Name: 使用人类脐带血干细胞（CB-SC）治疗后，单核细胞分化成表状独特的巨噬细胞-衍生的外体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解从脐带血干细胞中分离高纯度外泌体的实验方法，用于研究其对单核细胞的免疫调节作用及向巨噬细胞分化的机制。该技术为再生医学和自身免疫疾病治疗提供重要实验基础。

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我们感谢Poddar先生和Ludwig先生通过哈肯萨克大学医学中心基金会提供的慷慨资金支持。感谢Laura Zhao在英文编辑方面所做的工作。

本方案遵循哈肯萨克梅里迪安健康中心发现与创新中心机构人体研究伦理委员会的指南。人血沉棕黄层血液单位购自纽约血液中心（纽约，纽约州）。人脐带血单位采集自健康供体，并购自Oldsmar市（佛罗里达州）Cryo-Cell International血库。纽约血液中心和Cryo-Cell International均获得血液采集与分发的所有认证，并已取得机构审查委员会（IRB）批准及供体签署的知情同意书。
1. 细胞培养及CB-SC来源条件培养基的制备
<ol>
	<li>将25 mL脐带血（材料表）缓慢加入含有20 mL密度梯度介质（γ = 1.077）的50 mL锥形管中。</li>
	<li>在20 °C条件下，使用水平转子以1,690 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。</li>
	<li>小心吸取单个核细胞层（血沉棕黄层）转移至新的50 mL锥形管中。用磷酸盐缓冲液（PBS）将体积补至40 mL，混匀后以751 × g在20 °C离心10分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，向细胞沉淀中加入15 mL ACK裂解缓冲液（材料表），通过移液重悬细胞，室温孵育10分钟。 
	注意：此步骤用于去除红细胞。</li>
	<li>向锥形管中加入25 mL PBS，以751 × g离心5分钟，弃去上清液，获得单个核细胞沉淀。</li>
	<li>用40 mL PBS洗涤两次，以去除残留的裂解缓冲液。</li>
	<li>以751 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，每管用10 mL化学成分明确的无血清培养基（材料表）重悬脐带血单个核细胞。</li>
	<li>将所有脐带血单个核细胞合并至同一管中。</li>
	<li>取20 µL细胞悬液与20 µL 0.4%台盼蓝溶液（材料表）在1.5 mL离心管中混合。</li>
	<li>将混合液加入计数板，使用自动细胞计数仪测定细胞数量和细胞活力。 
	注意：若细胞浓度超过1 × 107 个/mL，则细胞悬液需按1:10稀释后计数。</li>
	<li>将单个核细胞以1 × 106 个/mL的密度接种于150 mm × 15 mm的培养皿中，每皿25 mL化学成分明确的无血清细胞培养基。</li>
	<li>在37 °C、8% CO2条件下培养10–14天，直至脐带血来源的基质细胞（CB-SC）融合度超过80%。</li>
	<li>弃去上清液，每培养皿用15 mL PBS洗涤一次，随后吸除PBS。 
	注意：CB-SC与培养皿结合紧密。</li>
	<li>重复步骤1.14两次。</li>
	<li>每培养皿加入25 mL化学成分明确的无血清培养基。</li>
	<li>在37 °C、8% CO2条件下继续培养3–4天。</li>
	<li>将CB-SC来源的条件培养基收集至50 mL锥形管中。</li>
</ol>
2. CB-SC 的表征
<ol>
	<li>使用5 mL移液枪头反复吹打10 mL基于PBS的细胞解离缓冲液，使CB-SC细胞脱离（材料表）。</li>
	<li>在1,690 × g 条件下离心5分钟以收集细胞，并将细胞重悬于200 µL PBS中。</li>
	<li>利用染色预处理试剂盒对细胞进行固定和通透处理，用于胞内染色（材料表）。</li>
	<li>每个样本加入5 µL Fc阻断剂（材料表），室温孵育15分钟。 
	注意：Fc阻断剂可抑制抗体染色过程中的非特异性结合。</li>
	<li>向100 μL细胞悬液中加入终浓度为25 µg/mL的荧光标记小鼠抗人单克隆抗体，包括CD34、CD45、SOX2、OCT3/4、CD270和Galectin 9（材料表），室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>染色完成后，用1 mL PBS洗涤细胞，在751 × g 条件下离心10分钟以收集细胞。</li>
	<li>将细胞重悬于200 μL PBS中，并转移至5 mL流式管中。</li>
	<li>进行流式细胞术检测，以验证上述CB-SC相关特异性标志物的表达情况。</li>
</ol>
3. 脐带间充质干细胞来源外泌体的分离
<ol>
