Name: 通过 EFA 去卷和散射分析 SEC-SAXS 数据 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习使用EFA去卷积方法分析SEC-SAXS数据，通过Scatter和BioXTAS RAW软件处理生物大分子散射数据，获得准确的结构信息和理想化散射曲线。

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我们感谢法国REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014项目基金、法国军队卫生局（Service de Santé des Armées）以及法国总装备局（Délégation Générale pour l'Armement）研究基金对本项目的资助。我们感谢欧洲同步辐射装置（ESRF）提供SAXS光束时间。本工作使用了格勒诺布尔Instruct-ERIC中心（ISBG；UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL）的平台，该中心隶属于格勒诺布尔结构生物学合作伙伴关系（PSB），并得到FRISBI（ANR-10-INBS-05-02）和GRAL项目的支持，GRAL项目由格勒诺布尔阿尔卑斯大学研究生院（Ecoles Universitaires de Recherche）CBH-EUR-GS（ANR-17-EURE-0003）资助。结构生物学研究所（IBS）感谢其被纳入格勒诺布尔跨学科研究学院（IRIG，CEA）。我们感谢Wim P. Burmeister和Frédéric Iseni提供的经费与科学支持，同时感谢来自APS BioCAT的Jesse Hopkins博士在开发BioXTAS RAW过程中所提供的帮助与支持。

1. 蛋白质表达、纯化及SEC-SAXS测量基于已发表的方案13
<ol>
	<li>遵循内联SEC-SAXS数据采集方案（Brennich等）6简要来说。
	<ol>
		<li>用至少2个柱体积的凝胶过滤层析运行缓冲液（20&#8201;毫摩尔 Tris-HCl，pH 7.5，100&#8201;mM NaCl</li>
		<li>制备50 µL的E9外泌体样品负 以20%摩尔过量的部分双链DNA（TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC和GGCTAAACCGCTGTTATCTT）将浓度调至8‒10 mg/mL。E9 exo负 与 K 结合D 12 ± 6 nM（见 补充数据).</li>
		<li>将50 μL该混合物以0.3 mL/min的流速注入与SAXS测量流通池串联的SEC柱（S200 Increase）中。</li>
		<li>采集1000帧，频率为1&#8201;每次暴露时间相同。 
		注意：在欧洲同步辐射装置（ESRF）的BioSAXS光束线BM29上，各个帧数据在EDNA框架内被自动且独立地处理。14数据收集完成后，打开 ISPyB 数据库20 以及在……之下 数据采集 压片机按压 开始 按钮以访问数据集和自动分析结果21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下载数据。</li>
</ol>
2. 原始数据分析
<ol>
	<li>打开基于 Java 的程序 Scatter IV（参见材料表），并对尺寸排阻色谱（SEC）数据执行背景扣除。
	<ol>
		<li>打开SEC选项卡。将已减除背景的数据文件（*.dat）拖放到“Drop Data below”窗口中。通过点击蓝色标签的Output Dir按钮，设置输出目录“Out Dir ::”。 
		注意：如果您的数据是以 nm-1 为单位采集的，则在将文件拖入窗口或进入减法选项卡时，需勾选左下角的转换框。</li>
		<li>编辑实验细节，点击Edit Details按钮，并尽可能填写所有字段，包括用于数据采集的光源/光束线、采集参数和样品信息等部分。这些信息将随数据一同保存，便于今后在发表文章时更轻松地填写“数据采集参数”部分。</li>
		<li>在Save as框中输入样品名称，然后点击TRACE。 
		注意：此操作具有两个效果。首先，它将为数据生成一个*.sec文件。这是一个单一文本文件，用于汇总来自各个*.dat文件的所有实验观测结果。此外，*.sec文件还包含用于缓冲液背景的平均帧集合、参与平均的所有原始帧，以及在整个SEC-SAXS实验中经缓冲液背景扣除后的各帧数据。其次，系统会生成一个信号图，显示帧编号与相对于背景的积分比值。图中以灰色标示出用于缓冲液减法平均的选定帧。平均缓冲液的点位由整个数据范围确定。然而，建议手动选择用于平均的缓冲液帧，因为若色谱柱未充分平衡、污染或毛细管堵塞，可能导致背景定义不准确22。</li>
