Name: 小鼠B细胞发育的流式细胞学表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 了解流式细胞术表征小鼠B细胞发育异质性的方法。该技术适用于腹腔、脾脏和骨髓等多种组织，可用于分析基因工程小鼠的B细胞表型，为自身免疫疾病研究提供重要工具。

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感谢 Matthew Sleeman 对手稿的审阅。我们还要感谢再生元公司动物实验中心和流式细胞术核心部门对本研究的支持。

所有小鼠实验均由再生元公司机构动物照护与使用委员会（IACUC）监督并批准。实验使用来自杰克逊实验室的三只雌性C57BL/6J小鼠（17周龄）的组织进行。在开始实验前应对所有抗体进行滴定，以确定最佳浓度。使用补偿微珠进行单色补偿时，应确保其染色强度等于或高于样本的染色强度。所有缓冲液、抗体和细胞均需置于冰上或4 °C保存。加入活率染料后，所有步骤和孵育均需在4°C下避光或在低光照条件下进行。
1. 腹腔细胞收获与单细胞分离
<ol>
	<li>使用 CO2 或根据批准的方案对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，喷洒70%乙醇消毒，用剪刀剪开腹部外层皮肤，注意不要剪破腹膜。</li>
	<li>使用装有25号针头的3 mL注射器，向腹腔内注射3 mL冰上预冷的洗涤缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的DPBS [体积比]）。</li>
	<li>用手指轻轻按摩腹膜。</li>
	<li>重复步骤1.3和1.4。</li>
	<li>将装有18号针头的3 mL注射器插入腹膜，注意避开器官和脂肪组织。</li>
	<li>吸取含有腹腔细胞的洗涤缓冲液，并转移至冰上的15 mL锥形管中。</li>
	<li>重复步骤1.3和1.4。</li>
	<li>用镊子提起腹膜，剪出一个小孔。</li>
	<li>将一次性移液管插入小孔，收集残留的洗涤缓冲液，再次注意避开脂肪和器官。</li>
	<li>将收集的剩余腹腔细胞转移至冰上的15 mL锥形管中。 
	注意：若发现明显血液污染，请弃去样本。</li>
	<li>将细胞置于冰上孵育，直至完成脾脏和骨组织的提取。</li>
	<li>在4 ˚C条件下，以300 x g 离心8分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用1 mL洗涤缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞通过70 µM细胞筛滤入冰上预冷的干净15 mL锥形管中。</li>
	<li>使用细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞浓度。</li>
</ol>
2. 脾脏采集与单细胞分离
<ol>
	<li>将小鼠腹部朝下放置，使用干净的剪刀从左侧背部切开腹膜。取出脾脏，并去除脂肪和结缔组织。</li>
	<li>将脾脏转移至含有1 mL冰上预冷洗涤缓冲液的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将脾脏置于冰上孵育，直至完成骨组织提取。</li>
	<li>将脾脏转移至含有5 mL红细胞裂解缓冲液的自动解离管中。将管子放入组织解离仪，解离60秒以制备单细胞悬液。 
	注意：也可采用其他常规方法制备单细胞脾脏悬液，例如在含洗涤缓冲液的磨砂玻璃片之间研磨。若使用其他解离方法，需在完成解离后进行离心、吸除上清，再将细胞重悬于5 mL红细胞裂解缓冲液中，然后继续执行步骤2.5。</li>
	<li>在室温下孵育细胞3分钟。</li>
	<li>加入10 mL含2 mM EDTA的4 °C洗涤缓冲液。</li>
	<li>转移至干净的15 mL锥形管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以300 × g 离心8分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用5 mL 4 °C洗涤缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞悬液通过70 µM细胞滤筛过滤至置于冰上的干净15 mL锥形管中。</li>
	<li>使用细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞浓度。</li>
</ol>
3. 骨髓采集与单细胞分离
<ol>
	<li>去除小鼠身体下半部分的皮肤。修剪腿部多余的肌肉。用剪刀将整条腿取下，注意不要剪断股骨。通过去除残留的肌肉、脂肪和足部组织，清洁股骨和胫骨。</li>
	<li>将骨骼转移至含有1 mL冰上预冷洗涤缓冲液的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>在0.5 mL微量离心管底部打孔，孔径应足够小，以防止腿骨突出。将该0.5 mL管插入一个干净的1.5 mL微量离心管中。剪去股骨和胫骨靠近膝关节一端的末端，并将切面朝下插入0.5 mL管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以6,780 ×g离心2分钟，收集细胞。</li>
	<li>用1 mL红细胞裂解缓冲液重悬细胞沉淀，并转移至含有额外3 mL红细胞裂解缓冲液的15 mL锥形管中。</li>
	<li>室温孵育3分钟。</li>
	<li>加入10 mL含2 mM EDTA的4 °C洗涤缓冲液。</li>
	<li>在4 °C条件下，以300 × g离心8分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用3 mL 4 °C洗涤缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞通过70 µm细胞筛滤器，滤入置于冰上的干净15 mL锥形管中。</li>
	<li>使用细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞浓度。</li>
</ol>
4. 染色细胞并制备补偿
<ol>
	<li>从每只动物的每种细胞类型中取106个细胞，分装至96孔U型底板中。
