单细胞级别研究形状依赖性转录组学的方法
November 2nd, 2020
本文介绍了不同形状、代表不同病理的心脏细胞生长方法，并基于单个细胞的形态对这些粘附性心肌细胞进行排序。拟议的平台为不同类型的心力衰竭提供了一种高通量和药物筛查的新方法。
我们提出了一个新的平台，用于研究细胞形状对基因表达的影响，使用方法在单个细胞水平上生长和排序不同形态的依从性。该技术的主要优点是，它有利于在体外对细胞形状的高通量研究，因为比较体内不同形状的细胞在技术上要求很高。要建立有图案的心肌细胞培养，将息高比下的心向位的心向位肌细胞悬浮液转移到15毫升管中，以计数，将细胞稀释至适当电镀介质浓度的每毫升10至5个细胞的1倍至5个细胞。
将两毫升细胞加入纤维素涂层微层芯片，浸入两毫升热电镀介质中，在35毫升的Grenier Petri盘中，将该培养皿放在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中18小时。第二天，通过光显微镜检查芯片，确认大部分细胞已经连接。从培养皿中去除培养皿中的介质以清除任何碎屑和或死细胞，然后从中心开始，以滴滴的方式向两侧移动，轻轻地向细胞中添加 PBS。
第三次洗涤后，用四毫升维持介质更换PBS，将细胞返回细胞培养箱。72 小时后，使用两毫升加热 Dulbecco 的 PBS 轻轻冲洗芯片表面，如演示，并使用钳子立即将洗涤的碎屑转移到新的无菌 35 毫升 Grenier Petri 盘中。快速添加 1.5 微升的充满活力的二环绿色稀释 1000 折的 DPBS 芯片。
在芯片上固定一个室，将盘子放在细胞拾取器阶段的菜架上。插入磁帽，并在实时视图窗口中定位十字线。聚焦十字线，在扫描和分拣窗口中，选择自动喷射和校准的校准。
在 DPBS 溶液中，用 1.5 毫升的一对一三 E 将盘子上足液更换，以松开纤维素中的细胞并打开扫描卡舌。要扫描整个芯片，请聚焦视野中芯片左上角，然后单击获取当前显微镜位置。接下来，聚焦芯片右下角，然后单击获取当前显微镜位置。
在弹出窗口中，单击"设置最锐利的平面"，然后单击"转到右上角"，然后转到左下角按钮。然后，单击"完成"开始扫描。扫描完成后，打开分析选项卡并单击"显示映射"以选择通过研究标准的单个单元格。
将玻璃微胶囊放在显微镜中间的实时视图中，然后打开泵卡舌。要产生真空，请从 50 毫升 1 号注射器中收回柱塞，然后打开分拣卡舌。为了允许拾取单个单元，请将阀 2 设置为打开 120 毫秒，在 200 毫秒的延时后将阀 1 打开 20 毫秒。
为使拾取的电池成功送至包含开液缓冲液的PCR管，请将阀一打开20毫秒，将阀门二在10毫秒的延时后打开10毫秒。调整阀门设置后，单击计算路径。该软件将计算从细胞到细胞的最快路径，以在整个芯片中拾取和注射选定的细胞。
然后，将显微镜聚焦在芯片表面的图案上。使用操纵手柄小心地向下移动微盖拉，以便无需接触芯片表面并单击设置即可获得微盖拉片尖端最清晰的图像。将打开一个新窗口，显示微胶囊横截面。
要让软件在 X、Y 和 Z 坐标中记录毛细管的尖端偏移，请单击毛细管的确切中心。然后，单击"开始排序"以启动排序。在从采摘的单细胞对预扩增cDNA进行这种代表性分析中，观察到凝胶中的一个透明带，如密度测定图，与电图中1，852个碱基对的峰值相对应。
片段的平均大小为 1，588 个基对，其碎片数量很少，短于 300 个基对，表示生成了良好的 cDNA 库。免疫荧光染色和分析也可以进行评估模式性心肌细胞内的沙康体结构。该平台为高通量研究和对不同类型的心力衰竭进行药物筛查铺平了道路。
概览
本研究介绍了一种基于单细胞水平的形态学来培养和分类心肌细胞的新平台。该方法能够高效筛选多种类型心力衰竭的药物。
关键研究组成部分
科学领域
- 心肌细胞培养
- 细胞形态分析
- 药物筛选方法
背景
- 心肌细胞展现出与不同病理相关的多样形态。
- 在体内研究细胞形状对基因表达的影响具有挑战性。
- 高通量技术对于有效的药物筛选至关重要。
- 现有方法在根据形态对单个细胞进行分类和分析方面缺乏效率。
研究目的
- 开发一个研究细胞形状对基因表达影响的平台。
- 促进基于形态对心肌细胞的分类。
- 增强心力衰竭治疗药物筛选过程。
使用的方法
- 心肌细胞悬浮液的制备和稀释。
- 使用纤连蛋白涂层的微型图案芯片进行细胞培养。
- 使用光学显微镜确认细胞附着。
- 使用微毛细管系统自动扫描和分类单个细胞。
主要结果
- 成功附着和维持图案化心肌细胞。
- 从分类的单个细胞中生成良好的cDNA文库。
- 免疫荧光染色显示了肌小节结构。
- 该平台支持高通量研究和药物筛选。
结论
- 开发的平台为研究心肌细胞提供了一种新的方法。
- 它能够有效地根据形态对细胞进行分类和分析。
- 这种方法可以显著推进心力衰竭治疗研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