		<li>手动选择缓冲液帧。点击Clear Buffers，然后在轨迹曲线上使用鼠标左键拖拽重新选择一段缓冲区域。理想情况下，应选择SEC柱空体积之前约100帧的平稳区域。点击SET BUFFER，然后点击Update以重新计算*.sec文件，此过程可能需要几分钟。</li>
		<li>确定感兴趣区域（ROI）。在信号图上，使用鼠标左键拖拽选择目标峰所在的区域。 
		注意：这将在右侧面板中填充三个图表。上方两个图表通过十字准线联动：右上角的第二个信号图仅显示所选的ROI区域，其中每帧的强度以蓝色表示，对应每帧的Rg值以红色表示；其下方为相应的热图，根据Durbin-Watson自相关分析对每帧的残差进行着色。高度相似的区域显示为青色（Durbin-Watson，d = 2），而差异较大的帧则呈现从深蓝到粉红，最终至红色，颜色变化程度反映差异的严重性（d &#62; 2）。底部图表显示的是中心选定帧（也由一条垂直线标示）的扣除后I对q曲线。可使用方向键浏览其他扣除后的帧。I对q图可反映SEC实验中扣除后各帧的质量。</li>
		<li>选择要合并的帧。点击热图中的十字准线，以选择用于合并的帧子集。十字准线将标识出一个主要呈青色的三角区域，位于十字准线下方右侧。使用鼠标点击将这些帧设为选中状态，并在上方信号图的相应区域高亮显示。这些帧应理想地覆盖一个Rg值稳定的区域。 
		注意：如有需要，可通过鼠标左键拖拽放大热图，或向右滑动以缩小视图。</li>
		<li>当对所选帧满意后，点击MERGE。系统将合并所选的扣除后帧，并将其呈现在ANALYSIS选项卡中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据解卷积
<ol>
	<li>打开去卷积程序（例如 BioXTAS Raw 2.0.0）。</li>
	<li>在去卷积程序中，加载数据集：在控制面板的文件选项卡下，使用文件夹符号定位数据，或复制粘贴路径至地址栏。 
	注意：确保该文件夹仅包含原始 *.dat 文件，不含任何已处理或平均后的数据文件。</li>
	<li>选中所有 *.dat 文件，点击绘制序列按钮，“序列图”中将绘制出积分强度随帧数变化的曲线。</li>
	<li>在控制面板中选择序列选项卡，然后点击以高亮曲线。通过控制面板底部的按钮打开LC 分析弹出窗口。该窗口提供多个选项，例如选择不同类型的分子（蛋白质或 RNA），并允许用户为图表选择缓冲区域。首次使用时点击自动；系统应自动选择合适的缓冲区域。 
	注意：若自动选择失败（可能由于基线不稳定），则使用“添加区域”功能优化缓冲区域。此时缓冲框中会出现一个较小的子框，可在其中手动输入用于缓冲的帧编号。或者，点击“选取”以在图上选择区域：定位起始位置并左键单击一次，移动光标至下一位置后再次左键单击。可能需要添加多个缓冲区域。点击设置缓冲，系统将对曲线进行减法处理，并在整个 SEC 峰范围内计算 Rg 值。若弹出对话框，点击确定。</li>
	<li>要开始进行演化因子分析（Evolving Factor Analysis, EFA），在控制面板底部右键单击已高亮的文件，然后从菜单中选择EFA。
	<ol>
		<li>确认弹出窗口中显示了数据集的单值分解（SVD）结果。在控制框中勾选使用帧选项，以确保强度图覆盖整个待去卷积的峰区。“奇异值”图（右上角）显示高于基线的奇异值强度（代表不同的峰/组分）。 
		注意：高于基线的点数代表存在的散射组分数目，但关键在于奇异值相对于平坦区域/基线的相对大小。</li>
		<li>为辅助验证单值数量，使用下方的自相关图。该图显示左右单值向量的自相关情况。点击下一步。 
		注意：这些向量本质上代表溶液中散射或浓度分布特征，其绝对大小反映该向量的重要性。重要组分的自相关值接近 1（经验判断阈值通常为 &#62;0.6–0.7）。RAW 会自动计算此值并显示在左下角的“显著 SV 数”框中，但可根据需要进行调整。若存在多个单值（例如 4 个以上），可仅分析其中 2 或 3 个组分，并调整所用数据范围。组分数越少，EFA 分析越简单，但代价是使用数据量减少。&#160;在复杂情况下，若左右奇异向量（应相似）不匹配，应减少显著 SV 数量并降低所用帧数，直至左右奇异向量趋于一致。</li>
		<li>通过生成每个向量的前向和后向图来确认 EFA 是否正确计算。这些图显示各组分在选定 SEC-SAXS 数据溶液谱中的出现（前向图）和消失（后向图）时间点。RAW 会尝试识别这些范围；使用计数器旁的箭头调整，使每个圆圈位于从基线上升或下降至基线的拐点起始处。点击下一步。 
		注意：EFA 的最后阶段是将 SVD 向量重新转换为散射曲线。窗口左侧上方显示先前定义的范围，这些范围作为约束条件，用于确定如何将奇异向量旋转回散射曲线。右侧面板显示每个分离峰对应的散射曲线轮廓、各峰的浓度分布图（应反映洗脱谱形）以及加权平均误差卡方2图。卡方2图用于衡量去卷积数据集与原始数据集的拟合程度。理想情况下该图应平坦，但常可见尖峰。</li>