	<li>将步骤 1.18 收集的条件培养基在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>将步骤 3.1 收集的上清液在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 20 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>将步骤 3.2 收集的上清液在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 锥形管中。 
	注意：使用固定角转子，以便细胞沉淀聚集在管壁一侧。标记管盖的一侧，并在管壁上画一个圆圈，指示预期沉淀位置。</li>
	<li>使用 0.22 µm 滤器（材料表）过滤步骤 3.3 收集的上清液。</li>
	<li>将 15 mL 培养基转移至每个 10 kDa 超滤离心管（材料表）中。</li>
	<li>在 4,000 x g 下离心 30 分钟，以分离浓缩的外泌体培养基。</li>
	<li>将浓缩的外泌体转移至超速离心管中，然后在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 80 分钟，沉淀外泌体。</li>
	<li>弃去上清液，并用 10 mL PBS 重悬沉淀的外泌体。</li>
	<li>在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 80 分钟，收集外泌体沉淀。</li>
	<li>通过反复吹打，用 200 µL PBS 重悬外泌体沉淀。</li>
</ol>
4. CB-SC 来源外泌体的表征
<ol>
	<li>使用二辛可宁酸法（BCA）试剂盒测定外泌体样品的总蛋白浓度
	<ol>
		<li>将步骤3.10中制备的每种白蛋白标准品和分离的外泌体样品各取10 µL，重复两份加入96孔板中。</li>
		<li>向每个孔中加入200 µL BCA试剂盒中的工作试剂。将酶标板置于板式振荡器上，充分混匀10秒。 
		注意：工作试剂（WR）：50份试剂A与1份试剂B混合。</li>
		<li>用铝箔覆盖培养板，在37 °C下孵育30分钟。</li>
		<li>将培养皿冷却至室温（RT）。</li>
		<li>使用酶标仪在562 nm处测定样品的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外泌体的制备及流式细胞术染色
	<ol>
		<li>通过加入20 μL抗人CD63磁珠（4.5 μm大小）捕获外泌体（材料表将25 μg在步骤3.10中制备的CB-SC来源的外泌体溶于总体积为100 μL的PBS中。</li>
		<li>将试管置于摇床中，4 °C、800 rpm条件下孵育过夜（18‒22 h）。</li>
		<li>将试管在 300 x g 30秒，以使样品沉降至管底。</li>
		<li>加入300 µL分离缓冲液（PBS中含0.1%牛血清白蛋白（BSA）），用移液器轻轻混匀。 
		注意：此步骤用于洗涤与磁珠结合的外泌体。</li>
		<li>将试管置于磁力架上静置1分钟（材料表），弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 4.2.4–4.2.5。</li>
		<li>用400 µL裂解缓冲液重悬磁珠结合的外泌体。</li>
		<li>将100 µL珠粒结合的外泌体分装至各管中。</li>
		<li>向每管含有CD63磁珠捕获的外泌体的流式管中加入荧光标记抗体（CD9-FITC、CD81-PE和CD63-FITC，终浓度均为25 µg/mL）。 
		注意：同型匹配的IgG用作阴性对照。</li>
		<li>在室温下避光孵育45分钟，摇床转速为800 rpm。</li>
		<li>重复步骤 4.2.4–4.2.5。</li>
		<li>将结合外泌体的磁珠重悬于200 µL分离缓冲液中，转移至5 mL流式管中。</li>
		<li>将试管放入流式细胞仪的样品架中。</li>
		<li>打开外泌体检测方案。</li>
		<li>通过流式细胞仪自动检测样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外泌体的蛋白质印迹检测 
	注意：Western blot 是一种成熟的方法，本文不再详述该方法的具体细节。
	<ol>
		<li>裂解步骤 3.10 中获得的 CB-SC 来源外泌体沉淀物&#160;加入100 µL RIPA裂解缓冲液，吹打20次，置于冰上5分钟。</li>
		<li>使用BCA试剂盒测定外泌体裂解液的蛋白浓度，并每孔上样25 µg蛋白。</li>
		<li>在150 V电压下进行凝胶电泳分离蛋白质，持续40分钟。</li>
		<li>使用半干法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜11.</li>
		<li>用5%脱脂牛奶封闭膜30分钟。</li>
		<li>加入2 µg/mL抗人Alix抗体孵育&#160;(材料表）和 1 µg/mL 抗人 Calnexin&#160;抗体（材料表).</li>
