Name: 亚细胞结构的超分辨率活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学习超分辨率活细胞成像技术，用于观察果蝇睾丸中动态细胞过程及亚细胞结构。该方法可在保持生理条件下实现长时间高分辨率成像，揭示微管动力学和不对称核膜相互作用。

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作者感谢约翰斯·霍普金斯大学综合影像中心提供的显微镜设备和数据分析软件。感谢 J. Snedeker 和 Q. E. Yu 提供的校对意见和建议，以及 X.C. 实验室成员给予的有益讨论和建议。本研究由美国国家普通医学科学研究所/国立卫生研究院 R35GM127075 项目、霍华德·休斯医学研究所、大卫与露西尔·帕卡德基金会以及约翰斯·霍普金斯大学启动资金（X.C.）资助。

1. 活细胞成像混合液（活细胞培养基）的制备
<ol>
	<li>补充施奈德氏培养基 果蝇 含15%胎牛血清（FBS）和0.6倍青霉素/链霉素的培养基。调节pH至约7.0。</li>
	<li>使用培养基前，加入胰岛素至终浓度为 200 µg/mL。 
	注意：该培养基对于维持细胞正常分裂和发育至关重要 果蝇 活体成像过程中的睾丸10,14.</li>
</ol>
2. 玻璃底细胞培养皿的制备
<ol>
	<li>使用直径为35 mm的多聚-L-赖氨酸包被的玻璃底细胞培养皿进行果蝇（Drosophila）睾丸实验。培养皿内腔为直径23 mm、高1 mm的环形凸起，底部为玻璃材质（图1A-a）。 
	注意：应选择工作距离较短、数值孔径较大、放大倍数较高的物镜所适用的玻璃底培养皿；这些特性对于获得超分辨率图像至关重要。</li>
	<li>使用允许气体交换的透析膜（截留分子量：12–14 kD），并将膜剪成小片。 
	注意：膜片应小于培养皿的玻璃区域，但需足够大以完全覆盖样本。</li>
	<li>用100 µL活细胞培养基浸泡膜片约5分钟。切勿将干燥的膜直接用于样本上，以免造成损伤。该膜有助于防止缺氧应激。</li>
	<li>准备2–3个轻质的玻璃或塑料小片，置于膜上，以防止组织漂浮。具体操作为：取50 mL离心管的外圈，剪成小段，使用前用70%乙醇灭菌。 
	注意：此步骤可确保样本在成像过程中保持在表面位置而不漂浮，对获得最佳结果至关重要。</li>
	<li>制作一个直径约25 mm的环状结构，并将其放置在培养皿的凸起边缘上，再盖上盖玻片，形成两个腔室。下层腔室用于放置样本，上层腔室作为保湿腔室，防止样本干燥。
	<ol>
		<li>制作该环时，可取50 mL离心管的外圈，使其能牢固地卡在35 mm培养皿的凸起边缘上。也可采用其他方式制作类似结构，例如使用橡皮筋或塑料扎线固定在培养皿的凸起边缘，以稳妥支撑盖玻片，同时不干扰样本。 
		注意：此步骤尤为关键，特别是对于易受缺氧、温度变化和湿度波动等应激因素影响的样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 雄性果蝇睾丸的解剖与封片
<ol>
	<li>取约10只年轻的雄性果蝇（2–3日龄），在活细胞培养基中解剖以获得约10对成年Drosophila睾丸。
	<ol>
		<li>使用精细镊子在解剖皿中的解剖显微镜下进行果蝇解剖。 
		注：所用的Drosophila melanogaster（果蝇）品系携带由早期生殖细胞驱动子nanos-Gal4驱动的UAS-α-Tubulin-GFP转基因。</li>
		<li>利用CRISPR-Cas9技术构建以下基因敲入型Drosophila melanogaster品系：Lamin-mCherry（C端标签）和CENP-A-Dendra2-CENP-A [在内部位点（第118至119个密码子之间）插入标签]。 