		<li>尝试通过调整组分范围控制来减少或消除尖峰：首先根据卡方2图大致确定对应尖峰的帧号，然后在范围控制中查找包含该帧的组分（可能不止一个），使用箭头上下移动相应范围。 
		注意：此操作应引起响应，即尖峰升高或降低。若该帧出现在多个组分中，则可能需要在各组分间进行少量试错调整。</li>
		<li>当达到最小卡方2值后，点击返回执行验证检查，前一窗口将重新出现，以便确认所做更改是否显著改变了原始 EFA 图。若图形仍合理，点击下一步。点击保存 EFA 数据以保存图表，然后点击完成关闭 EFA&#160;窗口。 
		注意：另一种验证方法是依次取消勾选每个组分范围旁的复选框。这些框为各组分提供正浓度约束，取消勾选可检验其是否显著影响数据集。若浓度图无变化，则数据有效。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>返回 RAW 窗口，在控制面板中点击轮廓选项卡查看曲线，并在控制面板的操作选项卡中进一步处理曲线，或通过右键单击文件并从弹出菜单中选择保存选中文件，将曲线另存为 *.dat 文件。保存文件后，使用 Scatter IV 进行后续分析。 
	注意：有关去卷积和 EFA 在 BioXTAS RAW 中的更多说明与操作指南，请访问 https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/</li>
</ol>
4. 确定SAXS性质
注意：有关SAXS测定的深入教程可在Bioisis.net找到。本文展示了使用Scatter软件进行SAXS分析的基本逐步操作，重点介绍其中最有用的按钮功能。
<ol>
	<li>在散点图的 ANALYSIS 选项卡中，点击每个样品文件右侧的 G 按钮，启动手动 Guinier 分析工具。打开的图表在上方框中显示 ln[I(q)] 对 q2 的关系，在下方框中显示相应的残差。添加或删除数据点，使残差图中不出现“微笑”或“皱眉”状特征。Guinier 拟合所选数据的 q × Rg 最大值不应超过 1.3。</li>
	<li>点击 Normalized Kratky 按钮；弹出的图表提供了对大分子结构&#160;状态的半定量评估，已根据质量和浓度进行了归一化。 
	注：十字线标示了 Guinier-Kratky 点（√3, 1.1）19。一个致密、球形的蛋白质会在 Guinier-Kratky 点处呈现单一峰值。本质上无序或呈圆柱形的生物大分子其最大值将高于十字线位置，且不会下降。若蛋白质同时包含折叠结构域和长的伸展无序区域，则其最大值会超过十字线，但在较高的 q × Rg 处也会表现出明显的下降趋势。</li>
	<li>点击 Vc 按钮（相关体积），将弹出两个图表：总散射强度以及总散射强度随 q 变化的积分面积。这些图表可用于快速评估散射曲线的质量。 
	注：总散射强度对 I(0) 敏感，若该值未正确测量，则图表将无法显示连续的曲线。理想情况下，积分面积图应呈现 S 形曲线，并在每个 SAXS 曲线中具有延伸的平台区。若样品中存在缓冲液不匹配/扣除不当、聚集或粒子间干扰，则在较高 q 值处会观察到陡峭的斜率。</li>
	<li>点击 Flexibility 按钮以启动柔性分析。这将打开一个包含四个面板和底部滑块的窗口。每个面板展示了一个存在于致密与伸展/柔性生物大分子之间的幂律关系图23。使用时，按住鼠标左键将底部滑块从右向左移动，缓慢向左滑动，直到其中一个图中出现平台区。 
	注：若平台出现在 Porod-Debye 图中，则表明样品本质上是致密的，这应与归一化 Kratky 图中在 Guinier-Kratky 点处出现单一峰值的结果一致。若 Kratky-Debye 图最先出现平台，则样品很可能是伸展或柔性的。若 SIBYLS 图最先达到平台，则样品很可能同时包含致密和柔性区域，即处于混合状态的粒子。Rambo 等人23对这种柔性关系与 Porod-Debye 定律的理论进行了详尽阐述。</li>
	<li>点击 Volume。应在上述柔性分析完成后立即进行体积测定。在完成柔性分析后点击该按钮，将弹出包含三个新图的窗口。在左下角，Porod-Debye 图会记住此前在柔性分析图中滑块的位置，显示平台区域。
	<ol>
		<li>为计算粒子体积，使用箭头按钮或直接在输入框中键入数值，调整起始点和终点，使图中的蓝线拟合平台区域。为获得无偏结果，右上角 Porod-Debye 指数幂律拟合的残差图中应无明显模式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 P(r) 选项卡。左侧面板显示实空间分布，右侧面板显示样品的散射曲线。目标是从倒易空间 SAXS 曲线构建样品的实空间表示。理想情况下，分布曲线应平滑，无波动，并轻触 x 轴。 