		<li>使用数字成像系统通过化学发光检测蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过动态光散射（DLS）对外泌体进行验证
	<ol>
		<li>将10 µg CB-SC来源的外泌体样品用1 mL PBS稀释。</li>
		<li>将1 mL稀释后的样品转移至一次性半微量比色皿中（材料表).</li>
		<li>将比色皿放入DLS仪器中。将所有样品监测的折射率（RI）设置为1.39。</li>
		<li>在25 °C下运行样品，每份样品采集三次测量数据，以获得平均粒径分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）对外泌体进行验证
	<ol>
		<li>在300目铜网上涂覆火棉胶12 (材料表).</li>
		<li>在铜网上用蒸发的碳层加强火棉胶膜12. 
		注意：这种包被方法对样本支撑非常有效。</li>
		<li>将10 µL外泌体样品加入载网上，静置晾干。</li>
		<li>用醋酸铀酰对样品进行负染色，持续5分钟。</li>
		<li>用去离子水洗涤三次，然后静置风干。</li>
		<li>在透射电子显微镜下观察并拍照样品。加速电压设为 200 kV，束斑尺寸设为 2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 检测不同PBMC亚群摄取DiO标记的CB-SC来源外泌体的情况
<ol>
	<li>用绿色荧光脂溶性染料Dio标记CB-SC来源的外泌体
	<ol>
		<li>将100 µg CB-SC来源的外泌体（步骤3.10中制备）转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>用PBS稀释样品至5 mL。</li>
		<li>加入绿色荧光脂溶性染料Dio（材料表），使工作浓度达到5 µM。</li>
		<li>室温避光孵育15分钟。</li>
		<li>将样品转移至超速离心管中。</li>
		<li>在100,000 x g条件下离心80分钟，沉淀Dio标记的CB-SC来源外泌体。</li>
		<li>将标记后的外泌体重悬于200 µL PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人外周血单个核细胞（PBMC）的制备
	<ol>
		<li>将25 mL人血沉棕黄层（材料表）缓慢加至含有20 mL密度梯度介质（γ = 1.077）的50 mL锥形管上层。</li>
		<li>重复步骤1.2至1.11。</li>
		<li>将1 × 106个PBMC转移至未经组织处理的疏水性24孔板中（每孔1 mL）。 
		注：使用未经组织处理的培养板以避免单核细胞贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将Dio标记的外泌体与PBMC共培养
	<ol>
		<li>使用200 µL移液器，将步骤5.1.7制备的40 µL Dio标记的CB-SC来源外泌体加入24孔板中含PBMC的各孔中。对照孔中加入等体积PBS。</li>
		<li>反复吹打混匀10次，孵育4小时。</li>
		<li>收集200 μL经外泌体处理的PBMC，在室温下用Hoechst 33342染色10分钟。</li>
		<li>室温下以300 x g离心10分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于100 µL PBS中。</li>
		<li>将细胞滴加至显微镜载玻片上。</li>
		<li>使用显微镜观察并拍摄Dio标记的CB-SC来源外泌体与Hoechst 33342标记的PBMC之间的相互作用。</li>
		<li>将步骤5.3.3中剩余的细胞转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于200 µL PBS中。</li>
		<li>每份样品加入5 µL Fc阻断剂&#160;，室温孵育15分钟。</li>
		<li>加入抗体（CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD19和CD56，浓度均为25 µg/mL）（材料表）对PBMC进行染色。 
		注：同型匹配的IgG作为阴性对照。</li>
		<li>室温避光孵育30分钟。</li>
		<li>加入1 mL PBS，在4 °C下以300 x g离心10分钟，收集细胞沉淀。</li>
		<li>用200 µL PBS重悬细胞，加入5 µL碘化丙啶（propidium iodide）。</li>
		<li>使用流式细胞术评估不同PBMC亚群对Dio标记外泌体的摄取水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 检测CB-SC来源的外泌体对单核细胞的作用
<ol>
	<li>分离人CD14阳性单核细胞