	<ol>
		<li>确保预留足够的孔位用于所有样本和对照，包括全染样本、荧光减一对照（FMO）、未染色对照，以及每种所用荧光染料的可选单色补偿对照。</li>
		<li>对于骨髓成熟检测 panel 和脾脏成熟检测 panel，每种全染样本将细胞分装至2个孔中，每孔106个细胞。对于单色补偿活力对照，将每种细胞类型的2 × 106个细胞分别加入单独的孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C条件下，以845 × g离心2分钟。将板快速倒置并在水槽上方轻弹以弃去上清液，注意避免孔间交叉污染。</li>
	<li>用200 µL DPBS（不含BSA或FBS）重悬细胞。此步骤至关重要，旨在染色前去除蛋白，避免影响胺反应性活力染料的染色效果。</li>
	<li>重复步骤4.2和4.3。</li>
	<li>重复步骤4.2。</li>
	<li>用100 µL以DPBS按1:1,000稀释的活力染料重悬细胞。 
	&#8203;注意：若样本用于单色补偿，请勿向这些孔中添加活力染料。
	<ol>
		<li>对于每组染色样本，保留若干未染色孔，用于完全未染色样本及其他所需对照。</li>
		<li>对于每组染色样本，额外保留一个未染色孔，用于活力FMO对照。</li>
		<li>对于单色活力补偿对照：将步骤4.1中分装的2 × 106个细胞用200 µL稀释的活力染料重悬。取100 µL细胞转移至1.5 mL微量离心管中，在65 °C加热5分钟，然后将100 µL热灭活细胞转移回原孔，与剩余的100 µL活细胞混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C避光条件下孵育细胞30分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以845 × g离心2分钟。将板快速倒置并在水槽上方轻弹以弃去上清液，注意避免孔间交叉污染。</li>
	<li>用200 µL DPBS（不含BSA或FBS）重悬细胞。</li>
	<li>重复步骤4.8和4.9。</li>
	<li>重复步骤4.8。</li>
	<li>用50 µL以染色缓冲液（DPBS中含0.5% BSA [vol/vol]）按1:50稀释的Fc阻断剂（终浓度为10 µg/mL）重悬细胞。
	<ol>
		<li>对于腹膜细胞——还需加入5 µL单核细胞阻断剂，以减少非特异性染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C避光条件下孵育细胞15分钟。</li>
	<li>在染色缓冲液中配制全染母液和FMO对照，每106个细胞终体积为100 µL。抗体列表详见表1-表4。 
	&#8203;注意：FMO通过在染色组合中排除某一种抗体而制备。每种抗体均需制备相应的FMO对照。当染色组合中包含多种 brilliant 染料时，每份样本用50 µL brilliant 染色缓冲液替代染色缓冲液。</li>
	<li>不移除Fc阻断剂，直接向选定孔中加入100 µL全染母液或FMO混合液。</li>
	<li>为每组染色组合中的每种抗体制备单色补偿对照。
	<ol>
		<li>若使用补偿微珠，请遵循制造商提供的使用说明。</li>
		<li>若使用细胞，将已滴定的抗体加入步骤4.6.1中预先保留的106个细胞（不含活力染料）中，用100 µL染色缓冲液重悬。若样本中所有细胞均表达某一特定标志物，请单独保留未染色细胞，用于流式细胞仪获取补偿数据时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C避光条件下孵育细胞和微珠30分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以845 × g离心2分钟。将板快速倒置并在水槽上方轻弹以弃去上清液，注意避免孔间交叉污染。</li>
	<li>用200 µL染色缓冲液重悬细胞和微珠。</li>
	<li>重复步骤4.18和4.19两次。</li>
	<li>重复步骤4.18。</li>
	<li>若需在48小时内完成分析，用200 µL含2%多聚甲醛的DPBS重悬细胞和微珠。 
	警告：多聚甲醛具有严重健康危害且易燃。使用前请查阅安全数据表（Safety Data Sheet）。</li>
	<li>在4 °C避光条件下孵育细胞和微珠30分钟。</li>
	<li>重复步骤4.18和4.19两次。</li>
	<li>将滤板置于洁净的96孔U型底板上。使用多通道移液器将各样本转移至滤板的各孔中。</li>
	<li>将滤板与96孔U型底板组合装置在4 °C条件下以845 × g离心2分钟。移除滤板，将U型底板快速倒置并在水槽上方轻弹以弃去上清液，注意避免孔间交叉污染。</li>
	<li>对于骨髓和脾脏成熟检测 panel，将完全染色的细胞用100 µL染色缓冲液重悬，并将每只动物的2个孔合并至1个孔中。其余 panel、FMO及对照用200 µL染色缓冲液重悬。</li>
	<li>将固定后的细胞和微珠在4 °C避光条件下孵育过夜。</li>
</ol>
5. 流式细胞术数据采集
<ol>
	<li>根据制造商说明启动并进行流式细胞仪的质量控制。</li>
	<li>加载每个检测面板对应的模板。</li>
	<li>在记录数据前，确保每个样本的所有事件均在散点图的量程范围内且可见。</li>
	<li>使用步骤 4.16 中制备的单染对照，为每个染色面板记录补偿对照。为每个样本设置阳性与阴性门控，并由软件计算补偿矩阵。</li>
	<li>开始采集第一个样本，确保门控设置恰当。</li>
	<li>设置仪器记录至少 50,000 个B细胞事件用于腹腔B细胞面板和脾脏Igκ与Igλ面板；150,000 个B细胞事件用于骨髓成熟面板；以及 300,000 个B细胞事件用于脾脏成熟面板。</li>
	<li>针对每个染色面板，运行并记录每只动物的完全染色样本、未染色样本以及荧光减一对照（FMOs）。</li>
</ol>
6. 分析数据
<ol>
	<li>使用流式细胞术分析软件进行数据分析。遵循 图1、 图2、图3、&#160;图4 中所示的设门策略。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均为 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 的员工和股东。