	注：由于缓冲液匹配不佳、聚集、辐射损伤、曝光时间不理想或粒子浓度过低，仪器测得的 q 范围可能并非完全可用。P(r) 确定步骤将从根本上决定 SAXS 数据集可用的 qmin 和 qmax 范围，后续建模或拟合应使用此范围的数据。
	<ol>
		<li>右键点击样品名称，然后选择 Find DMAX 以打开新窗口。dmax 的限制已预设，包括建议的 qmax（使用的最大数据点数）、dmax 的上下限以及 alpha 评分的上下限。可选择三种模型（L1-范数、Legendre 和 Moore），并可选择是否包含背景。首次使用时请保持这些设置不变。</li>
		<li>点击 Start 按钮。左侧面板将生成一个复合分布，下方标注了建议的 dmax 和 alpha 水平。若结果可接受，则关闭窗口并返回 P(r) 选项卡。倒易空间图将被裁剪以匹配建议的 qmax。</li>
		<li>选择模型 Moore，点击 Background，然后将 alpha 水平和 dmax 设置为弹窗中建议的数值。点击 refine 按钮。将弹出交叉验证图，显示被拒绝的数据点（以红色标记）。若仅有少数点被拒绝且分布良好，则模型可靠。 
		注：交叉验证图将突出显示与所确定 P(r) 分布不一致的数据区域。若被拒绝的区域主要位于低 q 区（即靠近 y 轴的区域），则可能表明 dmax 过短、存在聚集或高级寡聚体，反映了高分辨率与低分辨率信息之间的不一致。此时应通过手动试错法调整 dmax 和 qmin（增加起始值）。类似地，若被拒绝的区域主要位于高 q 区，则可能表明背景扣除存在问题，或信号太弱而无法由所确定的 P(r) 分布合理解释。此时应截断 qmax（减小终点值），直至不再有额外数据被拒绝。理想情况下，被拒绝的点应随机分布，且占可用数据的比例少于 5%。合理定义的 qmin、qmax 和“dmax”将产生一条平滑的分布曲线，且 dmax 处轻触 x 轴。但不应过度增加该值，以免完全去除 Guinier 区域。可通过勾选面板左侧表格上方的 q x l(q) 框来轻松找到这一点。此时散射曲线将被“总散射强度图”替代，在该曲线上，最大拐点前的所有点均属于 Guinier 区域。去除点后，再次尝试增加或减少“dmax”，然后重新优化。若问题持续存在，特别是验证曲线起始处有大量点被拒绝，则强烈表明数据不适合进行结构建模。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>要打印报告，请返回 Analysis 选项卡，左键点击以高亮样品，然后右键点击样品名称，在菜单中选择 Create report from single data set。将弹出一个文本框，允许添加注释。系统将生成一份 PDF 文档，包含所有生成的图表和数值。</li>
</ol>

<ol><li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22General+Physiology+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li>
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<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li>
<li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li>
<li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li>
<li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATSAS+2.8%3A+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在开始SAXS实验之前，理想情况是获得单一分散的样品，但在实际操作中，许多数据采集并不满足这一条件，因此必须将测量与在线色谱技术（大多数情况下为SEC）结合以改善样品质量。然而，即使在纯化与数据采集之间时间有限的情况下，样品的单分散性也无法得到保证。这种情况最常见于那些组分在尺寸或物理性质上过于接近而难以分离，或容易发生快速动态变化的实验。本文提供了一种结合单值分解与渐进因子分析的方案，用于消除DNA结合态E9 exominus对其游离形态散射信号的干扰，从而获得单一分散的散射谱图，随后我们利用SAXS分析软件包Scatter IV对结果进行了分析。