	<ol>
		<li>将3 × 107个人外周血单个核细胞（PBMC）转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心10分钟。</li>
		<li>将分离柱（材料表）置于磁力分离器（材料表）中。</li>
		<li>用2 mL冷洗脱缓冲液（材料表）洗涤分离柱三次。</li>
		<li>将细胞重悬于300 µL冷PBS中，加入60 µL CD14微珠，充分混匀后冰上孵育15分钟。</li>
		<li>加入6 mL冷PBS，在4 °C下以300 × g离心10分钟。</li>
		<li>将沉淀细胞重悬于500 µL冷洗脱缓冲液中。</li>
		<li>将细胞转移至分离柱（步骤6.14中已准备）中，让其自然流过。</li>
		<li>每次用2 mL洗脱缓冲液洗涤分离柱三次。将分离柱从磁力分离器上取下，放入15 mL离心管中。 
		注：由于CD14阳性单核细胞在室温下易黏附于管壁，该15 mL离心管应置于冰上。</li>
		<li>向柱顶加入2 mL冷洗脱缓冲液，将CD14阳性细胞洗脱至15 mL离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心10分钟，收集CD14阳性细胞沉淀。</li>
		<li>用2 mL冷化学成分明确的无血清培养基（材料表）重悬细胞。</li>
		<li>将50 µL细胞转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>加入10 µL Krome Orange标记的抗人CD14单克隆抗体（材料表），避光孵育20分钟。 
		注：同型匹配的IgG作为阴性对照。</li>
		<li>向细胞中加入1 mL PBS，在300 × g下离心10分钟以收集细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞重悬于200 µL PBS中，并转移至5 mL流式管中，通过流式细胞术检测CD14阳性单核细胞的纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用CB-SC来源的外泌体处理单核细胞
	<ol>
		<li>将1 × 106个纯化的单核细胞接种于经组织培养处理的6孔板中，每孔加入2 mL化学成分明确的无血清培养基（材料表）。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
		<li>用1 mL移液器吸弃上清液，轻柔加入2 mL预热至37 °C的化学成分明确的无血清培养基（材料表）。 
		注：单核细胞在2小时内已贴壁，漂浮细胞被视为死亡细胞或其他污染细胞。</li>
		<li>向6孔板中的单核细胞培养物中加入80 µg来自步骤3.10分离的CB-SC来源外泌体，总体积为2 mL。 
		注：对照孔中加入等体积的PBS。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育3–4天。</li>
		<li>使用倒置显微镜在200×放大倍数下拍摄细胞形态（材料表）。</li>
		<li>用1 mL基于PBS的细胞解离缓冲液，通过1 mL移液器头反复吹打使细胞脱离。</li>
		<li>使用细胞刮刀收集仍贴壁的剩余细胞。 
		注：由于原代单核细胞或分化后的巨噬细胞贴壁较紧，在使用解离缓冲液处理后仍有部分细胞残留于底部，因此需使用细胞刮刀收集这些细胞。</li>
		<li>在1,690 × g下离心5分钟收集细胞，用200 µL PBS重悬细胞。</li>
		<li>每样本加入5 µL Fc阻断剂（25 µg/mL），以阻断非特异性结合。</li>
		<li>向细胞中加入抗体（CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209，浓度均为25 µg/mL，材料表），室温孵育30分钟。 
		注：同型匹配的IgG作为阴性对照。</li>
		<li>向细胞中加入1 mL PBS，在300 × g下离心10分钟，弃上清，用200 µL PBS重悬细胞。</li>
		<li>每样本（200 µL）加入5 µL碘化丙啶（propidium iodide），并将细胞转移至新的5 mL流式管中。</li>
		<li>进行流式细胞术检测，分析CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%3A+different+gene+signatures+in+M1%28LPS%2B%29+vs.+classically+and+M2%28LPS-%29+vs.+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).</li>
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赵博士是天河干细胞生物技术有限公司的创始人。赵博士是干细胞教育技术的发明人。其他所有作者均无与提交稿件相关的经济利益。

