁腹部区域，并使用剃毛器去除胸部至下腹部之间的毛发（约2 cm2）。再用70%酒精清洁手术区域。</li>
	<li>使用手术胶带将动物固定在手术板上。用剪刀在腹部上部、剑突下方约1 cm处横向剪开皮肤5 mm。在腹膜上重复相同切口。此操作将实现腹腔的小切口暴露。</li>
</ol>
2. 定位并暴露胰腺
<ol>
	<li>借助拉钩，将肝脏向小鼠头部方向牵拉，使其距离肠道约 1 cm。</li>
	<li>确定将注射牛磺胆酸钠的胰腺区域（胰头）。以肝脏为参照，十二指肠位于肝脏下方右侧（当观察小鼠时为左侧）。十二指肠是小肠的起始部分，与胃的末端相连。</li>
	<li>借助镊子，将肝脏向动物头部方向提起，并轻轻牵拉小肠段。用 6-0 聚丙烯缝线固定小肠两侧端，以更好地显露胆总管的远端部分。</li>
</ol>
3. 重症急性胰腺炎诱导
<ol>
	<li>使用微血管夹暂时阻断近端胆总管，以防止逆向灌注液渗漏至肝脏。胆总管位于十二指肠的肝脏侧，其与十二指肠连接处呈白色。将器官暴露于腹腔外。</li>
	<li>用连接直径0.54 mm聚乙烯导管的0.4 mm针头穿刺壶腹周围区域（小肠壁的灰白色部分），进入胆总管。</li>
	<li>用8-0缝线暂时阻断远端胆总管，防止牛磺胆酸钠溶液渗入十二指肠。</li>
	<li>启动输液泵，以每10 g体重10 µL的速度，持续3分钟恒速灌注2.5%牛磺胆酸钠溶液（用0.9%生理盐水稀释）。</li>
	<li>灌注结束后，移除微血管夹、临时8-0缝线以及胆胰管内的注射针头，以恢复胆汁的生理性流动。</li>
	<li>最后，用6-0非吸收性单丝聚丙烯缝线缝合腹腔。从开腹至缝合结束的时间应控制在30分钟以内（见图1）。</li>
	<li>术后将动物饲养于铺有木屑的聚乙烯箱中，并自由供应水和食物（ad libitum）。</li>
	<li>对照组小鼠的处理方式与实验组相同，但确保灌注液仅为生理盐水。在对照组（假手术组，SHAM）中实施相同的手术操作并灌注生理盐水溶液（10 mL/min，持续3分钟），以消除手术和插管引起的炎症偏倚。</li>
	<li>术后恢复后开始，每8小时皮下注射一次曲马多，剂量为12.5 mg/kg。</li>
</ol>
4. 分析方法
<ol>
	<li>在诱导急性胰腺炎（AP）12小时后，使用赛拉嗪（xylazine，10&#160;mg/kg）和氯胺酮（ketamine，80 mg/kg）对动物进行麻醉，通过眶后静脉丛采集约250 µL血液。
	<ol>
		<li>轻轻抓住背部皮肤，使眼球轻微突出，并将动物头部调整至眼睛朝上位置。</li>
		<li>在动物眼睛中滴入一滴含局部麻醉剂的眼药膏。</li>
		<li>将毛细管末端置于眼内角，以约30°–45°的角度轻轻插入眼球下方。旋转毛细管直至血液开始流出。注意：操作过程中无需施加力量。</li>
		<li>采集完成后，用纱布轻压闭合眼睑以确保止血。将毛细管丢弃至锐器容器中19。</li>
		<li>离心血清（700 × g，15分钟），收集上清液用于淀粉酶和IL-6检测（步骤4.7和4.8）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用CO2窒息法处死小鼠。</li>
	<li>使用27 G针头向腹腔内注射4 mL预冷的1×PBS。拉紧腹部皮肤，确保针头缓慢进入腹膜腔，避免刺穿任何器官。注射后，轻轻按摩腹腔10秒，以释放黏附于腹膜的细胞。</li>
	<li>使用剪刀和镊子在内层皮肤和肌肉上做一小切口（0.5 cm），暴露腹腔。将橡胶头吸管插入腹腔并收集液体。注意避免吸入脂肪组织或其他器官。</li>
	<li>尽可能收集全部液体，并将所得细胞悬液转移至预冷的离心管中。将橡胶头吸管丢弃至锐器容器中&#160;20。离心腹腔液（250 × g，5分钟），收集上清液用于IL-6检测（步骤4.9）。</li>
	<li>采集邻近十二指肠的胰腺组织（&#60;5 mm）。</li>
	<li>将胰腺组织用10%福尔马林固定，随后进行石蜡包埋。
	<ol>
		<li>对切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，于光学显微镜下进行组织病理学分析。采用Schmidt评分方案21（评估胰腺水肿、腺泡细胞损伤/坏死、胰腺炎症）来评估AP严重程度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据试剂盒说明书，使用市售试剂盒测定淀粉酶活性（U/dL）。</li>
	<li>根据试剂盒说明书，使用Luminex检测法测定IL-6水平。</li>
	<li>如需保存，将步骤4.1和4.4中获得的血清及腹腔液上清置于-80 °C冰箱中冻存。</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+different+clinical+features+between+hypertriglyceridemia+and+biliary+acute+pancreatitis%3A+A+retrospective+study+of+730+patients+from+a+tertiary+center%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center.</a> BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过逆行注入牛磺胆酸钠诱导急性胰腺炎的方法已在大鼠中得到证实22,23,24。2008年、2010年和2015年发表的三项类似研究为本实验方案提供了参考依据3,14,15。在本研究中，我们列出了在C57BL/6小鼠中重现该方法的全部关键步骤以及一些可能的验证方法。
该实验的关键步骤是在肝门水平使用微血管夹阻断胆管（步骤 3.1），以防止牛磺胆酸钠反流至肝脏。此步骤需格外小心，因为门静脉紧邻胆管（图 1D），必须注意避免同时夹闭门静脉。穿刺针应仅插入胆管最远端部分。若针头深入胆管内部，可能导致胆管破裂，使酸液溢出至腺体实质和/或其他胆管<sup class...

