超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

本方案采用常规荧光探针和简单的样本制备技术，在保持成像细胞生理状态的同时，研究高度动态的细胞过程和精细的亚细胞结构。该技术使我们能够在长时间内以超高分辨率和生理条件对细胞过程进行观察，且无需牺牲空间或时间分辨率。首先，将截留分子量为12至14千道尔顿的透析膜剪成小片，并用100微升活细胞培养基浸泡约5分钟。

在膜浸泡的同时，将一个50毫升离心管的外圈切成小块，并用70%乙醇对这些小块进行灭菌。用于睾丸解剖和封片时，将十只2至3日龄的麻醉雄性果蝇转移至解剖显微镜下的解剖皿中，使用精细镊子取出睾丸。待所有睾丸收集完毕后，用活细胞培养基清洗睾丸两次，并用移液器枪头将100至150微升活细胞培养基滴加到预先准备好的玻璃底培养皿中。

使用精细镊子将果蝇睾丸转移至培养皿中央，并除去除约10微升以外的全部培养基。迅速将预先润湿的膜置于睾丸上，并在膜上放置两到三个小型塑料配重。立即加入100至150微升新鲜活细胞培养基，并将环状物放回培养皿的抬高一侧。

将盖玻片放回环上，取一片滤纸在水中浸润后轻轻晃动，再将滤纸放置于盖玻片上。随后，用培养皿盖盖好培养皿，并将其固定在超分辨率显微镜的载物台上。进行生殖系干细胞成像时，打开成像软件并开启透射光。

使用63倍物镜对睾丸组织进行聚焦，并打开激光器。点击“Live”以定位生殖干细胞。调整焦距，点击“Frame Size”将帧尺寸设置为512×512至1024×1024像素之间，点击“Averaging”将帧平均值设为1或2。

单击“Master Gain”将电子倍增增益设置为低于800，并单击“Lasers”将激光功率设置为1%至2%。放大至目标区域或细胞，以缩短图像采集时间并减少光漂白；在单击“Start Experiment”开始延时图像采集前，请确认图像参数已优化配置。若显示“Airyscan Acquisition is not configured optimally”（Airyscan采集未优化配置），请在“Frame Size”（帧尺寸）、“Z-Stack”（Z层叠）和“Scan Area”（扫描区域）部分单击“Optimal”（优化），并根据实验设计和样本类型优化时间间隔、Z切片数量以及延时成像的持续时间。成像完成后，选择“Processing, Batch”（批处理）和“Airyscan Processing”（Airyscan处理），然后选择需要处理的图像。

然后点击“运行流程”以获得超分辨率图像。利用转盘共聚焦显微镜对表达α-微管蛋白GFP的果蝇睾丸进行活细胞成像，可观察到早期生殖细胞中两个中心体的GFP信号强度存在不对称性，表现为母中心体处信号较强，而子中心体处信号相对较弱。这种亮度差异可能反映了微管成核的时间不对称性，但微管的具体形态和数量则无法通过转盘共聚焦显微镜清晰分辨。

相比之下，活细胞超分辨率成像能够可视化并量化微管的形态和数量。这种提高的分辨率还揭示了微管不对称成核、延伸以及与核膜相互作用增强的模式。活细胞成像还可以可视化核膜的不对称内陷，但无法观察直接进入细胞核的单个微管。

相比之下，这种活细胞超分辨率技术能够通过同时对微管和核纤层进行成像，直接观察这些事件。在中期，使用转盘显微镜可将两个姐妹着丝粒检测为一个信号，但无法观察到微管的中心连接；而超分辨率活体成像则能够在早前期实现对微管与着丝粒连接的可视化。

务必在睾丸上覆盖一层膜，以确保成像过程中其不会移动或漂浮，并优化显微镜设置以避免光漂白和光毒性。该方法有多种应用方式，例如可用于研究蛋白质动态、线性应激或细胞防御机制与细胞过程。