外泌体的应用是临床诊断、药物开发和再生医学领域的新兴方向。本文介绍了一种详细的实验方案，用于制备脐带间充质干细胞（CB-SC）来源的外泌体，并研究这些外泌体对人单核细胞分化功能的影响。本方案表明，通过连续离心和超速离心法可高纯度地分离出具有免疫调节功能的CB-SC来源外泌体，且其能够有效调控单核细胞的免疫功能。
与其他传统方法相比，超滤法是一种基于分子量和排阻尺寸（与其他细胞外囊泡（EVs）不同）来分离和纯化不同细胞或培养基中外泌体的成熟技术。尽管超滤法在分离外泌体时比基于超速离心的分离方法更节省时间，但可能会对较大尺寸的囊泡造成结构损伤。此外，也可通过聚乙二醇（PEG）介导的沉淀法以较低成本收集外泌体，但该方法因存在蛋白质污染风险而可能影响外泌体的纯度13,14。因此，本实验方案具有成本效益，可高效获得高纯度的外泌体。鉴于脐带间充质干细胞（CB-SC）来源外泌体具有免疫调节功能10，对其特性进行表征可能为临床应用前评...

脐带血干细胞（CB-SC）是一类来源于人脐带血的独特干细胞，可与其他已知类型的干细胞（如间充质干细胞（MSC）和造血干细胞（HSC））相区分1。基于其独特的免疫调节特性以及在培养皿表面紧密贴壁生长的能力，我们开发了一项新技术，称为干细胞教育疗法（Stem Cell Educator，SCE），并已进入临床试验阶段2,3。在SCE治疗过程中，采集患者的外周血单个核细胞（PBMC），通过细胞分离装置循环，并在体外与贴壁生长的CB-SC共培养。这些经过“教育”的细胞（即经CB-SC处理的PBMC）随后通过闭环系统回输至患者体内。临床试验已证实，SCE疗法在治疗自身免疫性疾病（包括1型糖尿病（T1D）2,4和斑秃（AA）5）方面具有良好的临床安全性和有效性。
外泌体是一类直径在30‒150 nm之间的纳米颗粒，存在于所有生物体液和细胞培养基中6。外泌体富含多种生物活性分子，包括脂质、mRNA、蛋白质和微小RNA（miRNA），在细胞间通讯中发挥重要作用。近年来，由于外泌体在临床治疗中具有潜在的治疗价值，已引起研究人员和制药公司的广泛关注7,8,9。最近，我们的机制研究表明，CB-SC释放的外泌体在外泌体疗法（SCE therapy）的免疫调节中具有重要作用10。
本文描述了一种研究脐带间充质干细胞（CB-SC）分泌的外泌体介导的SCE疗法靶向单核细胞机制的实验方案。首先，采用超速离心法从CB-SC来源的条件培养基中分离CB-SC分泌的外泌体，并通过流式细胞术、蛋白质印迹法（WB）和动态光散射（DLS）进行鉴定。其次，使用绿色荧光脂溶性染料Dio对CB-SC来源的外泌体进行标记。随后，将标记后的外泌体与外周血单个核细胞（PBMC）共培养，通过流式细胞术检测Dio标记的CB-SC来源外泌体在PBMC不同亚群中的摄取阳性率。该方案为研究外泌体在干细胞免疫调节作用中的机制提供了指导。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>非组织培养&lt;br/&gt; 板</td></tr><tr><td>3,3'-二辛基氧羰花青高氯酸盐（Dio）</td><td>Millipore sigma</td><td>D4292-20MG</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>300 目网格</td><td>Ted Pella</td><td>1GC300</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>组织培养板</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>组织培养板</td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Amicon-15 10 kDa 离心过滤单元</td><td>Millipore sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>抗人 Alix 抗体</td><td>Biolegend</td><td>634501</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2268110</td></tr><tr><td>抗人 Calnexin 抗体</td><td>Biolegend</td><td>699401</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2728519</td></tr><tr><td>抗人 CD11c 抗体，Pe-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>561356</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_10611859</td></tr><tr><td>抗人 CD14 抗体，Karma Orange</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2728099</td></tr><tr><td>抗人 CD163 抗体，PE</td><td>BD Bioscience</td><td>556018</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_396296</td></tr><tr><td>抗人 CD19 抗体，PC5</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2643U</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_131160</td></tr><tr><td>抗人 CD206 抗体，FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>551135</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_394065</td></tr><tr><td>抗人 CD209 抗体，Brilliant Violet 421</td><td>BD Bioscience</td><td>564127</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2738610</td></tr><tr><td>抗人 CD270 抗体，PE</td><td>Biolegend</td><td>318806</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2203703</td></tr><tr><td>抗人 CD3 抗体，Pacfic Blue</td><td>Biolegend</td><td>300431</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_1595437</td></tr><tr><td>抗人 CD34 抗体，APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2427U</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: N/A</td></tr><tr><td>抗人 CD4 抗体，APC</td><td>BD Bioscience</td><td>555349</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_398593</td></tr><tr><td>抗人 CD45 抗体，Pe-Cy7</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3548U</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_1575969</td></tr><tr><td>抗人 CD56 抗体，PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2073U</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_131195</td></tr><tr><td>抗人 CD63 抗体，PE</td><td>BD Bioscience</td><td>561925</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_10896821</td></tr><tr><td>抗人 CD8 抗体，APC-Alexa Fluor 750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94686</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: N/A</td></tr><tr><td>抗人 CD80 抗体，APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30642</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: N/A</td></tr><tr><td>抗人 CD81 抗体，FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>561956</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_394049</td></tr><tr><td>抗人 CD86 抗体，APC-Alexa Fluor 750</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30646</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: N/A</td></tr><tr><td>抗人 CD9 抗体，FITC</td><td>ThermoScientic</td><td>MA5-16860</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2538339</td></tr><tr><td>抗人 Galectin 9 抗体，Brilliant Violet 421</td><td>Biolegend</td><td>348919</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2716134</td></tr><tr><td>抗人 OCT3/4 抗体，eFluor660</td><td>ThermoScientic</td><td>50-5841-82</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_11218882</td></tr><tr><td>抗人 SOX2 抗体，Alexa Fluor 488</td><td>ThermoScientic</td><td>53-9811-82</td><td>4 &amp;deg;C 保存，RRID: AB_2574479</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1933</td><td></td></tr><tr><td>血沉棕黄层</td><td>纽约血液中心</td><td></td><td>每单位 40–60 ml</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>一次性半微量比色皿</td><td>VWR</td><td>97000590</td><td></td></tr><tr><td>解离缓冲液</td><td>Gibco</td><td>131510014</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>双室细胞计数板</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>外泌体-人 CD63 检测试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10606D</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS 密度梯度介质</td><td>GE Health</td><td>17-1440-03</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>固定角转子（25&amp;deg;）</td><td>Thermo Scientifc</td><td>75003698</td><td>最大 24,700 × g</td></tr><tr><td>Gallios 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>3 激光&lt;br/&gt; 最多 10 色</td></tr><tr><td>人脐带血</td><td>Cryo-Cell International</td><td></td><td>每单位 40–100 ml</td></tr><tr><td>人 Fc 封闭剂</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF 膜</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 注射器滤器单元，0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床 MP4</td><td>BioExpress</td><td>S-3500-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>BD Bioscience</td><td>56-66211E</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti2 显微镜</td><td>Nikon instruments Inc</td><td>Eclipse Ti2</td><td>NIS-Elements 软件版本 5.11.02</td></tr><tr><td>Hochest 33342</td><td>Thermo Scientifc</td><td>62249</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Fisher scientific</td><td>12563518</td><td></td></tr><tr><td>转子 41 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>最大 41,000 rpm</td></tr><tr><td>Sorvall St 16R 离心机</td><td>Thermo Scientifc</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>摆桶转子</td><td>Thermo Scientifc</td><td>75003655</td><td></td></tr><tr><td>TC-20 细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 培养箱</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>X'VIVO 15 无血清培养基</td><td>Lonza</td><td>BEBP04-744Q</td><td>1000 ml 培养基，4 &amp;deg;C 保存</td></tr></tbody></table>