在人类中，胆结石的存在是胰腺炎最常见的病因，这是因为胆结石阻塞了胆总管的末端部分，阻碍了胰液的流动，从而在胰腺内引发强烈的炎症反应，并导致血清中消化酶浓度升高以及炎性介质增加1,2。
已有两种不同的理论被提出，用于解释急性胰腺炎（AP）的发生发展机制。 &#34;公共通道&#34; 理论认为，胆囊中存在的结石会阻塞远端胆总管系统，导致胆汁分泌逆流进入胰管。第二种理论（ &#34;导管阻塞&#34; 理论认为，过多的胆结石阻塞胰管，导致胰液无法流入十二指肠，从而引起胰管内高压3尽管导致急性胆源性胰腺炎的机制尚未完全阐明，但其结果是一种强烈的炎症反应。消化酶的释放和胰腺的自我消化可引起组织病理学改变，腹水和血清中炎症性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平升高，以及急性期蛋白增加4,5,6.
重症急性胰腺炎是一种因累及多个器官且死亡风险较高而需要临床关注的疾病。用于复制急性胰腺炎（AP）的动物模型具有重要意义，因为这些模型能够阐明疾病的病理生理机制，并有助于监测从疾病早期阶段开始的炎症事件的演变过程，而这一点在临床实践中通常难以实现2,7。此外，在临床前研究中易于获取胰腺组织，有利于阐明与临床状况相关的改变8，同时还可以使用同基因型物种进行实验，消除不必要的变量，并使研究结果与人类疾病表现具有临床相似性9。
在科学文献中，常研究用于在大鼠和小鼠中诱导急性胰腺炎的胆源性和非胆源性模型。非胆源性诱导方法包括给予胆囊收缩素促泌剂或其类似物雨蛙素的超大剂量10；给予接近致死剂量的L-精氨酸；或给予胆碱缺乏并补充乙硫氨酸的饮食11。尽管这些方法易于复制并可导致胰腺炎症，但它们并不能模拟理论上引发急性胰腺炎（AP）的机制（即胆汁分泌物反流入胰管）。针对胆源性模型的技术基于将胆汁酸逆行灌注至胰管，该操作需要经过良好训练的研究人员来实施。已有若干研究报道了在大鼠中使用该方法（显然出于技术原因，因为这些实验涉及外科手术操作）12,13。然而，在小鼠中采用该方法可能在炎症研究中提供更有意义的结果3,14,15。在本研究中，我们将展示在C57BL/6麻醉小鼠中通过灌注牛磺胆酸钠诱导重度急性胰腺炎时需遵循的步骤清单。
对于涉及抗体实验以及基因和蛋白质表达分析的研究，使用小鼠更为理想，因为针对这些动物可用的实验材料更为丰富，并且可以使用同基因型和基因敲除品系等，适用于相关研究16。C57BL/6 小鼠是一种近交系小鼠，最初开发用于抗肿瘤活性和免疫学研究。由于该品系具有同基因型特性，能够提高实验结果的可重复性，从而可能减少实验所需的动物数量，并降低同一组内结果的变异性，因此正越来越受到研究人员的青睐17,18。
Perides 等人（2010）14 发表了一项通过牛磺胆酸钠输注在小鼠中诱导急性胰腺炎（AP）的实验方案。本文在此基础上进行了优化，采用更高浓度的牛磺胆酸钠（2.5%）在 C57BL/6 小鼠中进行输注，并明确了输注体积和速度（图 1）。小鼠在造模后 12 小时内达到最严重的病理程度。血清和腹腔内 IL-6 浓度的升高与 AP 的进展呈正相关。经过练习后，每只动物从麻醉诱导到输注完成的总耗时约为 25 分钟。本实验必须由经过培训的研究人员操作。为确保溶液准确注入胆总管，建议使用亚甲蓝代替牛磺胆酸钠进行多次预实验训练。