自20世纪80年代以来，对淋巴组织和非淋巴组织进行流式细胞术分析，已能够同时鉴定并计数小鼠和人类中的B细胞亚群。该方法已被用作体液免疫的评估手段，并可进一步用于评价B细胞的功能特性。本方法利用现有试剂，通过同时分析多个参数，评估小鼠和人类B细胞成熟的不同阶段，从而揭示B细胞的异质性，即使在稀有细胞群体中亦可实现。当用于检测复杂且异质性的样本时，可在数分钟内对单个细胞进行亚群检测33。在流式细胞术分析中，最常采用的逐级设门分析策略，在需要鉴定特定细胞群时，通常简单而直观34。最后，流式细胞术的另一优势在于其易于在大多数学术实验室中开展，尤其在有经验的操作者指导下更为便捷。本实验方案详细描述了通过鉴定和计数B-1细胞群，并深入分析B-2细胞发育过程中的前B细胞、未成熟B细胞、过渡期B细胞及成熟B细胞，以及它们表面Igκ或Igλ轻链的表达情况，从而对小鼠腹膜、骨髓（BM）和脾脏中的B细胞群体进行评估。在研究小鼠B细胞发育时，流式细胞术是最广泛使用且最简便的方法。
尽管流式细胞术能够产生极为宝贵...