人脐带血干细胞来源外泌体处理后单核细胞向表型不同的巨噬细胞分化

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

干细胞教育器（Stem Cell Educator，SCE）疗法是一种治疗1型糖尿病及其他自身免疫性疾病的新型临床方法。SCE疗法通过将患者分离的外周血单个核细胞（如淋巴细胞和单核细胞）在血细胞分离机中循环，使其在SCE装置内与贴壁的脐带血来源干细胞（CB-SC）共培养，随后将这些被“教育”过的免疫细胞回输至患者血液中。外泌体是存在于所有生物体液和细胞培养基中的纳米级细胞外囊泡，大小为30‒150 nm。为了进一步探究SCE疗法背后的分子机制，并明确CB-SC释放的外泌体的作用，我们研究了在CB-SC治疗过程中哪些细胞会吞噬这些外泌体。通过将Dio标记的CB-SC来源外泌体与人外周血单个核细胞（PBMC）共培养，我们发现CB-SC来源的外泌体主要被人CD14阳性单核细胞摄取，从而诱导单核细胞向具有纺锤形形态及表达M2相关表面分子标志物的2型巨噬细胞（M2）分化。本文中，我们提供了一项用于分离和表征CB-SC来源外泌体的实验方案，以及CB-SC来源外泌体与人单核细胞共培养并监测其向M2分化的操作流程。