对SEC-SAXS数据进行SVD结合EFA分析是用于解卷积SAXS数据并提升分析效果的强有力方法，但这些方法也存在局限性。它们要求SEC-SAXS中缓冲液基线的噪声或漂移尽可能小。这可能需要在上样前进行额外的色谱柱平衡（最好使用超过3倍柱体积的缓冲液，具体取决于所用缓冲液）。然而，最关键的步骤是奇异值数量的选择以及所用数据范围的确定，因为这将极大影响解卷积的准确性。正因如此，所得结果不应孤立看待，而应进一步结合分析型超速离心（AUC）或多角度激光光散射（MALLS）等技术进行分析，以实现对生物学意义的准确解读。
Scatter IV 是一款全新的软件包，免费供科研和工业使用，具有直观的用户界面，即使非专业人员也能轻松分析其数据。Scatter IV 拥有多种新功能，有助于提升 SEC-SAXS 数据的分析效果，例如将热图与信号图谱关联，从而在帧选择时实现更高的准确性。在初级数据分析中，Guinier 峰值分析以及与 P(r) 分析相关的交叉验证图谱为该软件提供了集成的故障排查能力。
需要指出的是，还有许多其他程序可用于原始数据分析；这些程序包含相同的基本功能，并且也会定期更新，例如 BioXTAS RAW17、ATSAS 软件包24 和 US-SOMO15 等。
但无论使用哪种SAXS软件包进行分析，其主要限制都是相同的：即在数据采集和分析之前的样品制备。在所示的E9 exominus示例中，可以明显看出信噪比的提升，以及与单分散样品相关的Rg减小和dmax的降低。这将极大地有助于后续的数据处理，例如利用已知的高分辨率结构进行拟合或建模。

生物大分子过于微小，即使使用最好的光学显微镜也无法观察到。目前确定其结构的方法通常涉及将蛋白质结晶，或同时对大量相同的分子进行测量。虽然X射线晶体学能够提供原子水平的信息，但其样品环境是人为的，因为大多数生物大分子在细胞内并不以晶体形式存在。近年来，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已能解析大型生物大分子或大分子复合物的高分辨率结构；然而，尽管样品更接近生理状态，但仍处于冷冻状态，因此是静止且不具动态性的。生物小角X射线散射（BioSAXS）则可在与生物学相关的条件下对大分子进行结构测定。该状态可被可视化为在纳米尺度上确定的低分辨率三维形状，并能捕捉溶液中大分子的全部构象空间。BioSAXS实验可高效评估寡聚状态、结构域及复合物的排列方式，以及结构域之间的柔性1,2,3。该方法准确、基本无损，通常仅需最少的样品制备和时间。然而，为了对数据进行最佳解析，样品必须是单分散的。这具有挑战性：生物分子常易受污染、纯化效果不佳或发生聚集，例如因反复冻融所致4。采用在线色谱分离后立即进行SAXS测量的技术发展，有助于减轻这些影响。尺寸排阻色谱（SEC）按分子大小分离样品，从而排除大多数污染物和聚集体5,6,7,8,9,10。然而，在某些情况下，即使使用SEC-SAXS也难以获得单分散样品，因为混合物中的组分可能尺寸过于接近，或其物理性质或快速动力学导致在SEC紫外信号图谱中出现峰重叠。在此类情况下，可通过基于软件的数据去卷积步骤，从获得的SAXS数据中提取出各个组分的理想化SAXS曲线5,11,12。例如，在方案部分2中，我们展示了痘苗病毒E9 DNA聚合酶外切酶缺失突变体（E9 exominus）与DNA形成复合物的标准SEC-SAXS分析。痘苗病毒是痘病毒科（Poxviridae）的模式生物，该病毒科包含多种病原体，例如人类天花病毒。生化研究表明，该聚合酶能紧密结合DNA，其复合物结构最近已通过X射线晶体学解析13。
大多数同步辐射设施会提供自动化的数据处理流程，可进行数据归一化和积分，生成一组未减去本底的散射曲线。但本文所述方法也可用于实验室光源，前提是已进行了尺寸排阻色谱-小角X射线散射（SEC-SAXS）实验。此外，某些自动化程序还可自动剔除受辐射损伤的帧数据，并完成缓冲液减除14。我们将在第2节中展示如何对预处理后的数据进行初步数据分析，并最大限度地利用可用数据。
在第3部分中，我们展示了如何对SEC-SAXS数据进行去卷积，并高效地分析曲线。尽管存在多种去卷积方法，例如在US-SOMO软件中实现的高斯峰去卷积法15，以及在DELA软件中实现的基于优化Guinier图的最大似然法16，但这些方法通常需要对峰形建立模型12。由于我们所研究的各个峰具有有限的尺寸，因此可以采用演化因子分析法（EFA），即奇异值分解（SVD）的一种增强形式，用于去卷积重叠峰，而无需依赖峰形或散射轮廓5,11。BioXTAS RAW软件中提供了针对SAXS的特定实现方法17。EFA最初应用于色谱数据时，是利用二维二极管阵列数据构建吸光度随保留时间和波长变化的矩阵18。EFA的优势在于其关注奇异值的演化特征，即随着新组分的出现，奇异值如何变化，但前提是数据采集过程具有内在的顺序性10。幸运的是，SEC-SAXS数据以有序的二维数据阵列形式提供所有必要的按序采集数据，因此非常适用于EFA技术。
在第4节中，我们将演示如何从扣除缓冲液背景后的SAXS曲线进行无需模型假设的SAXS分析。这种无需模型假设的分析方法可确定颗粒的回转半径（Rg）、相关体积（Vc）、Porod体积（Vp）以及Porod-Debye指数（PE）。通过无量纲Kratky图，该分析可对颗粒的热力学状态（如致密性或柔性）进行半定量评估2,4,19。
