Name: 鼠标心脏中毛细血管、动脉和腹膜的动态测量和成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学习小鼠心脏冠状动脉微循环的动态测量方法，通过离体监测灌注压和血流，评估毛细血管、周细胞功能及血管直径变化。该技术为心血管生理学研究提供重要实验平台。

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本工作部分得到了生物医学工程与技术中心（BioMET）、美国国立卫生研究院（NIH）（1U01HL116321 和 1R01HL142290）以及美国心脏协会 10SDG4030042（GZ）、19POST34450156（HCJ）的资助。

所有动物护理均遵循马里兰大学巴尔的摩分校及机构动物护理与使用委员会批准的指南和方案。
1. 溶液的配制
注意：请提前配制溶液。实验中使用两种基础溶液：（1）用于浴槽灌流的生理盐水溶液（PSS）和（2）用于管腔灌流的台氏液。PSS 需持续用 CO2 鼓泡以维持其 pH 值。管腔内使用 HEPES 缓冲的台氏液代替 PSS，以避免气泡进入血管，因为气泡会损伤内皮细胞7 并阻塞血流。
<ol>
	<li>PSS 溶液：PSS 溶液的配方和成分见表 1。配制 10 L 无 Ca2+、无葡萄糖的 PSS 储存液，并于室温保存。在任何实验操作前 1 小时，取出 1 L 储存液，用 5% CO2（74% N2 和 21% O2）气体饱和，使溶液 pH 维持在约 7.4。加入 1.8 g 葡萄糖和 1.8 mL CaCl2（1 M 储存液）8。 
	注意：只有在气体饱和后、pH 达到约 7.4 时才可加入 Ca2+，否则 Ca2+ 将发生沉淀。</li>
	<li>Tyrode’s 溶液：Tyrode’s 溶液的配方和成分见表 1。将溶液经 0.22 μm 滤膜过滤后，于 4 °C 保存以备后续使用9。</li>
	<li>含 BDM（2,3-丁二酮单肟）的 Tyrode’s 溶液：加入 BDM 作为可逆性肌丝抑制剂，以防止心肌细胞收缩10。称取 600 mg BDM，加入 200 mL Tyrode’s 溶液中。持续搅拌至 BDM 完全溶解。无需进一步过滤。</li>
	<li>将含 BDM 的 Tyrode’s 溶液于 4 °C 保存以备后续使用。</li>
</ol>
2. 样品室准备
<ol>
	<li>按照制造商提供的说明，提前用聚二甲基硅氧烷（PDMS）包被解剖室和实验腔室。</li>
	<li>用含有BDM的台氏液填充解剖腔室。</li>
	<li>在操作前1小时打开制冷机，将温度设置为4 °C。</li>
</ol>
3. 套管制备
<ol>
	<li>打开微电极拉制仪，按照制造商的说明选择相应的设置。</li>
	<li>取一根洁净的硼硅酸盐玻璃管（所用玻璃管的外径和内径分别为 1.2 mm 和 0.69 mm）。</li>
	<li>将玻璃管插入配有U形铂丝加热丝的Sutter微电极拉制仪的槽式夹具中。</li>
	<li>启动拉制仪，制备出两根导管，每根均带有细长的尖端。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用精细剪刀剪切每根导管的尖端，使其最终直径约为 100 至 150 µm。</li>
	<li>对剪切后的导管尖端进行火焰抛光，以略微圆滑其锋利边缘。</li>
	<li>使用一根铂丝（通过精细控温加热），将其置于导管轴部侧面距尖端约 2 mm 处，沿轴向弯曲导管，弯曲角度应约为 45°。</li>
	<li>将导管的开口端插入压力肌动图腔室的固定座中并拧紧。将一个装有台氏液的 5 mL 注射器连接到固定座的另一端。将导管连接至安装在腔室上的显微操作器（见图1和图2）。</li>
	<li>使用注射器（5 mL）向导管内注入台氏液，冲洗导管、管路及连接器中的气泡。</li>
	<li>在进行导管插管操作前，应在一定流速范围（50 至 300 µL/min，图3）内测量导管内的灌注压力。仅在使用新导管时进行此步骤。 
	注意：导管内的灌注压力与流速成正比，并呈线性拟合（图3）。</li>
</ol>
4. 小鼠心脏的提取
<ol>