单克隆抗体随着逐渐成为主流医学的一部分，已日益成为治疗多种人类疾病的首选疗法1,2。我们此前已描述过经基因工程改造的小鼠，其能高效产生携带完全人源可变区并具有小鼠IgH恒定区的抗体3,4。最近，我们进一步描述了可产生具有独特抗原结合能力的类抗体分子的基因工程小鼠5。抗体由B细胞分泌，是适应性体液免疫的基础。B细胞分为两种不同类型：B-1和B-2。在哺乳动物中，B-1细胞起源于胎儿肝脏，出生后富集于黏膜组织以及胸膜腔和腹膜腔；而B-2细胞在出生前起源于胎儿肝脏，出生后则主要在骨髓（BM）中产生。B-2细胞富集于包括脾脏和血液在内的次级淋巴器官6,7,8。在骨髓中，B-2造血祖细胞在免疫球蛋白μ重链重排启动后开始分化为前B细胞（pro-B细胞）9,10。免疫球蛋白重链成功重排并组装成前B细胞受体（pre-BCR），伴随信号传导和增殖性扩增，促使细胞进一步分化为前B细胞。前B细胞随后重排其Igκ轻链，若重排无效则重排Igλ轻链，这些轻链与μ重链配对，最终导致表面IgM BCR的表达。需要指出的是，在自身反应性条件下，IgM的表面表达已知会降低，从而有助于功能上无反应性或无能B细胞的自身耐受11,12。未成熟B细胞随后进入过渡阶段，开始共表达IgD，并从骨髓迁移至脾脏。在脾脏中，IgD表达进一步增强，细胞发育为第二阶段的过渡性B细胞，随后完成成熟过程，最终分化为边缘区（MZ）或滤泡（Fol）B细胞13,14,15。在成年小鼠中，在无疾病状态下，尽管骨髓每天生成1000万至2000万个未成熟B细胞，成熟B细胞的数量仍保持恒定。其中仅有约3%的细胞进入成熟B细胞池。外周B细胞区室的大小受到细胞死亡的限制，部分原因包括自身反应性和不完全成熟等因素16,17,18。流式细胞术已被广泛用于对人体和小鼠多种免疫细胞亚群的表征与计数。尽管人和小鼠的B细胞区室之间存在一些相似性，但本方案仅适用于小鼠B细胞的分析。本方案的建立旨在对基因工程小鼠进行表型分析，以确定基因操作是否会影响B细胞的发育。此外，流式细胞术在众多其他应用中也极为流行，包括细胞活化、功能、增殖、周期分析、DNA含量分析、凋亡检测以及细胞分选等19,20。
流式细胞术是表征小鼠和人类各种淋巴细胞区室的首选工具，包括脾脏、骨髓和血液等复杂器官。由于流式细胞术所用的小鼠特异性抗体试剂广泛可得，该技术不仅可用于检测细胞表面蛋白，还可用于检测细胞内磷酸化蛋白和细胞因子，以及功能性读数21在此，我们展示了如何利用流式细胞术试剂鉴定B细胞在次级淋巴器官中成熟和分化过程中的不同亚群。在优化染色条件、样本处理、仪器正确设置与数据采集，以及最终的数据分析后，可采用一种针对小鼠B细胞区室的全面流式细胞术分析方案。该全面分析基于Hardy及其同事提出的已有数十年历史的命名系统，根据B220、CD43、BP-1、CD24、IgM和IgD的表达情况，可将骨髓中发育中的B-2细胞划分为不同的组分（Fraction）。22. Hardy 等人表明，B220+ CD43+ 骨髓B细胞可根据BP-1和CD24（30F1）的表达进一步分为四个亚群（Fraction A–C'），而B220+ CD43（弱至阴性） 骨髓B细胞可根据IgD和表面IgM的差异表达分为三个亚群（D-F亚群）23. A组分（前-前B细胞）定义为BP-1- CD24 (30F1)-，B组分（早期前B细胞）定义为BP-1- CD24 (30F1)+，C组分（晚期前B细胞）定义为BP-1+ CD24 (30F1)+，以及组分 C'（早期前B细胞）定义为BP-1+ 和 CD24高此外，D组分（前B细胞）被定义为B220+ CD43- IgM- B细胞以及E组分（新生成的B细胞，包括未成熟和过渡期B细胞）被定义为B220+ CD43- IgM+ B细胞和F组分（成熟再循环B细胞）定义为B220高 CD43- IgM+ B细胞。相比之下，脾脏中大多数初始B细胞可被分为成熟型（B220+ CD93-) B细胞和过渡期（T1、T2、T3）细胞，依据CD93、CD23和IgM的表达情况进行区分。成熟B细胞可根据IgM和CD21/CD35的表达分为边缘区和滤泡型亚群，而滤泡型亚群可进一步根据其表面IgM和IgD的表达水平细分为成熟滤泡I型和滤泡II型B细胞亚群24这些脾脏B细胞群体主要表达Igκ轻链。最后，文献中还描述了起源于胎肝并在成年小鼠腹膜腔和胸膜腔中主要存在的B-1 B细胞群体。这些腹膜B细胞可通过不表达CD23的特征与前述的B-2 B细胞相区分。随后，它们进一步被划分为B-1a和B-1b两个亚群，前者表达CD5，后者则不表达CD5。25B-1细胞前体在胎肝中含量丰富，但在成年骨髓中不存在。尽管B-1a和B-1b细胞来源于不同的前体细胞，但二者均定植于腹膜腔和胸膜腔。24与B-2细胞不同，B-1细胞具有独特的自我更新能力，并负责天然IgM抗体的产生。
B细胞发育缺陷可能由多种因素引起，包括BCR组分的缺陷26,27、影响BCR信号强度的信号分子异常14,28,29，或调控B细胞存活的细胞因子受到干扰30,31。对淋巴组织区室进行流式细胞术分析，有助于表征这些小鼠以及其他模型中B细胞发育受阻的情况。流式细胞术分析淋巴组织区室的一个优势在于，能够对来自活体解离组织的单个细胞进行测量。随着荧光染料种类不断扩展，试剂日益丰富，使得多个参数可被同时分析，从而实现对B细胞异质性的评估。此外，通过流式细胞术对B细胞进行计数，可与其他免疫学检测方法相互补充，例如用于可视化淋巴器官内细胞定位的免疫组织化学技术、以循环抗体水平检测来评估体液免疫的方法，以及利用双光子显微镜在真实时空条件下监测B细胞反应的技术32。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 安全锁 Eppendorf 管</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>22363611</td><td>0.5 mL 微量离心管</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>22364111</td><td>1.5 mL 微量离心管</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td>15 mL 圆锥形管</td></tr><tr><td>18 号针头</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>70 mM MACS SmartStrainer&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-110-916&amp;nbsp;</td><td>70 mM 细胞筛</td></tr><tr><td>96 孔 U 型底板&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>GIBCO&amp;nbsp;</td><td>A1049201</td><td>红细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Acroprep