最后，SAXS 数据是以倒易空间单位测量的，我们将展示如何将 SAXS 数据转换到实空间，以获得对距离分布函数 P(r)。P(r) 分布包含了粒子内部所有可能的距离信息，其中包括粒子的最大尺寸 dmax。由于这是一种热力学测量，P(r) 分布反映了粒子构象空间所占据的物理空间。对 SAXS 数据集的正确分析可提供溶液状态下的结构信息，这些信息可与晶体学和冷冻电镜获得的高分辨率数据相互补充。

<table><tbody><tr><td>光束线控制软件 BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot 等 (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>本地开发</td></tr><tr><td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td><td>MacCHESS</td><td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td><td>最初于 2008 年由 Soren Skou 开发，作为生物 X 射线全分析系统（BioXTAS）项目的一部分。此后得到广泛开发，近期工作由 Jesse B. Hopkins 完成</td></tr><tr><td>HPLC 程序 LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos 等 (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>本地开发</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>Scatter</td><td>Diamond Light Source Ltd</td><td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td><td>由 SIBYLS 光束线（美国加州伯克利 ALS）和布鲁克公司（德国卡尔斯鲁厄）支持</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 5/150 GL 色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td>用于 SEC-SAXS 分析的色谱柱</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr></tbody></table>

通过efa解卷积和scatter分析sec-saxs数据

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

生物小角X射线散射（BioSAXS）是一种广泛应用于分子与结构生物学的技术，用于测定大分子及大分子复合物在溶液中的结构、粒子尺寸与形状、比表面积以及构象变化。用于结构建模的高质量SAXS数据必须来源于单一分散且均一的样品，而这一要求通常只有通过在线色谱联用即时SAXS测量才能实现。最常用的方法是利用尺寸排阻色谱（SEC）分离样品，去除污染物和聚集体，从而可在色谱图上获得一个分辨良好的单一蛋白组分峰，并据此进行SAXS测量。然而，在某些情况下，即使采用在线纯化，也无法保证样品的单一分散性，原因可能是不同组分的分子大小过于接近，或因结合引起的形状变化导致洗脱时间发生偏移。此时，有可能通过对混合物的SAXS数据进行解卷积，获得各个组分的理想化SAXS曲线。本文展示了如何实现这一过程，并以理想样品和困难样品为例，演示SEC-SAXS数据的实际分析流程。具体而言，我们展示了对痘苗病毒E9 DNA聚合酶外切酶缺失突变体的SEC-SAXS分析。

与传统的帧选择方法13相比，去卷积的优势在于能够消除不同组分之间的相互干扰，从而获得单一分散体系的散射信号，同时通常还能提高信噪比。当E9 exominus与DNA结合并进行SEC-SAXS分析时，可观察到两个峰（图1）。第一个较大的峰（约第420–475帧）为E9 exominus-DNA复合物，第二个峰（约第475–540帧）为未结合状态（见补充数据：图2）。虽然传统帧选择方法在第一个峰中可获得稳定的回转半径（Rg）（见补充数据：图3），但第二个峰明显发生重叠，且整个图谱中的Rg变化表明该目标峰的Rg并不稳定，这是由于峰间交叉污染所致。仅能使用5个显示半稳定Rg的帧，经减除后得到Rg = 36.3 Å（图2，绿色）。当采用EFA对峰进行去卷积处理后，第二个峰对应的曲线（图2，蓝色）与原始曲线叠加，显示出信噪比显著提升，并记录到更低的Rg值，为34.1 Å。Kratky图（图3）显示，包含去卷积峰的复合物（蓝色）更趋于球状结构。这一结果由P(r)曲线（图4）进一步证实：去卷积曲线的dmax为108.5 Å（蓝色），而去卷积前的曲线则更为伸长，dmax为120 Å（绿色），这很可能源于游离态E9 exominus所导致的体系异质性。