最初，通过流式细胞术检测CB-SC的表型和纯度，所用标记物包括与CB-SC相关的白细胞共同抗原CD45、胚胎干细胞特异性转录因子OCT3/4和SOX2。CB-SC高表达CD45、OCT3/4、SOX2、CD270和半乳糖凝集素9，但不表达CD34（图1A）。流式细胞术分析证实，脐带间充质干细胞来源的外泌体表达外泌体特异性标志物CD9、CD81和CD63。图1B）。通过TEM和DLS对外泌体的形态学及粒径分布进行表征（图1C，D），大小为 79.38 ± 20.07 nm。Western 印迹进一步证实外泌体相关标志物 Alix 的表达，而内质网相关标志物 Calnexin 无表达（图1E).
采用 Dio 标记的 CB-SC-Exo 处理 PBMC。显微镜观察显示，Dio 标记的 CB-SC-Exo 与 PBMC...

外泌体应用是药物开发和再生医学领域的新兴工具。我们建立了一种高纯度的外泌体分离方案，用于从新发现的干细胞CB-SC中分离外泌体，以开展机制研究。我们还将CB-SC来源的外泌体与人单核细胞共培养，诱导其分化为表型 distinct 的巨噬细胞。

干细胞教育器（Stem Cell Educator, SCE）疗法是一种治疗1型糖尿病及其他自身免疫性疾病的新型临床方法。SCE疗法通过体外循环使患者血液流经含有脐带间充质干细胞的装置……