Advance 96 孔滤板</td><td>Pall Corporation</td><td>8027</td><td>滤板</td></tr><tr><td>B220</td><td>eBiosciences</td><td>17-0452-82</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&amp;kappa;</td><td>BD</td><td>552843</td><td>补偿微珠</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&amp;kappa;</td><td>BD</td><td>552844</td><td>补偿微珠</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A8577</td><td>BSA</td></tr><tr><td>BP-1</td><td>BD</td><td>740882</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD</td><td>566349</td><td>荧光染色缓冲液</td></tr><tr><td>C-Kit</td><td>BD</td><td>564011</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35</td><td>BD</td><td>562756</td><td></td></tr><tr><td>CD23&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>740216</td><td></td></tr><tr><td>CD24 (HSA)</td><td>BioLegend</td><td>138504</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>561388</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BioLegend</td><td>100214</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BD</td><td>553270</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BioLegend</td><td>121206</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>BD</td><td>563194</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BD</td><td>740750</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BioLegend</td><td>136504</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>eBioscience 可固定活力染料 eFluor 506</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td>活力染料</td></tr><tr><td>Extended Fine Tip 转移移液管</td><td>Samco</td><td>233</td><td>一次性转移移液管</td></tr><tr><td>FACSymphony A3 流式细胞仪</td><td>BD</td><td>custom order</td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>Fc 阻断剂，CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>BD</td><td>553142</td><td>Fc 阻断剂</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Flowjo</td><td></td><td>流式细胞仪分析软件</td></tr><tr><td>gentleMACS C 管&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-096-334</td><td>自动化解离管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS Octo 解离仪（带加热模块）&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-095-937</td><td>组织解离仪</td></tr><tr><td>GR1 (Ly6C/6G)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>IgD</td><td>BioLegend</td><td>405710</td><td></td></tr><tr><td>IgM</td><td>eBiosciences</td><td>25-5790-82</td><td></td></tr><tr><td>Kappa</td><td>BD</td><td>550003</td><td></td></tr><tr><td>Lambda</td><td>BioLegend</td><td>407308</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，32% 溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Ter119</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>True-Stain 单核细胞阻断剂</td><td>BioLegend</td><td>426103</td><td>单核细胞阻断剂</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA，pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575038</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>细胞计数仪&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