<img alt="色谱分析，信号与帧数的关系图；光谱拟合，蛋白质稳定性研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：E9 exominus 单独存在及其与DNA形成复合物时的信号图。 
上图显示了尺寸排阻色谱-小角X射线散射（SEC-SAXS）运行中每一帧相对于背景的积分比值（浅蓝色）。红色数据点表示峰区内每一帧的Rg值。下图显示了相应的热图，根据Durbin-Watson自相关分析结果对每帧的残差进行着色，高度相似的区域呈青色，而差异较大的帧则从深蓝色过渡到粉红色，最终至红色，颜色变化反映差异程度的严重性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示 E9 exo minus 和 EFA 去卷积数据结果的小角X射线散射（SAXS）图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：强度对散射矢量的曲线图。 
E9 exominus 的减除 SAXS 数据叠加图。绿色曲线为5帧（第517–522帧）的平均值，从Rg相对稳定的区域中减除得到；蓝色曲线为通过SEC-SAXS峰的EFA去卷积获得的代表性散射曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="散射强度图，E9 exominus，EFA 去卷积，结构分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：无量纲 Kratky 曲线。 
去卷积后（蓝色）与未去卷积（绿色）Kratky 曲线的叠加图，显示 E9 exominus 具有球状结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="粒径分布，E9外泌体与EFA去卷积，图谱分析，埃米尺度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：P(r)曲线。 
E9 外切酶去卷积（蓝色）与未去卷积（绿色）曲线的叠加负. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>

生物大分子的尺寸排阻色谱-生物小角X射线散射（SEC-BioSAXS）测量是确定大分子及其复合物在溶液中结构的标准方法。本文中，我们分析了两种常见类型的SEC洗脱曲线所获得的SEC-BioSAXS数据——即具有完全分离峰和部分分离峰的色谱图。我们利用scatter和BioXTAS RAW软件演示了数据的分析与解卷积过程。

通过EFA解卷积和Scatter分析SEC-SAXS数据

生物小角X射线散射（BioSAXS）是分子生物学和结构生物学中常用的一种技术，用于测定溶液中分子的结构、颗粒大小与形状、比表面积与体积比……

生物小角X射线散射可提供大分子及大分子复合物的结构测量数据。理想情况下，待测样品应为单一分散体系。尽管在某些情况下，尺寸排阻色谱联用小角X射线散射（SAXS）仍不足以实现完全单分散，但可通过基于软件的小角X射线散射数据解卷积，获得理想化的小角X射线散射曲线。按照本方案，可使用去卷积程序和用户友好的 Scatter 程序分析痘苗病毒 DNA 聚合酶外切酶缺陷突变体。为对尺寸排阻色谱数据执行背景扣除，请打开基于 Java 的 Scatter 4 程序并切换至 SEC 选项卡。将已处理的数据文件拖放到“将数据拖至此处”窗口中，点击输出目录按钮并选择以设置保存数据的输出目录。在“另存为”框中输入样品名称，然后单击“轨迹”。单击“编辑详情”按钮以修改实验详情，并填写相应的字段。如需手动选择缓冲帧，请单击“设置缓冲”。左键单击并拖动，以在尺寸排阻色谱柱的洗脱曲线中重新选择大约 100 帧、位于空体积之前的平坦区域作为缓冲基线，然后单击“设置缓冲”并更新，以重新计算 SEC 文件。左键单击并拖动，在信号图上选择一个感兴趣的区域，并通过左键单击并拖动热图中的十字准线，选择用于合并的缩放区域和帧子集。再次单击左键，高亮显示热图中与十字准线下右方区域相对应的帧。理想情况下，该帧应突出显示以青色为主且回转半径稳定的区域。当对所选帧满意后，点击“合并”以合并已减去的帧，然后点击“分析”标签查看数据。为对数据进行去卷积，请在去卷积程序中加载该数据集。在控制面板的“文件”部分，使用文件夹图标找到数据，并选中所有 DAT 文件。积分强度相对于帧数的曲线图将在序列图中绘制。在“序列”选项卡下，单击以选中曲线，打开液相色谱分析弹出窗口。