人脐带血干细胞来源外泌体处理后单核细胞向表型不同的巨噬细胞分化

干细胞教育疗法旨在治疗I型糖尿病及其他自身免疫性疾病。本方法旨在通过脐带血干细胞释放的外泌体，探究干细胞教育疗法在免疫调节中的分子机制。本方案提供了从人脐带血干细胞培养物中纯化外泌体，并检测其对单核细胞免疫调节作用的指导。

本实验操作将由我实验室的博士研究生 Wei Hu 演示。首先，按照文本稿件中的描述，将 CB-SC 来源的条件培养基进行三次离心，每次离心后将上清液收集至新的 50 毫升锥形管中。第三次离心结束后，使用 0.22 微米滤器过滤所获得的上清液，并将 15 毫升培养基转移至每个 10 千道尔顿的离心过滤装置中。

在 4,000 × g 条件下离心 30 分钟，以分离浓缩的外泌体培养基。将浓缩的外泌体转移至超速离心管中，然后在 4 °C 条件下于 100,000 × g 离心 80 分钟，使外泌体沉淀。

然后弃去上清液，并将沉淀的外泌体重悬于 10 毫升 PBS 中。进行最后一次超速离心以收集外泌体沉淀，并将其重悬于 200 微升 PBS 中。将 3000 万个 人PBMCs 加入 15 毫升离心管中，在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。

将细胞重悬于300 µL冷PBS中，加入60 µL CD14磁珠。充分混匀后，将细胞置于冰上孵育15分钟。再加入6 mL冷PBS，于4°C下以300 × g离心10分钟。

然后将沉淀的细胞重悬于500微升预冷的运行缓冲液中。将分离柱置于磁力分离器中，并用2毫升预冷的运行缓冲液洗涤三次。将重悬的细胞转移至分离柱中，使其流过。

再次用运行缓冲液洗涤柱子三次，每次两毫升。然后将柱子从磁力架上取下，置于预冷的15毫升离心管上，冰上操作。用两毫升冷的运行缓冲液洗脱CD14阳性细胞，并在4°C下以300 × g离心10分钟，使细胞沉淀。

将沉淀重悬于2毫升冷的化学成分明确的血清培养基中，取50微升转移至1.5毫升离心管中。加入10微升Krome Orange标记的抗人CD14单克隆抗体，对获得的细胞染色20分钟。加入1毫升PBS，以300 × g离心10分钟，使细胞沉淀。

将细胞沉淀重悬于200微升PBS中，并转移至一个5毫升试管中。通过流式细胞术测定CD14+单核细胞的纯度。取一百万个经纯化获得的单核细胞接种于经组织培养处理的六孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时。

孵育后，弃去上清液，轻轻加入2毫升37摄氏度预热的化学成分明确的无血清培养基，然后向6孔板中的单核细胞培养物中加入80微克CB-SC来源的外泌体，终体积为2毫升。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3至4天。随后在200倍放大倍数下使用倒置显微镜观察细胞形态。

加入1毫升基于PBS的细胞解离缓冲液，通过反复吹打使细胞脱离，再用细胞刮刀收集剩余细胞。在1,690 × g离心5分钟以收集细胞，并将其重悬于200微升PBS中。加入5微升Fc阻断剂以阻断非特异性结合，然后加入抗体。

将细胞在室温下孵育30分钟。向孵育后的细胞中加入1毫升PBS，于300 × g离心10分钟。将沉淀重悬于200微升PBS中，每份样品加入5微升碘化丙啶。

将细胞转移至新的5 mL流式管中，通过流式细胞术检测CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209的表达水平。采用与CB-SC相关的标志物进行流式细胞术分析，以检测CB-SCs的表型和纯度。分析结果显示，CB-SCs高表达CD45、OCT3/4、SOX2、CD270和半乳糖凝集素9，但未检测到CD34的表达。

流式细胞术分析还证实了脐血干细胞来源的外泌体表达外泌体特异性标志物 CD9、CD81 和 CD63。外泌体的大小形态通过透射电子显微镜（TEM）进行表征，粒径分布则通过动态光散射（DLS）测定。Western blot 进一步证明外泌体相关标志物 Alix 的表达，而内质网相关标志物 calnexin 未表达。

通过荧光显微镜观察了 Dio 标记的 CB-SC-Exo 与 PBMC 的直接相互作用。为了更明确地确定哪些细胞亚群与 Dio 标记的 CB-SC-Exo 发生相互作用，使用细胞特异性标记物对不同细胞区室进行设门，例如 CD3 标记 T 细胞，CD11C 标记髓系树突状细胞，CD14 标记单核细胞，CD19 标记 B 细胞，CD56 标记 NK 细胞。CB-SC 来源的外泌体主要靶向单核细胞，因其表现出的中位荧光强度高于其他免疫细胞。

经外泌体处理的单核细胞成功分化为纺锤形形态。在经脐带干细胞来源的外泌体处理后，M2相关标志物（如CD163、CD206和CD209）的表达水平上调。传统M2型巨噬细胞与脐带干细胞外泌体诱导生成的M2型巨噬细胞之间的表型比较显示无显著差异。

本方案的关键步骤是将脐带间充质干细胞来源的外泌体加入六孔板中的单核细胞培养体系，并孵育三至四天，以诱导细胞分化为具有纺锤形形态的2型巨噬细胞。接下来，我们将探究脐带间充质干细胞来源的外泌体中参与诱导单核细胞向2型巨噬细胞分化的分子成分。