		注：尽管每次实验仅需一个高质量的睾丸样本，但制备足够数量的组织（15–20个）或细胞可确保至少获得一个具有优良荧光信号的健康样本，用于延时成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖皿中用活细胞培养基清洗睾丸两次。
	<ol>
		<li>使用移液器加入培养基，随后吸除活细胞培养基以完成清洗步骤。</li>
		<li>用镊子去除多余组织。任何残留的额外组织都会干扰成像。 
		注：请勿使用磷酸盐缓冲液（PBS）进行清洗，因为它可能影响某些细胞组分的动态行为。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向培养皿（步骤2.1中准备）中加入100–150 µL活细胞培养基，并用移液器枪头将其均匀铺展在玻璃表面。将培养基铺展在表面有助于组织牢固贴附于培养皿上。</li>
	<li>使用精细镊子将睾丸转移至培养皿中，并将其移至培养皿中央（图1A-b）。 
	注：避免转移碎屑，因其会干扰成像并可能降低图像质量。</li>
	<li>吸除多余的活细胞培养基（保留约10 µL），使组织能够充分展平并牢固贴附于培养皿表面。此步骤应迅速完成，以避免样本干燥。</li>
	<li>将预湿的膜（步骤2.2和2.3中准备）覆盖在睾丸上方（图1A-c）。</li>
	<li>在膜上放置2–3个小型塑料重物（步骤2.4中准备），以防止样本漂浮，并迅速加入100–150 µL活细胞培养基（图1A-d）。 
	注：快速而轻柔地添加培养基可确保样本不会干燥或移位。</li>
	<li>将塑料环（步骤2.5中准备）放置在培养皿的抬高一侧（图1B-a）。</li>
	<li>将一块22 mm × 22 mm的盖玻片置于环上（图1B-b），形成两个腔室。</li>
	<li>取一小片纸巾，用水润湿后轻轻旋转挤去多余水分，然后将其放置在盖玻片上，以形成一个保湿环境（图1B-c）。盖上培养皿盖子（图1B-d），开始活细胞成像。 
	注：若样本对光敏感，请在暗处进行第3节操作。</li>
</ol>
4. 活细胞成像 果蝇 原位男性生殖系干细胞（GSC）
<ol>
	<li>将培养皿置于超分辨率显微镜下，并用载物台夹具固定。
	<ol>
		<li>打开成像软件，开启透射光，使用63倍物镜并通过调焦旋钮对睾丸组织进行聚焦。 
		注意：如果使用63倍物镜难以定位样本，可先使用40倍或20倍物镜定位，再切换至63倍物镜。</li>
		<li>开启激光器，点击实时成像（Live），找到位置和状态最佳的精原干细胞（GSC）。避免选择荧光信号较弱或干细胞微环境（hub，niche）远离表面的睾丸样本。 
		注意：在Drosophila睾丸中，精原干细胞附着于hub结构上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整精原干细胞的焦距，并为样本确定合适的成像参数，包括激光功率、电子倍增（EM）增益、图像平均次数以及Airyscan模式下的缩放倍数。以下参数可作为表达EGFP标记的α-微管蛋白的早期生殖细胞Drosophila睾丸样本的参考示例。
	<ol>
		<li>点击帧尺寸（Frame Size），将帧尺寸设置为512 × 512像素至1024 × 1024像素之间。</li>
		<li>点击平均（Averaging），将帧平均次数设为1或2。 
		注意：增大帧尺寸（&#62;1024 × 1024像素）或增加平均次数（即超过2次）可能导致光漂白或光毒性。</li>
		<li>点击激光器（Lasers），将激光功率设置为1%–2%。 
		注意：提高激光功率也可能导致光漂白或光毒性。</li>
		<li>点击主增益（Master Gain），将EM增益设置在推荐值以下（&#60; 800）。 