	<li>将一只C57BL/6小鼠（性别不限，8-16周龄）放入与异氟烷和氧气气罐相连的麻醉箱中。</li>
	<li>打开氧气罐，开始通入异氟烷。等待约5分钟，直至小鼠完全麻醉。</li>
	<li>确认麻醉后，将小鼠从麻醉箱中取出，经腹腔注射肝素（360单位，每只0.5 mL），以防止血管内血栓形成。然后将小鼠放回麻醉箱中。</li>
	<li>肝素注射10分钟后，将小鼠转移至加热板上，呈仰卧位，并用标签胶带固定其四肢。通过鼻罩持续给予异氟烷以维持深度麻醉状态。</li>
	<li>用镊子提起小鼠膈肌上方的腹部皮肤，使用手术剪剪开并暴露膈肌。</li>
	<li>剪开膈肌和胸骨，打开胸腔。</li>
	<li>从胸腔中分离心脏，尽可能贴近背侧胸壁进行剪切。</li>
	<li>将心脏置于含30 mM BDM的冰冻台氏液中。</li>
	<li>清理心脏，去除肺等结缔组织。</li>
	<li>将心脏转移至预先冷却的解剖室中，解剖室内盛有含30 mM BDM的台氏液。</li>
</ol>
5. 室间隔动脉的制备与插管
<ol>
	<li>启动伺服泵，将伺服泵设置为“流速”模式。高速运行，直至管路充满用于灌注血管腔的Tyrode's溶液。确保管路中无气泡，然后降低转速。</li>
	<li>将心脏固定在PDMS上，注意避免损伤心脏中部区域。</li>
	<li>去除左右心房。剪开右心室，并在解剖显微镜下移除右心室游离壁。</li>
	<li>暴露并识别室间隔动脉。将一根尼龙线（直径30 µm）置于室间隔动脉下方，并打一个松结以备后续使用。 
	注意：室间隔动脉可通过解剖显微镜轻松识别。在大多数情况下，室间隔动脉是起源于右冠状动脉、位于室间隔上的主要动脉。</li>
	<li>使用精细剪刀移除左心室游离壁。</li>
	<li>将乳头肌制备物转移至已放置套管的实验腔室中。腔室内充满含有BDM的Tyrode’s溶液。腔室底部涂有一层薄的（约2 mm）PDMS。</li>
	<li>通过显微操作器调整套管位置，以便对室间隔动脉进行插管。拉紧结扎线。</li>
	<li>使用小固定针将乳头肌固定在腔室底部，确保显微镜物镜能够清晰观察到血管结构。注意套管的角度和位置，确保套管尖端与动脉壁平行。</li>
	<li>通过缓慢推动注射器中的液体经套管流出，以检测插管效果。若各部件功能正常，此过程初期可见乳头肌组织中残留的血液排出，随后仅见Tyrode's溶液流出。</li>
</ol>
6. 标本的稳定化处理
<ol>
	<li>打开将提供灌流液的蠕动泵，以3-4 mL/min的流速持续向浴槽中的标本灌注预先充氧的PSS溶液。</li>
	<li>开启灌流液的温度控制器，调节浴槽中灌流液的温度至约35–37 °C。</li>
	<li>将导管连接至伺服泵，读取压力伺服控制器上显示的压力值。</li>
	<li>监测流速与压力。使用数据采集器对流速（µL/min）和动脉灌注压（mm Hg）进行数字化处理，并通过配套软件记录（图2）。</li>
	<li>调节流速使压力维持在约10 mmHg，持续运行约10分钟。</li>
	<li>增加管腔溶液的流速，使动脉压力达到约60 mmHg。通过减去导管的压力降，获得微动脉本身的最终灌注压（图3）。 
	注意：若压力伺服控制器选择“压力”模式，则在这些实验中将管腔压力设定为约60 mmHg，随后监测流速的变化。</li>
	<li>通过监测流速和/或压力水平，使样本稳定约30–60分钟。插管后开始灌注时，通常会观察到动脉压力逐渐升高，约30分钟后可自行建立新的稳态（图4）。</li>
	<li>在灌注压力稳定（恒定流速下）后开始实验。</li>
</ol>
7. 使用荧光标记的麦胚凝集素（WGA）孵育样本
<ol>
	<li>通过将 100 μg 荧光素 Alexa-Fluor-488 标记的 WGA 加入 5 mL Tyrode 溶液中，配制含 Alexa-Fluor-488 标记 WGA 的 Tyrode 溶液。</li>
	<li>小心地将灌注液从正常的 Tyrode 溶液更换为含荧光标记 WGA 的溶液。更换灌注液时需格外小心，避免引入气泡。</li>
	<li>在 WGA 灌注约 30 分钟后，或当 WGA 溶液即将耗尽时，将灌注液重新换回正常的 Tyrode 溶液。</li>
</ol>
8. 小动脉和毛细血管的共聚焦成像
