本方案描述了一种基于RNA-Seq的嘌呤核苷酶（PN，EC:3.2.2.1）基因挖掘与序列分析方法。采用ProtProm分析揭示PN独特的二级和三级结构。此外，从转录组中克隆PN基因，以验证RNA-Seq结果的可靠性。
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本方案描述了一种基于RNA-Seq的嘌呤核苷酶（PN，EC:3.2.2.1）基因挖掘与序列分析方法。采用ProtProm分析揭示PN独特的二级和三级结构。此外，从转录组中克隆PN基因，以验证RNA-Seq结果的可靠性。
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是最具价值的真菌类中药之一，含有丰富的活性成分，如腺苷。腺苷被认为是一种具有多种抗肿瘤和免疫调节活性的生物有效成分。为了进一步阐明嘌呤核苷酶（PN）在腺苷生物合成中的作用机制，本研究基于冬虫夏草的RNA-Seq数据库成功挖掘并分析了一个编码PN的基因。PN基因的全长cDNA为855 bp，编码284个氨基酸。BLAST分析显示其与NCBI中核苷水解酶的最高同源性为85.06%。ProtParam分析表明其相对分子量为30.69 kDa，等电点为11.55。利用Predict Protein预测PN的二级结构，结果显示α螺旋结构占28.17%，β折叠结构占11.97%，环状结构占59.86%。此外，从转录组中进一步克隆了PN基因，并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。本研究为真菌类中药中腺苷生物合成的遗传调控提供了更充分的科学依据和新思路。
真菌类中药具有丰富的物种资源1,2。冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是一种著名的真菌类中药，被视为创新药物的重要来源3,4。冬虫夏草是虫体与真菌的复合体，发现于中国西南部的青藏高原，其中Hirsutella sinensis寄生于虫体之上5。目前，根据分子生物学和形态学证据，H. sinensis被报道为冬虫夏草唯一的无性型阶段6,7，与野生冬虫夏草相比，其毒性较低且具有相似的临床疗效8。研究表明，H. sinensis含有多种生物活性成分，如核苷类、多糖类和麦角甾醇类，具有广泛的药理作用，包括修复肝损伤等9,10,11。腺苷是从冬虫夏草中分离出的一种典型活性成分，属于嘌呤类生物碱
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注意：一种冬虫夏草（H. sinensis）的无性型菌株已保存于我实验室。Escherichia coli DH5 由北京中医药大学深圳医院保存。
1. RNA测序准备工作
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PN 基因的开放阅读框（ORF）序列为 855 bp，编码 284 个氨基酸，理论分子质量为 30.69 kDa，预测等电点为 11.55，表明 PN 是一种碱性蛋白。使用 SignalP4.0 服务器分析信号肽，结果显示 PN 不含信号肽。此外，BLASTP 搜索结果表明，来自冬虫夏草的 PN 与 Purpureocillium lilacinum（OAQ81830.1）的核苷水解酶具有最高的序列一致性（85.06%，E 值 = 1e-88）。进一步利用 ClustalX 程序对 PN 进行多序列比对，结果如图 1所示，显示第 11–166 位氨基酸为肌苷/尿苷偏好性核苷水解酶结构域的保守氨基酸序列。随后，基于氨基酸序列相似性构建的系统发育树分析结果表明，冬虫夏草来源的 PN 与其他虫生真菌的核苷水解酶具有最近的亲缘关系，例如 Purpureocillium lilacinum（OAA82129.1, XP 018708456.1）（图 2）。同.......
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人类健康正面临肿瘤、心血管和脑血管疾病等一系列重大医学问题26,27。由于中药具有丰富的物种资源以及多样化的活性成分结构与功能，已被视为创新药物研发的重要源泉28,29。冬虫夏草是一种寄生于鳞翅目昆虫幼虫上的真菌寄生物，在中国传统医学中被视为滋补佳品，与人参、鹿茸并列为最佳滋补药材之一30。多种活性成分如腺苷、甾醇、核苷、萜类和多肽均可从中药中提取29,31。这些活性成分具有多种生理活性和结构类型，可作为创新药物研究与应用的重要来源32。
迄今为止，关于腺苷药理作用的报道已有很多，但有关腺苷生物合成及其相关基因的研究却较少。
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作者声明无利益冲突。
本研究由国家自然科学基金（31871244、81973733、81803652）、广东省自然科学基金（2019A1515011555、2018A0303100007）、深圳市卫生和计划生育委员会基金（SZBC2018016）以及深圳市龙岗区经济与科技发展专项资金（LGKCYLWS2020064、LGKCYLWS2019000361）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无RNase的DNase I | TaKaRa | 2270B | |
| PolyATtract mRNA分离系统 | Promega | III | |
| 随机六聚体引物 | Thermo Scientific | SO142 | |
| NEBNext1 Ultra RNA文库构建试剂盒 | NEB | E7530S | |
| PCR纯化试剂盒 | QiaQuick | ||
| 琼脂糖 | TransGen Biotech | GS201-01 | |
| 高通量测序仪 | Illumina | HiSeq™ 4,000 | |
| LTF Viewer | LTF | V5.2 | |
| ORF程序 | NCBI | ||
| ProtParam工具 | SIB 瑞士生物信息学研究所 | ||
| SignalP服务器 | DTU健康科技 | 5.0 | |
| BLAST | NCBI | ||
| Clustal X程序 | 都柏林大学学院 | ||
| MEGA | 进化医学与信息学中心 | 4.0 | |
| InterProScan | 欧洲分子生物学实验室 | ||
| Predict Protein | 慕尼黑工业大学 | ||
| WISS-MODEL | 瑞士生物信息学研究所 | ||
| Primer Express | Applied Biosystems | 3.0 | |
| EcoRI | NEB | R0101V | |
| NotI | NEB | ER0591 | |
| pMD18-T载体 | TaKaRa | 6011 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | GS201-01 | |
| Trans2K® Plus II DNA Marker | Sigma-Aldrich | BM121-01 | |
| 6×DNA上样缓冲液 | Sigma-Aldrich | GH101-01 | |
| GelStain | Sigma-Aldrich | GS101-02 | |
| 50 x TAE | Sigma-Aldrich | T1060 | |
| 凝胶成像分析系统 | Syngene | G:BOX F3 | |
| E. coli JM109 | Promega | ||
| T4 DNA连接酶 | EarthOx | BE004A-02 | |
| pPIC9K | Genloci | GP0983 |
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