为选择合适的缓冲区域，请点击“添加区域”以在色谱峰之前和溶剂前沿之后各选择一个区域，然后点击“设置缓冲”。弹出窗口将提示尚未为背景选择帧。要开始EFA，请在高亮显示的文件上单击右键，然后从菜单中选择EFA。在弹出窗口中，应观察数据集的单值分解结果。在控制框中，勾选“使用帧”选项，以确认强度图中已覆盖整个需去卷积的峰区域。奇异值图将显示高于基线的奇异值强度。如果左侧和右侧的单向量不匹配，则将显著性单向量数目改为二，并移动框架，直到左侧和右侧的单向量相似为止。此时将计算EFA，为每个向量生成正向和反向的曲线图，并标示出各组分在所选尺寸排阻色谱SAXS数据的溶液分布曲线中开始出现和消失的时间点。RAW将尝试识别相应的范围。如有必要，使用箭头调整范围，使每个圆圈对应一个拐点的起点，即从基线开始上升或下降的点，然后点击下一步。为减少或消除尖峰，通过范围控制箭头调节分量范围，大致确定与尖峰对应的帧。当达到最小卡方值后，点击返回以执行验证检查。如果原始的EFA图谱仍然看起来有效，请单击“下一步”并保存EFA数据以存储图谱。然后单击“完成”以关闭EFA窗口。接着在RAW窗口中，打开绘图面板中的谱图以查看曲线。在控制面板的“轮廓”选项卡中，右键单击以将曲线保存为 DAT 文件。进行 SAXS 测定时，打开散射分析选项卡，选择 G 以启用手动吉尼尔分析工具。在图中添加或删除数据点，使残差图不出现微笑或皱眉状特征。Guinier 拟合中选定的数据不应超过最大队列乘以回转半径的 1.3 倍限制。点击归一化 Kratky 图。所得曲线可用于评估大分子的结构状态，包括球状、柱状、无序态，并对质量和浓度进行归一化。单击相关体积。总散射强度以及总散射强度随Q值变化曲线的积分面积将显示出来，可快速参考以验证散射曲线的质量。要开始柔性分析，请单击柔性。弹出窗口中的每个面板将显示一个利用了紧凑型与伸长型柔性生物大分子之间存在的幂律关系的图表。使用框底部的滑块更改数据视图，直到其中一个图表中出现平台期。完成柔性分析后，立即点击体积。将生成一个包含三个图表的弹出窗口。Porod-Debye 图会追踪柔韧性图中滑块的位置，并显示平台区域的数据。要计算粒子的体积，请移动起始点和结束点，直到图中蓝色线条与平台区域吻合。为了获得无偏结果，Porod-Debye 指数幂律拟合中的残差应无任何模式。在 R 值的 P 选项卡下，可观察样品的实空间分布和散射曲线。理想情况下，分布曲线应平滑无波动，并应轻微接触 x 轴。右键单击样本名称，然后点击“查找 DMAX”以打开新窗口。最大尺寸的限制已根据建议的最大 Q 范围、用于计算的最大数据点数、最大尺寸的下限和上限，以及 alpha 评分的下限和上限进行预设。点击“开始”。将生成一个复合分布，并建议最大尺寸和α水平。如果这些数据可接受，请关闭窗口返回至P of R选项卡，此时倒易空间图将被裁剪以匹配建议的最大Q范围。选择more模型，然后单击background，以将α水平和最大尺寸设置为弹出框中建议的数值。单击“优化”。将打开一个交叉验证图，显示是否有需要被剔除的数据点（以红色标示）。如果被剔除的数据点很少且分布情况良好，则表明模型是可靠的。您将在分析标签页中打印报告。左键单击以高亮选择样本，右键单击样本名称，然后选择“从单个数据集创建报告”。将打开一个文本框以供添加注释，同时会生成一份 PDF 文档，显示所有生成的图示和数值。在此代表性分析中，将 E9 DNA 聚合酶外切酶缺失突变体与 DNA 结合后，采用尺寸排阻色谱-小角 X 射线散射法进行检测，观察到两个峰。第一个较大的峰代表 E9 DNA 聚合酶外切酶缺失突变体与 DNA 的复合物，第二个峰则表示未结合状态。虽然通过经典方法选择图像帧可获得第一个峰中复合物稳定的回转半径，但第二个峰明显发生重叠，且整个图谱中的回转半径显示，由于交叉峰污染，第二个关注峰的回转半径并不稳定。在此分析中，仅能使用五个显示出半稳定回转半径的帧。将这些帧相减后，得到的回转半径为 36.3 埃。当使用 EFA 对峰进行解卷积时，第二个峰对应的曲线与原始曲线叠加，显示出信噪比明显降低，且回转半径减小至 34.1 埃。数据的Kratky图显示，去卷积峰对应的复合物更为球状，这一结论由PR曲线证实，该曲线给出去卷积曲线的最大尺寸为108.5埃。该分析中未去卷积的数据则更为伸长，最大尺寸为120埃，这很可能源于未结合的E9聚合酶缺失外切酶突变体所带来的异质性。最关键的步骤在于选择奇异值以及所用数据的范围，因为这些因素会显著影响去卷积的准确性。结果不应单独使用，而应结合其他技术（如分析型离心或多角度激光光散射）进一步评估，以便进行生物学解释。在线柱联用SAXS技术结合去卷积方法以及类似Scatter程序提供的用户友好界面，构成了一个强大的组合，即使针对本质上难以处理的体系，也能提供有意义的结构数据。

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