<ol>
	<li>开启转盘共聚焦显微镜系统。</li>
	<li>使用低倍物镜（4x）在透射光模式下定位室间隔动脉。 
	注意：可通过导管的位置来确定室间隔动脉的位置。</li>
	<li>启动转盘共聚焦成像，选择488 nm激发激光、40x物镜放大倍数，并调节激光强度和采样速率（每幅图像10 - 500 ms）。</li>
	<li>为共聚焦显微镜设置顶部和底部成像位置，以定义成像范围，并输入z轴层扫成像的参数。</li>
	<li>根据所用系统的推荐设置步进大小，或按需自定义步进大小。</li>
	<li>选择z轴层扫设置和/或时间序列设置。</li>
	<li>选择或新建一个文件夹以存储新图像。</li>
	<li>点击“运行”开始记录成像数据，用于后续分析（图5）。</li>
</ol>
9. 血管舒张剂实验示例：吡那地尔诱导的血管舒张（视频 1）。
<ol>
	<li>制备吡那地尔储备液（100 mM，溶于DMSO），并在4 °C下保存。</li>
	<li>制备10 mL台氏液。加入10 µL吡那地尔储备液，使吡那地尔终浓度为100 µM。</li>
	<li>使用低倍镜（4倍物镜）对乳头肌进行成像，确保包含室间隔动脉及其分支小动脉。</li>
	<li>将管腔灌注液更换为含吡那地尔的溶液。</li>
</ol>
10. 血流控制实验示例：在恒定血流条件下由血管收缩剂引起的动脉灌注压升高（图6）
<ol>
	<li>配制内皮素-1（ET-1）储备液（10 µM），并于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制 10 mL 台氏液。加入 10 µL ET-1 储备液（10 µM），使 ET-1 的终浓度为 10 nM。</li>
	<li>在恒定流速下记录管腔压力，并对乳头肌进行成像。</li>
	<li>将管腔灌注液更换为含 ET-1 的溶液。</li>
</ol>
11. 周细胞毛细血管的示例图像（图7）
<ol>
	<li>按照本方案第4节所述，处死一只NG2DsRedBAC转基因小鼠。</li>
	<li>取出心脏，插管隔动脉，并按照方案5-7使用Alexa-Fluor-488标记的WGA对样品进行负载。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜在488 nm和560 nm激发光下对乳头肌成像，发射光波长分别为510-525 nm和575-625 nm。小动脉压力约为40 mmHg。</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
<li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li>
<li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li>
<li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li>
<li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li>
<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
<li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents%2C+Ca2%2B+signals%2C+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li>
<li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+enhances+SR+Ca2%2B+content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li>
<li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li>
<li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