		注意：过高的EM增益可能产生伪影。</li>
		<li>对目标区域或细胞进行放大，以缩短图像采集时间并减少光漂白。这也有助于延长样本的存活时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击开始实验（Start Experiment），使用Airyscan模式开始延时成像。
	<ol>
		<li>在点击开始实验（Start Experiment）之前，请确保采集参数已优化配置。</li>
		<li>如果出现“Airyscan采集未优化配置”的警告提示，则需在帧尺寸部分点击优化（Optimal），在z层叠部分点击优化（Optimal），并在扫描区域部分点击优化（Optimal）（超分辨率成像至少需要1.3倍的缩放）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据实验设计和样本类型，优化延时成像的时间间隔、z层切片数量和总时长，以确保图像质量不受影响，同时避免细胞停滞在细胞周期的特定阶段。
	<ol>
		<li>例如，以下步骤展示了在早期生殖系中表达EGFP标记α-微管蛋白的Drosophila睾丸延时成像参数设置。</li>
		<li>对于超过5小时的延时成像，以10分钟为时间间隔，使用1%激光功率，并在每个时间点采集最多30个z层切片。</li>
		<li>对于高度动态的细胞过程（如微管动态），将时间点间隔设为2分钟，在1%激光功率下进行1–2小时的延时成像，并在每个时间点采集最多30个z层切片。</li>
		<li>对于罕见的细胞事件（如后期至早末期的染色质动态，持续2–3分钟），设置活细胞成像的时间点间隔为1分钟，在1%激光功率下进行30分钟延时成像，并在每个时间点采集最多30个z层切片。 
		注意：不同样本的参数可能有所差异，需根据具体样本进行调整以达到最佳效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据样本的敏感性和实验设计，选择进行延时成像或活细胞快照成像。 
	注意：短时成像持续15–30分钟，长时成像超过5小时。</li>
	<li>若样本非常敏感，无法通过超分辨率显微镜进行延时成像（如常见的Drosophila雄性精原干细胞），可在不同细胞周期阶段对样本进行超分辨率活细胞快照成像（SRLS）（如图2、图3、图4所示）。
	<ol>
		<li>若需捕捉罕见的细胞生物学事件，或目标蛋白表达水平较低，则应采用SRLS方法。</li>
		<li>进行SRLS时，寻找处于特定细胞周期阶段的目标细胞。例如，若关注微管-动粒结合，则应选择处于前中期或中期的细胞。 
		注意：这有助于在正确的时间获得高质量的目标细胞图像，同时避免因长时间成像导致的光毒性或荧光探针漂白。</li>
		<li>若使用SRLS，应对多个细胞中不同目标细胞周期阶段进行成像，并将这些图像按时间顺序排列。 
		注意：该方法可用于构建事件的时间序列，在最大化信号强度和组织健康状态的前提下，为特别敏感或信号较弱的样本提供优异的时间分辨率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 活细胞图像的Airyscan处理
<ol>
	<li>使用成像软件完成图像采集后，选择 处理，点击 批处理，然后选择 Airyscan 处理。
	<ol>
		<li>选择需要处理的图像，然后点击 运行/处理 以获得超分辨率图像。</li>
		<li>使用默认设置进行处理。 
		注意：仅当成像参数已针对 Airyscan 成像正确设置时，Airyscan 处理才能正常工作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