小鼠b细胞发育的流式细胞术表征

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

大量研究已对小鼠B细胞在次级淋巴器官中的发育和分化过程进行了表征。由B细胞分泌的抗体已被分离并开发为成熟的治疗手段。在易患自身免疫疾病的小鼠或免疫系统经过改造的小鼠中，验证B细胞的发育情况，是开发或测试小鼠治疗药物的重要环节，也适合采用流式细胞术进行分析。已有成熟的小鼠B细胞流式细胞术检测参数可用于评估腹膜、骨髓和脾脏中的B细胞发育，但必须遵循一系列最佳实践操作。此外，B细胞区室的流式细胞术分析还应结合其他B细胞发育的检测指标。利用该技术获得的数据可进一步加深我们对野生型小鼠、易患自身免疫疾病的小鼠模型以及人源化小鼠的理解，后者可用于生成抗体或类抗体分子作为治疗药物。

本文展示了小鼠腹膜、骨髓和脾脏中B细胞发育的设门策略。分析的基础是先使用活力染料染色，然后根据前向散射面积（FSC-A）和前向散射高度（FSC-H）排除双联体细胞，最后通过前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）的特征选择细胞，以去除碎片，此步骤称为大小设门，反映细胞的相对大小和颗粒度，之后再对目标细胞群进行设门分析。
腹腔B细胞的流式细胞术分析显示了C57BL/6J小鼠中活细胞、总B细胞、B-1和B-2亚群以及B-1a和B-1b细胞在腹腔细胞中的比例（图1），所用染色方案见表1。这些比例对应的平均绝对细胞数量见表5。B-1细胞的异常可通过细胞亚群的分布情况来界定，该分布可基于细胞比例或每只小鼠的绝对细胞数进行分析。
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