在本研究中，我们介绍了一种极为简单且高度实用的离体方法，用于在生理条件下研究心脏的冠状微循环。该方法是在利用大鼠进行机械研究的基础上改进而来的2。其中关键的改进在于引入了高速、高光学分辨率的成像技术。因此，我们得以利用目前市面上先进的光学成像系统。通过精细的解剖操作，并将具有功能活性的乳头肌标本置于适宜的位置，我们能够清晰地观察到小动脉、毛细血管前小动脉、毛细血管、小静脉以及周细胞，同时可在控制血流或血压其中一个参数的情况下，测量另一个参数。小动脉和毛细血管直径的变化通过高速转盘共聚焦显微镜进行实时监测。光学成像与生理盐水溶液内部灌注相结合，使该实验模型在评估生物医学治疗效果，以及研究心脏血流生理性和病理性调控机制方面具有重要应用价值1。
多年来，心脏乳头肌已被广泛用于心脏生理学的研究。然而，当研究涉及&#34;做功&#34;、&#34;代谢&#34;或&#34;电活动&#34;等生理特征时，缺乏灌注会显著影响其生理状态。显然，无灌注的乳头肌明显不符合生理条件。尽管如此，几十年前，Wes...

适当的冠状动脉压力-血流调节可确保为心脏提供充足的血液供应，以满足其代谢需求1。然而，尽管过去几十年已开展了大量体内和体外研究，冠状动脉压力-血流在心脏中如何实现动态调节，直到最近才逐渐明确。其中一个原因是，由于心脏持续跳动，难以建立适用于此类研究的生理学工作模型。尽管如此，目前已建立多种方法用于在活体组织或动物中观察冠状动脉微血管，但这些方法均无法同时实现稳定的聚焦，并对压力、血流和微血管直径进行同步测量2,3。在跳动的心脏中直接可视化冠状动脉微血管的技术早在数十年前即已提出4,3，但在小血管中进行直径测量仍具挑战性，同时难以解析与微循环相关的多种特化细胞类型的特定功能。即使采用频闪法或浮动物镜系统，也无法同时获取上述信息5。尽管如此，利用前述技术已获得大量有价值的信息，增进了我们对冠状动脉血流调节机制的理解6。本文所描述的方法将有助于深入研究并阐明冠状动脉各组成部分——包括小动脉和微血管系统——在不同刺激和代谢需求下所表现出的差异化反应。
我们为开展这些研究建立的工作模型基于Westerhof等人的前期工作2。在对小鼠心脏的室间隔动脉插管后，使用生理盐水溶液灌注该动脉，以维持心肌细胞及心脏组织其他成分的营养供应。通过合适的荧光指示剂，监测动脉灌注压、血流和血管直径等多种生理功能。该方法使我们首次能够在生理压力条件下，在活体组织中观察冠状微血管床，并研究微循环调节背后的细胞机制。

<table><tbody><tr><td>1 M CaCl₂ 溶液</td><td>MilliporeSigma，美国</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl₂ 溶液</td><td>MilliporeSigma，美国</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 软件</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州圣何塞</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷水/水浴培养箱</td><td>FisherScientific，美国</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>尼康仪器公司，美国</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>定制玻璃管</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州圣何塞</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>日本 Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>内皮素-1</td><td>MilliporeSigma，美国</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich，美国</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>在线溶液加热器</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, 美国</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VETone，美国爱达荷州</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器/套管固定器</td><td>Warner Instruments，美国康涅狄格州哈姆登</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>NG2DsRedBAC 转基因小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>用于结扎血管的尼龙线</td><td>美国佛蒙特州伯灵顿市 Living Systems Instrumentation 公司</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS（聚二甲基硅氧烷）</td><td>SYLGARD，美国威斯康星州日耳曼敦</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson，Middleton，WI，美国</td><td>minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>压力伺服控制器</td><td>美国佛蒙特州伯灵顿，Living Systems Instrumentation公司</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Scientific Tools，美国加利福尼亚州福斯特市</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>伺服泵</td><td>美国佛蒙特州伯灵顿，Living Systems Instrumentation公司</td><td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instruments，美国康涅狄格州哈姆登</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>麦芽凝集素，Alexa Fluor 488 标记物</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠心脏毛细血管、小动脉及周细胞的动态测量与成像

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

冠状动脉张力以及毛细血管的开放或关闭在恒定灌注压力下很大程度上决定了心肌细胞的血流量。然而，由于心脏持续运动和不停搏动，监测整个心脏冠状小动脉和毛细血管的动态变化十分困难。本文介绍一种可用于监测小鼠右心室乳头肌中小动脉灌注速率、压力以及小动脉和毛细血管管径变化的方法。通过插管并以恒定流量或恒定压力灌注小鼠室间隔动脉（另一参数则动态测定），在使用荧光标记的凝集素（例如Alexa Fluor-488或Alexa Fluor-633标记的小麦胚芽凝集素WGA）灌注后，可清晰成像右心室乳头肌和室间隔中的小动脉、毛细血管及其他血管。随后可在有或无心脏收缩的情况下测量血管管径的变化。当表达基因编码的荧光蛋白时，可特异性观察特定结构。例如，在表达NG2-DsRed的小鼠心脏中可实现周细胞的可视化。该方法为研究心脏毛细血管周细胞的生理功能提供了有效的平台，也适用于通过同时测定血管/毛细血管管径和动脉管腔压力来研究试剂对心脏血流的影响。结合先进的光学成像系统，该制备方法可在接近生理条件下，从细胞和分子水平研究心脏血流及其调控机制。

当荧光血管标记物灌注到血管腔内（此处为与Alexa Fluor-488偶联的WGA）时，可利用高速共聚焦显微镜观察完整的血管树结构，如图5（左图）所示。进一步放大可实现对毛细血管的精细成像（图5，右图）。由于加压系统支持对管腔压力进行持续监测，因此该制备方法可用于关联动脉直径变化与动脉压力之间的关系。视频1显示，当从管腔内给予ATP敏感性K+通道（KATP）激动剂吡那地尔时，小动脉的直径增大。图6显示，当从管腔内施加血管收缩剂ET-1时，小动脉直径减小，且在流量保持恒定的情况下，管腔压力升高。
由于共聚焦显微镜具有高分辨率，并可结合特异性细胞标记物，该方法还可用于可视化与微循环相关的多种其他细胞类型。在此，我们使用了一种转基因小鼠（NG2DsRedBAC 转基因小鼠），其在周细胞特异性启动子（NG2）驱动下表达 DsRed 荧光...

