小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

利用该技术生成的数据有助于深入理解自身免疫倾向的小鼠模型以及人源化小鼠模型，这些模型可用于通用抗体或抗体生命周期相关治疗研究。随着带有不断扩展的荧光染料的试剂日益可得，可对单个细胞的多个参数进行同步分析，从而实现对B细胞异质性的评估。本方案的开发旨在对基因工程小鼠进行表型分析。

以确定基因操作是否会改变B细胞的发育。大家好，我是Faith Harris，今天我将演示该实验操作。

首先，从每只动物中分别取每种细胞类型一百万个，分装至96孔U型底培养板中。确保为所有样本和对照组（包括每种荧光染料的全染样本、单荧光减一对照样本以及未染色对照样本）预留足够的孔位。对于骨髓成熟分析组和脾脏成熟分析组，将细胞分装至两个孔中，每个全染样本每孔含一百万个细胞。

对于单色补偿活力对照，将每种细胞类型的两百万个细胞分别加入到单独的孔中。在4摄氏度下，以845 × g离心两分钟。将板快速倒置并在水槽上方轻弹以弃去上清液，注意避免孔之间的交叉污染。

用 200 微升 DPBS 洗涤细胞两次。每次洗涤后离心并弃去上清液。将细胞重悬于 100 微升活力染料中，该染料以 1:1000 的比例用 DPBS 稀释，避免使用用于单色补偿的细胞。

对于每组染色，需保留若干未染色的孔，用于完全未染色的样本及其他可能需要的对照，另设一个额外的未染色孔用于活率FMO对照。向这些孔中加入PBS。将单色补偿的活率对照细胞重悬于200 µL稀释后的活率染料中。

将100微升这些细胞转移至1.5毫升微量离心管中，在65摄氏度下加热5分钟，然后将加热后的细胞重新转移回含有剩余活细胞的原始孔中。在4摄氏度下避光孵育30分钟。孵育结束后，离心细胞，并通过轻弹或倒置培养板的方式弃去上清液，注意避免与其他孔发生交叉污染。

用200微升DPBS重悬细胞进行洗涤，然后像之前一样离心并弃去上清液。重复DPBS洗涤一次。加入适量微升的FC阻断剂，用染色缓冲液按1:50的比例稀释，使其终浓度为每毫升10微克。

对于腹膜细胞，加入五微升单核细胞阻断剂以减少非特异性染色。然后将细胞在4摄氏度避光孵育15分钟。根据文稿中的抗体表格，在染色缓冲液中配制完整的染色母液和FMO对照，每百万细胞终体积为100微升。

不移除FC封闭液，向选定的孔中加入100微升完整的染色混合液以及FMO对照。为每种抗体和染色组合制备单色补偿对照。若使用补偿微珠，请遵循生产商的说明。

将细胞和磁珠置于 4 摄氏度孵育 30 分钟，避光。然后离心，通过倒置并轻弹培养板弃去上清液。用 200 µL 染色缓冲液洗涤细胞和磁珠三次，每次均需离心并弃去上清液。

将细胞和磁珠重悬于 200 微升含 2% 多聚甲醛的 DPBS 中，以固定样品用于分析。将细胞和磁珠在 4 摄氏度避光孵育 30 分钟，然后离心，并通过倒置或轻弹培养板去除上清液。将细胞和磁珠重悬于 200 微升染色缓冲液中。

将滤板置于洁净的96孔U型底板上，使用多通道移液器将每个样本转移至滤板的各孔中。离心滤板后弃去上清液。对于骨髓和脾脏成熟分析组，将完全染色的细胞重悬于100 µL染色缓冲液中。

将每只动物的两个孔合并为一个孔。用200微升染色缓冲液重悬剩余的检测 panel、FMO 及对照样本。将固定的细胞和磁珠在4°C避光条件下孵育过夜。

使用已制备的单染对照为每个染色组合记录补偿对照，并为每个样本设置阳性与阴性门控。利用软件计算补偿矩阵。开始采集第一个样本，确保门控设置恰当。

按照文稿中所述，设置仪器运行并记录每个样本的各种细胞事件。使用流式细胞术分析软件进行数据分析，并遵循文稿中所述的设门策略。对小鼠腹腔B细胞的流式细胞术分析可显示腹腔活细胞、总B细胞、B-1和B-2亚群，以及B-1a和B-1b细胞的比例。

分析骨髓B细胞时，检测了小鼠中活细胞、总B细胞、A亚群、前前B细胞、B亚群、C亚群、C'亚群、D亚群、未成熟E亚群、过渡期E亚群以及F亚群B细胞的比例。脾脏B细胞分析显示了小鼠脾脏中活脾细胞、总B细胞、过渡期B细胞、T1、T2、T3细胞、成熟B细胞、滤泡I型细胞、滤泡II型细胞、边缘区前体及成熟细胞和B-1细胞的比例。通过脾脏的流式细胞术分析，确定了小鼠免疫球蛋白κ和免疫球蛋白λB细胞的比例。

在执行该方案时，需要使用补偿对照来消除一个检测器信号溢出到下一个检测器的问题。这些对照可以是单独染色的细胞，也可以是市售的补偿微球。此外，可将其他检测方法与流式细胞术联合使用，例如免疫组织化学用于可视化淋巴器官内的细胞定位，以及双光子显微镜用于在真实空间和时间内分析B细胞反应。

通过流式细胞术分析B细胞区室，可对与BCR及相关缺陷、BCR信号分子异常或调控B细胞存活的细胞因子紊乱相关的表型进行表征。