<table><tbody><tr><td>0.4 mm 针头</td><td>INTRAG MEDICAL TECH</td><td>90183210</td><td>30G</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;0.54 mm 聚乙烯管</td><td>Tygon</td><td>730010</td><td>-</td></tr><tr><td>泡沫塑料块</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>用于固定小鼠的遮蔽胶带</td><td>Missner</td><td>1236</td><td>-</td></tr><tr><td>输注泵设定为 10&amp;micro;L / min</td><td>Havard aparatus-Peristaltic Pump Series</td><td>MA1 55-7766</td><td>&amp;nbsp;Model 66 Small Peristaltic</td></tr><tr><td>剪刀和镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗菌聚维酮碘</td><td>Pfizer</td><td>12086OR</td><td>抗菌处理</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>SIGMA</td><td>459836</td><td>将 700 mL 100% 乙醇与 300 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 混合</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Lord</td><td>bdk9a1ghk6</td><td>用于脱毛</td></tr><tr><td>牛磺胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86339- 1G</td><td>CAS 编号- 345909-26-4</td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>Medicon Surgical</td><td>56.87.35</td><td>吻合器，开口 4.0 mm，闭合压力 30 -&amp;nbsp;40 g</td></tr><tr><td>6-0 Prolene 缝线</td><td>Bioline</td><td>5162</td><td>缝合线</td></tr><tr><td> Ketamin NP（右旋氯胺酮盐酸盐）50mg/mL</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 2%</td><td>Syntec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水（0.9% (wt/vol) 盐水）</td><td>Farmace</td><td>105851</td><td></td></tr><tr><td>甲基蓝</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>M5528</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX&amp;nbsp;MAP&amp;nbsp;小鼠细胞因子/趋化因子磁珠检测试剂盒 - 免疫学多重检测</td><td>MERCK</td><td>MCYTOMAG-70K</td><td>利用 Luminex 技术，通过基于磁珠的多重检测方法，同时分析小鼠血清、血浆和细胞培养样品中的多种细胞因子和趋化因子生物标志物。</td></tr><tr><td>淀粉酶检测</td><td>Labtest</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>Desmarres 拉钩 13-mm&lt;br/&gt; 宽度</td><td>ROBOZ</td><td>RS-6672</td><td></td></tr></tbody></table>

c57bl/6小鼠中牛磺胆酸钠诱导的重度急性胰腺炎

Sodium Taurocholate Induced Severe Acute Pancreatitis in C57BL/6 Mice

通过输注牛磺胆酸钠诱导胆源性急性胰腺炎的方法已被科学界广泛使用，因其能够模拟人类临床状况，并再现与临床胆源性胰腺炎发病相对应的炎症事件。胰腺损伤的严重程度可通过输注胆汁酸的浓度、速度和体积进行评估。本研究提供了该实验方案重现过程中所用材料与方法的更新版清单，并展示了此急性胰腺炎（AP）模型的主要结果。以往大多数文献仅限于在大鼠中复制该模型。我们已将此方法应用于小鼠，这具有额外优势（例如，针对小鼠可获得大量试剂和抗体，且可使用基因修饰小鼠品系），对相关研究具有重要意义。针对小鼠急性胰腺炎的诱导，我们提出了一套系统化的操作流程：在C57BL/6小鼠中以10 µL/min的速度输注2.5%牛磺胆酸钠持续3分钟，可在诱导后12小时内达到最大损伤程度，并展示了验证该方法有效性的结果指标。通过熟练的操作技术，从麻醉诱导到输注完成的总耗时约为每只动物25分钟。