本文介绍了一种通过流式细胞术对小鼠腹膜、脾脏和骨髓组织中免疫B细胞区室异质性的简单分析方法。该方案可适用于并扩展至其他小鼠组织。

小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

已有大量研究对小鼠B细胞在次级淋巴器官中的发育与分化进行了表征。由B细胞分泌的抗体……

利用该技术生成的数据有助于深入理解自身免疫倾向的小鼠模型以及人源化小鼠模型，这些模型可用于通用抗体或抗体生命周期相关治疗研究。随着带有不断扩展的荧光染料的试剂日益可得，可对单个细胞的多个参数进行同步分析，从而实现对B细胞异质性的评估。本方案的开发旨在对基因工程小鼠进行表型分析。以确定基因操作是否会改变B细胞的发育。大家好，我是Faith Harris，今天我将演示该实验操作。首先，从每只动物中分别取每种细胞类型一百万个，分装至96孔U型底培养板中。确保为所有样本和对照组（包括每种荧光染料的全染样本、单荧光减一对照样本以及未染色对照样本）预留足够的孔位。对于骨髓成熟分析组和脾脏成熟分析组，将细胞分装至两个孔中，每个全染样本每孔含一百万个细胞。对于单色补偿活力对照，将每种细胞类型的两百万个细胞分别加入到单独的孔中。在4摄氏度下，以845 × g离心两分钟。将板快速倒置并在水槽上方轻弹以弃去上清液，注意避免孔之间的交叉污染。用 200 微升 DPBS 洗涤细胞两次。每次洗涤后离心并弃去上清液。将细胞重悬于 100 微升活力染料中，该染料以 1:1000 的比例用 DPBS 稀释，避免使用用于单色补偿的细胞。对于每组染色，需保留若干未染色的孔，用于完全未染色的样本及其他可能需要的对照，另设一个额外的未染色孔用于活率FMO对照。向这些孔中加入PBS。将单色补偿的活率对照细胞重悬于200 µL稀释后的活率染料中。将100微升这些细胞转移至1.5毫升微量离心管中，在65摄氏度下加热5分钟，然后将加热后的细胞重新转移回含有剩余活细胞的原始孔中。在4摄氏度下避光孵育30分钟。孵育结束后，离心细胞，并通过轻弹或倒置培养板的方式弃去上清液，注意避免与其他孔发生交叉污染。用200微升DPBS重悬细胞进行洗涤，然后像之前一样离心并弃去上清液。重复DPBS洗涤一次。加入适量微升的FC阻断剂，用染色缓冲液按1:50的比例稀释，使其终浓度为每毫升10微克。对于腹膜细胞，加入五微升单核细胞阻断剂以减少非特异性染色。然后将细胞在4摄氏度避光孵育15分钟。根据文稿中的抗体表格，在染色缓冲液中配制完整的染色母液和FMO对照，每百万细胞终体积为100微升。不移除FC封闭液，向选定的孔中加入100微升完整的染色混合液以及FMO对照。为每种抗体和染色组合制备单色补偿对照。若使用补偿微珠，请遵循生产商的说明。将细胞和磁珠置于 4 摄氏度孵育 30 分钟，避光。然后离心，通过倒置并轻弹培养板弃去上清液。用 200 µL 染色缓冲液洗涤细胞和磁珠三次，每次均需离心并弃去上清液。将细胞和磁珠重悬于 200 微升含 2% 多聚甲醛的 DPBS 中，以固定样品用于分析。将细胞和磁珠在 4 摄氏度避光孵育 30 分钟，然后离心，并通过倒置或轻弹培养板去除上清液。将细胞和磁珠重悬于 200 微升染色缓冲液中。将滤板置于洁净的96孔U型底板上，使用多通道移液器将每个样本转移至滤板的各孔中。离心滤板后弃去上清液。对于骨髓和脾脏成熟分析组，将完全染色的细胞重悬于100 µL染色缓冲液中。将每只动物的两个孔合并为一个孔。用200微升染色缓冲液重悬剩余的检测 panel、FMO 及对照样本。将固定的细胞和磁珠在4°C避光条件下孵育过夜。使用已制备的单染对照为每个染色组合记录补偿对照，并为每个样本设置阳性与阴性门控。利用软件计算补偿矩阵。开始采集第一个样本，确保门控设置恰当。按照文稿中所述，设置仪器运行并记录每个样本的各种细胞事件。使用流式细胞术分析软件进行数据分析，并遵循文稿中所述的设门策略。对小鼠腹腔B细胞的流式细胞术分析可显示腹腔活细胞、总B细胞、B-1和B-2亚群，以及B-1a和B-1b细胞的比例。分析骨髓B细胞时，检测了小鼠中活细胞、总B细胞、A亚群、前前B细胞、B亚群、C亚群、C'亚群、D亚群、未成熟E亚群、过渡期E亚群以及F亚群B细胞的比例。脾脏B细胞分析显示了小鼠脾脏中活脾细胞、总B细胞、过渡期B细胞、T1、T2、T3细胞、成熟B细胞、滤泡I型细胞、滤泡II型细胞、边缘区前体及成熟细胞和B-1细胞的比例。通过脾脏的流式细胞术分析，确定了小鼠免疫球蛋白κ和免疫球蛋白λB细胞的比例。在执行该方案时，需要使用补偿对照来消除一个检测器信号溢出到下一个检测器的问题。这些对照可以是单独染色的细胞，也可以是市售的补偿微球。此外，可将其他检测方法与流式细胞术联合使用，例如免疫组织化学用于可视化淋巴器官内的细胞定位，以及双光子显微镜用于在真实空间和时间内分析B细胞反应。通过流式细胞术分析B细胞区室，可对与BCR及相关缺陷、BCR信号分子异常或调控B细胞存活的细胞因子紊乱相关的表型进行表征。

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科研

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Immunology and Infection

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