超分辨率显微技术可实现数十纳米的空间分辨率4,5,6。STORM 和 PALM 显微技术可实现高达 20 至 50 nm 的分辨率（XY 方向），而 STED 显微技术的分辨率为 20 至 100 nm（XY 方向）。SIM 显微技术的空间分辨率则受限于 100 至 130 nm15。然而，由于这些技术具有高光子密度和较长的采集时间，因此在活细胞成像中的应用极为困难。
在组织内的活细胞中对细胞骨架、染色体和细胞器等亚细胞结构进行成像，要求该技术兼具超高灵敏度和非侵入性，同时仍具有高空间分辨率。本文介绍的Airyscan超分辨率技术结合了共聚焦成像与0.2艾里单位针孔，并采用像素重分配和去卷积算法。该技术的空间分辨率可达传统共聚焦显微镜的1.7倍7。传统共聚焦显微镜的分辨率约为220–230 nm，受限于光的衍射极限；而该成像技术...

利用超越光衍射极限的分辨率，在活细胞中可视化亚细胞结构和蛋白质动态通常极具挑战性1-3。尽管已开发出多种超分辨率技术，如随机光学重建显微镜（Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy, STORM）、光激活定位显微镜（Photo-Activated-Localization-Microscopy, PALM）以及受激发射损耗显微镜（Stimulated-Emission-Depletion, STED）4,5,6，但由于样品制备过程复杂，且需要在体外维持样本的活力与生物活性，传统超分辨率显微镜在活体样本成像中的应用仍受到限制。传统的共聚焦显微镜空间分辨率无法突破约230 nm的XY分辨率，通常不足以观察复杂的细胞亚结构5,6。然而，近年来共聚焦显微技术的一项新进展——Airyscan超分辨率成像，能够实现约140 nm的XY分辨率7,8，且样品制备相对简便，适用于活细胞成像。由于该成像检测系统需要较长的采集时间，其高空间分辨率是以牺牲时间分辨率为代价的9。因此，亟需一种方法来实现在高空间分辨率下对活细胞进行长时间成像。
本文中，我们建立了一种在完整组织中以最佳分辨率观察活细胞的方法，以解析具有详细空间信息的亚细胞结构。该方法经过专门设计，可使样品在长时间内（约10小时）稳定固定，避免移动或退化。本技术所用的活细胞培养基可在超分辨率显微镜下维持细胞功能，并防止光漂白长达10小时。最后，该实验方案最大限度地减少了因激光长时间持续照射所导致的多种应激因素，如缺氧、湿度和温度变化以及营养耗竭等。
利用本方案对果蝇（Drosophila）雄性生殖系干细胞（GSCs）进行成像，我们能够观察到微管的不对称活性如何促进其与表观遗传特征不同的姐妹染色单体之间的优先相互作用10,11,12,13。此类细胞事件具有高度动态性，使用其他超分辨率成像方法（如STORM、PALM或STED）在活细胞中极难实现可视化。我们预计，该方法将在细胞生物学领域发挥重要作用，帮助研究人员深入理解组织中活细胞的动态亚细胞结构。该技术可广泛应用于多个研究领域，例如蛋白质动态行为的研究、细胞运动机制的解析，以及谱系追踪和细胞分化过程的探究等。

<table><tbody><tr><td>Adobe Illustrator CS6（绘图软件）</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>透析膜</td><td>Spectra/Por 1-4 标准再生纤维素透析膜</td><td>货号 08-67121</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>货号 26140079</td><td>15% (V/V)</td></tr><tr><td>Fiji（分析软件）</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>图像荧光强度定量</td></tr><tr><td>玻璃底细胞培养皿（FluroDish）</td><td>World Precision Instrument, Inc.</td><td>FD35PDL-100</td><td></td></tr><tr><td>Imaris（图像重建软件）</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>三维图像重建</td></tr><tr><td>浸油</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518F/30 &amp;deg;C</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>货号 15550</td><td>200 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>货号 - 15140-122</td><td>0.6x</td></tr><tr><td>Schneider 果蝇培养基</td><td>Invitrogen</td><td>货号 - 11720-034</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>配备 evolve 相机（Photometrics），使用 63x Zeiss 物镜（1.4 NA）</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Kimwipe</td><td>N/A</td><td>润湿以形成湿室</td></tr><tr><td>配备 AiryScan 超分辨率模块的 LSM 800 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>配备高灵敏度 GaAsP（砷化镓磷）探测器，使用 63x Zeiss 物镜（1.4 NA）</td></tr><tr><td>ZEN（成像软件）</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