根据Schmidt评分标准21，胰腺炎严重程度评分范围为0-3分，其中0分表示无病变，1分表示轻度存在（&lt;25%），2分表示中度存在（25%至50%之间），3分表示重度存在（&gt;50%）（表1）。检测指标包括血浆淀粉酶活性、胰腺水肿、腺泡细胞损伤/坏死、胰腺炎症（通过H&amp;E染色切片的组织学分析）以及血清和腹腔灌洗液（PerC fluid）中IL-6细胞因子浓度。在重度急性胰腺炎（AP）发生12小时后，APTA组血清淀粉酶浓度较假手术组显著升高（分别为6194 ± 336.7 U/dL 和 3845 ± 135.7 U/dL）。同时，APTA组血清和腹腔灌洗液中的IL-6细胞因子浓度也升高（图2）。图3展示了假手术组与APTA组典型的苏木精-伊红（hematoxylin-eosin）染色结果。...

重症急性胰腺炎的动物模型可用于研究疾病初始阶段的病理生理变化，有助于观察炎症事件的发展过程。本文提供了一种通过逆行输注牛磺胆酸钠至麻醉C57BL/6小鼠胰管以诱导重症急性胆源性胰腺炎的实验方案。

C57BL/6小鼠中牛磺胆酸钠诱导的重度急性胰腺炎

通过灌注牛磺胆酸钠诱导胆源性急性胰腺炎的方法已被科学界广泛使用，因其能够代表……

该方法可用于重现急性胆源性胰腺炎中发生的炎症事件。它使得研究胰腺组织在早期阶段的变化成为可能，而这种情况在临床中通常难以实现。该技术的主要优点在于，对于经过训练的研究人员而言，操作快速且易于重复，同时能够产生与人类急性胰腺炎相似的病理结果。该方法可用于研究药物分子及其他治疗干预措施的药理学免疫反应，因为它能够对胰腺及邻近器官中的炎症介导细胞进行分析。在实施本方案时，定位器官并确定插管区域至关重要。应先熟记各器官的位置，并首先使用染色溶液（如亚甲蓝）练习注射操作。通过脚趾夹捏法确认麻醉深度后，用5%聚维酮碘溶液清洁麻醉小鼠的腹部区域。使用剃毛器去除胸部至下腹部之间的毛发，并用70%酒精清洁约两平方厘米的手术区域。将动物固定在手术板上，用剪刀在腹部上部、剑突下方约一厘米处，横向剪开约五毫米的皮肤切口。重复切开腹膜，以进行剖腹手术，同时尽量减少腹腔暴露。使用牵开器将肝脏向头部方向牵拉，距离肠道约一厘米，找到胰腺和十二指肠区域。使用镊子将肝脏向上（向动物头部方向）提起。轻轻牵拉小肠段，用6-0聚丙烯缝线固定两侧端部，以便更好地观察胆总管远端。使用微血管夹暂时阻断近端胆总管。将器官暴露于腹腔外。然后用8-0缝线暂时阻塞远端胆总管。为进入胆总管，需穿刺壶腹周围区域，该区域表现为小肠壁上颜色较白的部分。使用连接至0.54毫米聚乙烯管的0.4毫米针头，启动输注泵，以每10克体重10 µL的速度持续输注2.5%牛磺胆酸钠溶液，持续3分钟。灌注完成后，从胰胆管上移除微血管夹、临时的8-0缝线以及注射针头。使用6-0不可吸收单丝聚丙烯缝线缝合腹部。从剖腹手术开始至缝合结束的时间不应超过30分钟。手术后，将动物饲养在铺有木屑的聚乙烯盒中，并可自由获取水和食物。轻轻握住动物，将皮肤向后拉，使眼球轻微突出，将动物置于眼睛朝上的位置。在动物的眼中滴入一滴含有局部麻醉剂的眼药膏。将毛细管的一端置于眼睛内眼角，以约30至45度的角度轻轻插入眼球下方。旋转毛细管直至开始有血液流出。采集完成后，通过轻压闭合眼睑以确保止血。随后，使用27号针头将4毫升冰冻PBS注入小鼠腹腔内。注射后，轻轻按摩腹膜10秒，以释放黏附的细胞。使用剪刀和镊子，在内层皮肤和肌肉上做一处0.5厘米的小切口，暴露腹腔。将球形吸管插入腹膜腔，尽可能收集液体，注意避免吸入脂肪组织。从胰腺头部区域取一部分组织用于后续处理。将收集的液体注入预冷的离心管中。然后将腹腔液在250 × g条件下离心5分钟，并收集上清液用于白细胞介素-6的检测。为获取血清，将采集的血液样本在700 × g条件下离心15分钟，并收集上清液用于淀粉酶和白细胞介素-6的检测。急性胰腺炎诱导后12小时对胰腺组织进行分析，结果显示与假手术组的组织样本相比，病变器官出现明显的炎症反应。假手术组和APTA组的组织样本经苏木精-伊红染色后，组织学检查显示了相似的结果。血清