干细胞教育疗法旨在治疗I型糖尿病及其他自身免疫性疾病。本方法旨在通过脐带血干细胞释放的外泌体，探究干细胞教育疗法在免疫调节中的分子机制。本方案提供了从人脐带血干细胞培养物中纯化外泌体，并检测其对单核细胞免疫调节作用的指导。本实验操作将由我实验室的博士研究生 Wei Hu 演示。首先，按照文本稿件中的描述，将 CB-SC 来源的条件培养基进行三次离心，每次离心后将上清液收集至新的 50 毫升锥形管中。第三次离心结束后，使用 0.22 微米滤器过滤所获得的上清液，并将 15 毫升培养基转移至每个 10 千道尔顿的离心过滤装置中。在 4,000 × g 条件下离心 30 分钟，以分离浓缩的外泌体培养基。将浓缩的外泌体转移至超速离心管中，然后在 4 摄氏度下于 100,000 × g 离心 80 分钟，使外泌体沉淀成团。然后弃去上清液，并将沉淀的外泌体重悬于 10 毫升 PBS 中。进行最后一次超速离心以收集外泌体沉淀，并将其重悬于 200 微升 PBS 中。将 3000 万个 人PBMCs 加入 15 毫升离心管中，在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。将细胞重悬于300微升预冷的PBS中，加入60微升CD14磁珠。充分混匀后，将细胞置于冰上孵育15分钟。再加入6毫升预冷的PBS，于4°C、300 × g离心10分钟。然后将离心收集的细胞重悬于500 µL预冷的运行缓冲液中。将分离柱置于磁力分离器上，用2 mL预冷的运行缓冲液洗涤三次。将重悬的细胞转移至分离柱中，使其流过。再次用两毫升的运行缓冲液洗涤柱子，每次洗涤重复三次。然后将柱子从磁力架上取下，置于预冷的15毫升离心管上，冰上操作。用两毫升预冷的运行缓冲液洗脱CD14阳性细胞，并在4°C条件下以300 × g离心10分钟，使细胞沉淀。将沉淀重悬于2毫升冷的化学成分明确的血清培养基中，取50微升转移至1.5毫升离心管中。加入10微升Krome Orange标记的抗人CD14单克隆抗体，对获得的细胞染色20分钟。加入1毫升PBS，以300 × g离心10分钟，使细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于200微升PBS中，并转移至5毫升离心管中。通过流式细胞术测定CD14+单核细胞的纯度。将一百万个经纯化获得的单核细胞接种至经组织培养处理的六孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时。孵育后，弃去上清液，轻轻加入2毫升37摄氏度预热的化学成分明确的无血清培养基，然后向六孔板中的单核细胞培养物中加入80微克CB-SC来源的外泌体，终体积为2毫升。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3至4天。随后在200倍放大倍数下使用倒置显微镜观察细胞形态。加入1毫升基于PBS的细胞解离缓冲液，通过反复吹打使细胞脱离，再用细胞刮刀收集剩余细胞。将细胞在1,690 × g离心5分钟进行收集，并重悬于200微升PBS中。加入5微升Fc阻断剂以阻断非特异性结合，然后加入抗体。将细胞在室温下孵育30分钟。向孵育后的细胞中加入1毫升PBS，于300 × g离心10分钟。将沉淀重悬于200微升PBS中，每份样品加入5微升碘化丙啶。将细胞转移至新的5 mL流式管中，通过流式细胞术检测CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209的表达水平。采用与CB-SC相关的标志物，通过流式细胞术分析CB-SC的表型和纯度。分析结果显示，CD45、OCT3/4、SOX2、CD270和半乳糖凝集素9（galectin 9）表达水平较高，但未检测到CD34的表达。流式细胞术分析还证实了脐血干细胞来源的外泌体表达外泌体特异性标志物 CD9、CD81 和 CD63。通过透射电子显微镜（TEM）对外泌体的形态大小进行表征，并通过动态光散射（DLS）测定其粒径分布。Western blot 进一步证明外泌体相关标志物 Alix 的表达，而内质网相关标志物 calnexin 无表达。通过荧光显微镜观察了 Dio 标记的 CB-SC-Exo 与 PBMC 的直接相互作用。为了更明确地确定哪些细胞亚群与 Dio 标记的 CB-SC-Exo 发生相互作用，使用细胞特异性标记物对不同细胞区室进行设门，例如 CD3 标记 T 细胞，CD11C 标记髓系树突状细胞，CD14 标记单核细胞，CD19 标记 B 细胞，CD56 标记 NK 细胞。CB-SC 来源的外泌体主要靶向单核细胞，因其表现出的中位荧光强度高于其他免疫细胞。经外泌体处理的单核细胞成功分化为纺锤形形态。使用脐带间充质干细胞来源的外泌体处理后，M2相关标志物（如CD163、CD206和CD209）的表达水平上调。传统M2型巨噬细胞与脐带间充质干细胞外泌体诱导生成的M2型巨噬细胞之间的表型比较显示无显著差异。本方案的关键步骤是将脐带间充质干细胞来源的外泌体加入六孔板中的单核细胞培养体系，并孵育三至四天，以诱导细胞分化为具有纺锤形形态的2型巨噬细胞。接下来，我们将探究脐带间充质干细胞来源的外泌体中参与诱导单核细胞向2型巨噬细胞分化的分子成分。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用人类脐带血干细胞（CB-SC）治疗后，单核细胞分化成表状独特的巨噬细胞-衍生的外体

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单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。本文介绍了一种易于使用的 体外...

一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

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小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射

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本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。...

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

本研究比较了两种不同的人单核细胞分离方法，以获得 体外...

通过成像流式细胞术表征人单核细胞来源的树突状细胞：两种单核细胞分离方案的比较

本文介绍了一种对脐带血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞进行免疫表型鉴定以及细胞因子诱导其向四种髓系谱系分化的实验方案。该方案可用于研究髓系疾病相关突变或小分子化合物对CD34+细胞髓系分化的影响。...

人脐血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞的泛髓系分化

本方案描述了从人诱导性多能干细胞高效生成巨噬细胞的方法，以及对这些细胞进行后续表征的技术。通过细胞表面标志物表达、基因表达分析和功能检测，评估由诱导性多能干细胞衍生的巨噬细胞的表型与功能特性。...

由多能干细胞生成并表征人类巨噬细胞

破骨细胞是体内关键的骨吸收细胞。本方案描述了一种可靠的破骨细胞 体外...

人外周血CD14+单核细胞向功能性破骨细胞的分化

单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外...

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

了解从脐带血干细胞中分离高纯度外泌体的实验方法，用于研究其对单核细胞的免疫调节作用及向巨噬细胞分化的机制。该技术为再生医学和自身免疫疾病治疗提供重要实验基础。

人脐带血干细胞来源外泌体处理后单核细胞向表型不同的巨噬细胞分化

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