本文介绍了一种通过离体监测维持压力的动脉灌注压和血流，以及血管树组分（包括毛细血管床和周细胞），在活体小鼠心脏组织中研究冠状微循环的实验方案，其中间隔动脉被插管并加压。

冠状动脉张力以及毛细血管的开放或关闭在恒定灌注条件下主要决定了心肌细胞的血流量。

该方法可用于通过离体监测动脉灌注压和血流，研究活体小鼠心脏组织及血管树组分中的冠状动脉微循环。该方法为研究心脏内周细胞功能及微循环相关试剂提供了有用的平台，通过测量血管直径和小动脉管腔压力来实现。为实验准备插管时，使用微量移液器拉制仪将一根洁净的硼硅酸盐玻璃管拉制成两根具有细长尖端的插管。使用精细的剪刀和解剖显微镜将每根导管的尖端剪至最终直径为100至150微米，并对尖端进行火焰抛光，使锋利的边缘略微圆滑。将铂丝置于导管杆部侧面，距离尖端约2毫米处，以此将导管沿杆部弯曲成约45度角，然后将导管的开口端插入导管固定器中。接着拧紧接头，并用5毫升注射器以Tyrode's溶液冲洗导管及管路。将套管固定器安装到压力肌动图腔室的显微操作装置上。为获取实验用小鼠心脏，首先向一只8至16周龄的C57BL/6小鼠腹腔内注射500微升肝素。10分钟后，将小鼠仰卧置于加热垫上，并用标签胶带固定其四肢。使用镊子和手术剪在膈肌上方的腹部皮肤做一切口，剪开膈肌和胸骨，以便从胸腔中解剖出心脏。将心脏置于含有30毫摩尔BDM的冰冻台氏液中，并根据需要去除心脏上的任何结缔组织。然后将心脏放入预冷的解剖腔中，腔内盛满添加了30毫摩尔BDM的新鲜台氏液。为准备进行隔支动脉插管，打开伺服泵并将伺服控制器的压力模式设为流速模式。将心脏置于PDMS上，注意避免损伤组织的中部区域，并将组织置于解剖显微镜下。去除一个或两个心房，并切开右心室。去除右心室游离壁，暴露室间隔动脉。使用直径为30微米的尼龙线在室间隔动脉周围打一个松结。用精细剪刀去除左心室游离壁，并将乳头肌制备物转移至实验腔室。使用显微操作器将套管插入室间隔动脉，并用缝线固定套管。然后用针将乳头肌固定在灌流室底部，使套管尖端与动脉壁平行，以获得清晰的血管视野，并使用注射器通过套管缓慢灌注溶液。为稳定组织制备物，开启蠕动泵，以每分钟3至4毫升的流速持续用预充氧的生理盐水溶液对制备物进行灌流；开启灌流液温度控制器，将浴槽中灌流液的温度调节至35至37摄氏度。将套管连接至伺服泵，并调节流速使压力约为10毫米汞柱。让灌流持续约10分钟，随后增加管腔溶液的流速，使动脉压力升至约60毫米汞柱，并在监测条件下让样本稳定30至60分钟。为用麦芽凝集素对样本进行负载，用5毫升Tyrode溶液灌流组织样本，该溶液中添加了100微克Alexa Fluor-488标记的麦芽凝集素（Alexa Fluor-488 Conjugated Wheat-Germ Agglutinin）。30分钟后，将灌流液换回正常的台氏液，并打开共聚焦显微镜系统。使用较低倍率的物镜，在透射光模式下定位室间隔动脉，并开始使用该转盘共聚焦显微镜进行成像。选择40倍物镜放大倍数和488纳米激发激光，调节激光强度和采样速率。为了确定成像范围，需设置显微镜的顶部和底部成像位置，并设定步长及Z轴层扫成像参数。然后选择一个用于存储图像的文件夹，点击运行以开始记录图像。当荧光血管标记物被灌注至血管腔内时，即可利用高速共聚焦显微镜对完整的血管树进行可视化观察。进一步放大可实现对毛细血管的详细成像。当从管腔内给予钾通道激动剂吡那地尔时，小动脉的直径增大。当从管腔内施加血管收缩剂内皮素-1时。动脉的直径减小。当流速设定恒定时，管腔内压力增加。在这些来自表达NG2 DS红色荧光蛋白的转基因小鼠的乳头肌组织图像中，在更接近活体动物生理条件的情况下，可以清晰观察到乳头肌组织内的毛细血管和周细胞。在整个操作过程中，管道内不得存在任何气泡。将该方法与光学成像技术相结合，可利用荧光示踪转基因小鼠研究心脏微循环以及不同类型细胞之间的细胞间通讯。

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