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医学

牛磺胆酸钠诱导C57BL / 6小鼠严重急性胰腺炎

本视频介绍了通过胰腺输注牛磺胆酸钠建立急性胆源性胰腺炎小鼠模型的操作步骤。该模型有助于研究牛磺胆酸钠在胰腺中诱导的病理生理学变化。...

急性胆源性胰腺炎模型：通过胰管灌注建立小鼠急性胆源性胰腺炎模型的方法

慢性胰腺炎（CP）是一种以胰腺炎症和纤维化为特征的疾病，常伴有难以缓解的腹痛。本文重点优化通过胆管输注2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）建立小鼠CP模型的技术。...

通过胆管TNBS灌注建立小鼠慢性胰腺炎模型

本文描述了一种重症急性胰腺炎的小鼠模型。本方案操作快速、简便且易于实施，因此可能为方便地研究急性胰腺炎的分子机制及不同治疗干预措施提供有效手段。...

通过逆行注射牛磺胆酸钠至胆胰管建立小鼠重症急性胰腺炎模型

腹腔内给药是一种安全有效的非侵入性方法，可用于诱导胰腺损伤。本研究比较了五种不同的小鼠腹腔注射方案，以诱导不同程度的胰腺损伤，并建立重度胰腺损伤模型，用于探讨重症急性胰腺炎（SAP）的病理变化及治疗策略。...

通过雨蛙素与脂多糖腹腔注射联合制备小鼠重症急性胰腺炎模型

本视频介绍了如何对已插管及自主呼吸的患者进行CO2测量。主要临床适应证涉及急诊情况：（1）确认气管插管位置是否正确；（2）在创伤患者中维持正常二氧化碳水平；（3）在程序性镇静过程中监测通气状况。...

过期的一氧化碳2 急诊科有创通气或自主呼吸患者的测量

一种用于研究急性肺损伤的呼吸机诱导肺损伤小鼠模型 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位...

压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

我们描述了中度和重度缺血-再灌注诱导的肾损伤小鼠模型，其中小鼠分别接受单侧肾蒂夹闭后同时或延迟对侧肾切除术。这些模型均能稳定地导致肾功能障碍和损伤后纤维化，但损伤严重程度和存活率取决于小鼠品系、年龄及手术器械。...

小鼠急性肾损伤的缺血-再灌注模型及损伤后纤维化

急性脑损伤是一种目前尚无有效治疗方法的严重创伤。多光子显微镜技术可实现对急性脑损伤在啮齿类动物中发展过程的纵向研究，并用于探索治疗策略。通过多光子显微镜研究的两种急性脑损伤模型包括 体内...

小鼠急性脑损伤后纵向双光子成像

将bm12淋巴细胞移植到C57BL/6受体小鼠体内是系统性红斑狼疮的成熟动物模型。本文介绍如何利用该模型诱导疾病发生，并通过流式细胞术对滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞和浆细胞进行表征分析。...

C57BL/6小鼠中系统性红斑狼疮（SLE）的bm12可诱导模型

小鼠远端结肠造口术为人类分流性结肠炎提供了一种小鼠模型，该模型表现为粪流绕行的结肠节段中以淋巴细胞性为主的结肠炎。...

小鼠远端结肠造口术：C57BL/6 小鼠分流性结肠炎的新模型

学习使用牛磺胆酸钠逆行灌注法在C57BL/6小鼠中诱导急性胆源性胰腺炎，研究早期炎症反应及胰腺组织病理变化。该方法可快速复制人类胰腺炎病理特征，适用于药物干预和免疫反应研究。

C57BL/6小鼠中牛磺胆酸钠诱导的重度急性胰腺炎

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