在成像技术中，空间分辨率与时间分辨率之间长期存在着关键的权衡。突破光的衍射极限的成像传统上仅限于使用固定样本，或对组织外带有强荧光信号标记的活细胞进行。目前的超分辨率活细胞成像技术需要使用特殊的荧光探针、高强度照明、多次图像采集并结合采集后的图像处理，或通常是这些步骤的组合。这些先决条件极大地限制了该技术可适用的生物样本类型和研究场景。
本文介绍一种在原位进行超分辨率（约140 nm XY分辨率）时间序列荧光活细胞成像的方法。该技术同样适用于荧光强度较低的情况，例如在低表达基因上内源性标记EGFP或mCherry。作为原理验证，我们已利用该方法对果蝇（Drosophila）睾丸中的多种亚细胞结构进行可视化观察。在组织制备过程中，解剖所得的睾丸组织可保持细胞结构和组织形态的完整性。本文中，我们应用该技术对微管动态、微管与核膜之间的相互作用，以及微管与着丝粒的连接情况进行成像观察。
该技术在样品制备、样品安装以及标本固定方面需要特殊的操作步骤。此外，标本在解剖后必须维持数小时，同时不能影响细胞的功能与活性。尽管我们已针对果蝇（Drosophila）雄性生殖系干细胞（GSCs）以及解剖所得睾丸组织中的前体生殖细胞优化了活细胞超分辨率成像的条件，但该技术可广泛适用于多种不同类型的细胞。在生理条件下观察细胞，同时不牺牲空间或时间分辨率的能力，将为致力于解决细胞生物学关键问题的研究人员提供一种不可或缺的工具。

在Drosophila组织中，特别是针对精原干细胞（GSCs），突破衍射极限的活细胞成像为研究细胞周期进程中亚细胞事件的动态变化提供了机会。最近一项利用本实验方案的研究表明，在GSCs中，母体中心体与子代中心体的微管活动在时间上具有不对称性10。母体中心体在进入有丝分裂前约4小时即开始发出微管，而子代中心体仅在有丝分裂起始时才发出微管。来自母体中心体的高度活跃的微管会与核膜相互作用，并诱导极化的核膜破裂（Nuclear Envelope Break Down, NEBD）。局部的核膜破裂发生在靠近干细胞微环境（hub）的一侧，使得母体中心体发出的微管能够进入细胞核，并优先结合更强的姐妹动粒和姐妹着丝粒，从而确保它们被分配至未来的干细胞。这些观察结果表明，存在一种不对称的有丝分裂轴，其中微管、核膜、动粒和着丝粒以时空精确调控的方式相互作用，最终确保染色体的非随机分离10,11,12。</p...

