通过EFA解卷积和Scatter分析SEC-SAXS数据

生物小角X射线散射可提供大分子及大分子复合物的结构测量数据。理想情况下，待测样品应为单一分散体系。尽管在某些情况下，尺寸排阻色谱联用小角X射线散射（SAXS）仍不足以实现完全单分散，但可通过基于软件的小角X射线散射数据解卷积，获得理想化的小角X射线散射曲线。

按照本方案，可使用去卷积程序和用户友好的 Scatter 程序分析痘苗病毒 DNA 聚合酶外切酶缺陷突变体。为对尺寸排阻色谱数据执行背景扣除，请打开基于 Java 的 Scatter 4 程序并切换至 SEC 选项卡。将已处理的数据文件拖放到“将数据拖至此处”窗口中，点击输出目录按钮并选择以设置保存数据的输出目录。

在“另存为”框中输入样品名称，然后单击“轨迹”。单击“编辑详情”按钮以修改实验详情，并填写相应的字段。如需手动选择缓冲帧，请单击“设置缓冲”。

左键单击并拖动，以在尺寸排阻色谱柱的洗脱曲线中重新选择大约 100 帧、位于空体积之前的平坦区域作为缓冲基线，然后单击“设置缓冲”并更新，以重新计算 SEC 文件。左键单击并拖动，在信号图上选择一个感兴趣的区域，并通过左键单击并拖动热图中的十字准线，选择用于合并的缩放区域和帧子集。再次单击左键，高亮显示热图中与十字准线下右方区域相对应的帧。

理想情况下，该帧应突出显示以青色为主且回转半径稳定的区域。当对所选帧满意后，点击“合并”以合并已减去的帧，然后点击“分析”标签查看数据。为对数据进行去卷积，请在去卷积程序中加载该数据集。

在控制面板的“文件”部分，使用文件夹图标找到数据，并选中所有 DAT 文件。积分强度相对于帧数的曲线图将在序列图中绘制。在“序列”选项卡下，单击以选中曲线，打开液相色谱分析弹出窗口。

为选择合适的缓冲区域，请点击“添加区域”以在色谱峰之前和溶剂前沿之后各选择一个区域，然后点击“设置缓冲”。弹出窗口将提示尚未为背景选择帧。要开始EFA，请在高亮显示的文件上单击右键，然后从菜单中选择EFA。

在弹出窗口中，应观察数据集的单值分解结果。在控制框中，勾选“使用帧”选项，以确认强度图中已覆盖整个需去卷积的峰区域。奇异值图将显示高于基线的奇异值强度。

如果左侧和右侧的单向量不匹配，则将显著性单向量数目改为二，并移动框架，直到左侧和右侧的单向量相似为止。此时将计算EFA，为每个向量生成正向和反向的曲线图，并标示出各组分在所选尺寸排阻色谱SAXS数据的溶液分布曲线中开始出现和消失的时间点。RAW将尝试识别相应的范围。

如有必要，使用箭头调整范围，使每个圆圈对应一个拐点的起点，即从基线开始上升或下降的点，然后点击下一步。为减少或消除尖峰，通过范围控制箭头调节分量范围，大致确定与尖峰对应的帧。当达到最小卡方值后，点击返回以执行验证检查。

如果原始的EFA图谱仍然看起来有效，请单击“下一步”并保存EFA数据以存储图谱。然后单击“完成”以关闭EFA窗口。接着在RAW窗口中，打开绘图面板中的谱图以查看曲线。

在控制面板的“轮廓”选项卡中，右键单击以将曲线保存为 DAT 文件。进行 SAXS 测定时，打开散射分析选项卡，选择 G 以启用手动吉尼尔分析工具。在图中添加或删除数据点，使残差图不出现微笑或皱眉状特征。

Guinier 拟合中选定的数据不应超过最大队列乘以回转半径的 1.3 倍限制。点击归一化 Kratky 图。所得曲线可用于评估大分子的结构状态，包括球状、柱状、无序态，并对质量和浓度进行归一化。

单击相关体积。总散射强度以及总散射强度随Q值变化曲线的积分面积将显示出来，可快速参考以验证散射曲线的质量。要开始柔性分析，请单击柔性。

弹出窗口中的每个面板将显示一个利用了紧凑型与伸长型柔性生物大分子之间存在的幂律关系的图表。使用框底部的滑块更改数据视图，直到其中一个图表中出现平台期。完成柔性分析后，立即点击体积。

将生成一个包含三个图表的弹出窗口。Porod-Debye 图会追踪柔韧性图中滑块的位置，并显示平台区域的数据。要计算粒子的体积，请移动起始点和结束点，直到图中蓝色线条与平台区域吻合。

为了获得无偏结果，Porod-Debye 指数幂律拟合中的残差应无任何模式。在 R 值的 P 选项卡下，可观察样品的实空间分布和散射曲线。理想情况下，分布曲线应平滑无波动，并应轻微接触 x 轴。

右键单击样本名称，然后点击“查找 DMAX”以打开新窗口。最大尺寸的限制已根据建议的最大 Q 范围、用于计算的最大数据点数、最大尺寸的下限和上限，以及 alpha 评分的下限和上限进行预设。点击“开始”。

将生成一个复合分布，并建议最大尺寸和α水平。如果这些数据可接受，请关闭窗口返回至P of R选项卡，此时倒易空间图将被裁剪以匹配建议的最大Q范围。选择more模型，然后单击background，以将α水平和最大尺寸设置为弹出框中建议的数值。

单击“优化”。将打开一个交叉验证图，显示是否有需要被剔除的数据点（以红色标示）。如果被剔除的数据点很少且分布情况良好，则表明模型是可靠的。

您将在分析标签页中打印报告。左键单击以高亮选择样本，右键单击样本名称，然后选择“从单个数据集创建报告”。

将打开一个文本框以供添加注释，同时会生成一份 PDF 文档，显示所有生成的图示和数值。在此代表性分析中，将 E9 DNA 聚合酶外切酶缺失突变体与 DNA 结合后，采用尺寸排阻色谱-小角 X 射线散射法进行检测，观察到两个峰。

第一个较大的峰代表 E9 DNA 聚合酶外切酶缺失突变体与 DNA 的复合物，第二个峰则表示未结合状态。虽然通过经典方法选择图像帧可获得第一个峰中复合物稳定的回转半径，但第二个峰明显发生重叠，且整个图谱中的回转半径显示，由于交叉峰污染，第二个关注峰的回转半径并不稳定。

在此分析中，仅能使用五个显示出半稳定回转半径的帧。将这些帧相减后，得到的回转半径为 36.3 埃。当使用 EFA 对峰进行解卷积时，第二个峰对应的曲线与原始曲线叠加，显示出信噪比明显降低，且回转半径减小至 34.1 埃。

数据的Kratky图显示，去卷积峰对应的复合物更为球状，这一结论由PR曲线证实，该曲线给出去卷积曲线的最大尺寸为108.5埃。该分析中未去卷积的数据则更为伸长，最大尺寸为120埃，这很可能源于未结合的E9聚合酶缺失外切酶突变体所带来的异质性。最关键的步骤在于选择奇异值以及所用数据的范围，因为这些因素会显著影响去卷积的准确性。

结果不应单独使用，而应结合其他技术（如分析型离心或多角度激光光散射）进一步评估，以便进行生物学解释。在线柱联用SAXS技术结合去卷积方法以及类似Scatter程序提供的用户友好界面，构成了一个强大的组合，即使针对本质上难以处理的体系，也能提供有意义的结构数据。