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。

长期以来，成像技术在空间分辨率和时间分辨率之间一直存在关键的权衡。传统上，突破光的衍射极限的成像……

本方案采用常规荧光探针和简单的样本制备技术，在保持成像细胞生理状态的同时，研究高度动态的细胞过程和精细的亚细胞结构。该技术使我们能够在长时间内以超高分辨率和生理条件对细胞过程进行观察，且无需牺牲空间或时间分辨率。首先，将截留分子量为12至14千道尔顿的透析膜剪成小片，并用100微升活细胞培养基浸泡约5分钟。在膜浸泡的同时，将一个50毫升离心管的外圈切成小块，并用70%乙醇对这些小块进行灭菌。用于睾丸解剖和封片时，将十只2至3日龄的麻醉雄性果蝇转移至解剖显微镜下的解剖皿中，使用精细镊子取出睾丸。待所有睾丸收集完毕后，用活细胞培养基清洗睾丸两次，并用移液器枪头将100至150微升活细胞培养基滴加到预先准备好的玻璃底培养皿中。使用精细镊子将果蝇睾丸转移至培养皿中央，并除去除约10微升以外的全部培养基。迅速将预先润湿的膜置于睾丸上，并在膜上放置两到三个小型塑料配重。立即加入100至150微升新鲜活细胞培养基，并将环状物放回培养皿的抬高一侧。将盖玻片放回环上，取一片滤纸在水中浸润后轻轻晃动，再将滤纸放置于盖玻片上。随后，用培养皿盖盖好培养皿，并将其固定在超分辨率显微镜的载物台上。进行生殖系干细胞成像时，打开成像软件并开启透射光。使用63倍物镜对睾丸组织进行聚焦，并打开激光器。点击“Live”以定位生殖干细胞。调整焦距，点击“Frame Size”将帧尺寸设置为512×512至1024×1024像素之间，点击“Averaging”将帧平均值设为1或2。单击“Master Gain”将电子倍增增益设置为低于800，并单击“Lasers”将激光功率设置为1%至2%。放大至目标区域或细胞，以缩短图像采集时间并减少光漂白；在单击“Start Experiment”开始延时图像采集前，请确认图像参数已优化配置。若显示“Airyscan Acquisition is not configured optimally”（Airyscan采集未优化配置），请在“Frame Size”（帧尺寸）、“Z-Stack”（Z层叠）和“Scan Area”（扫描区域）部分单击“Optimal”（优化），并根据实验设计和样本类型优化时间间隔、Z切片数量以及延时成像的持续时间。成像完成后，选择“Processing, Batch”（批处理）和“Airyscan Processing”（Airyscan处理），然后选择需要处理的图像。然后点击“运行流程”以获得超分辨率图像。利用转盘共聚焦显微镜对表达α-微管蛋白GFP的果蝇睾丸进行活细胞成像，可观察到早期生殖细胞中两个中心体的GFP信号强度存在不对称性，表现为母中心体处信号较强，而子中心体处信号相对较弱。这种亮度差异可能反映了微管成核的时间不对称性，但微管的具体形态和数量则无法通过转盘共聚焦显微镜清晰分辨。相比之下，活细胞超分辨率成像能够可视化并量化微管的形态和数量。这种提高的分辨率还揭示了微管不对称成核、延伸以及与核膜相互作用增强的模式。活细胞成像还可以可视化核膜的不对称内陷，但无法观察直接进入细胞核的单个微管。相比之下，这种活细胞超分辨率技术能够通过同时对微管和核纤层进行成像，直接观察这些事件。在中期，使用转盘显微镜可将两个姐妹着丝粒检测为一个信号，但无法观察到微管的中心连接；而超分辨率活体成像则能够在早前期实现对微管与着丝粒连接的可视化。务必在睾丸上覆盖一层膜，以确保成像过程中其不会移动或漂浮，并优化显微镜设置以避免光漂白和光毒性。该方法有多种应用方式，例如可用于研究蛋白质动态、线性应激或细胞防御机制与细胞过程。

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科研

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Biology

生物学

亚细胞结构的超分辨率活细胞成像

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细菌分裂机器的超分辨率成像

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神经元致密核心囊泡的超分辨率成像

活细胞内动态蛋白质的时空信息对于理解生物学过程至关重要。一种称为快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）的超分辨率显微技术能够揭示细菌细胞分裂Z环的独特信息：不仅呈现其珠状结构，还能展示FtsZ蛋白在环内的快速动态行为。...

利用快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）对活体细菌中细胞分裂Z环进行超分辨率成像

四维（4D）成像技术被用于研究活体脊椎动物神经末梢中两种内体之间的行为及其相互作用。这些微小结构的运动在三维空间中得以表征，从而能够确认内体融合和胞吐等事件的发生。...

活体神经末梢中内体动态的四维荧光成像可视化

本文介绍了一种将玻璃支撑脂质双层技术与受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术相结合的方法，用于形成免疫突触。本实验方案的目的是为使用者提供成功实施这两种技术所必需的操作步骤和指导。...

在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

本文概述了一种利用基态耗尽（GSD）超分辨率显微技术在哺乳动物细胞中检测一种或多种血浆和/或细胞内膜蛋白的实验方案。本文讨论了采用此类方法在细胞蛋白可视化与定量分析中的优势及注意事项。...

基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

近期，我们绘制了活细胞中各种蛋白质在初级纤毛内转运的三维（3D）空间路径。本文详细描述了应用于活体初级纤毛的新型3D超分辨率荧光成像技术的实验装置、生物样本处理过程以及数据分析方法。...

高速超分辨率SPEED显微镜在活体初级纤毛中的应用

超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

本方案概述了使用配备光学光子重分配功能的转盘共聚焦显微镜进行深层全细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像的实验步骤，从而无需定制光学元件或复杂照明即可实现DNA-PAINT成像。...

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120...

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

学习超分辨率活细胞成像技术，用于观察果蝇睾丸中动态细胞过程及亚细胞结构。该方法可在保持生理条件下实现长时间高分辨率成像，揭示微管动力学和不对称核膜相互作用。

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

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