Name: 异种移植模型中循环猪特异性DNA的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学习使用猪特异性引物和qPCR定量异种移植模型中循环猪特异性DNA的方法。该技术为监测免疫排斥反应提供了一种简单、低成本且微创的解决方案，适用于猪至小鼠和猪至猴的移植研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了国家重点研发计划项目资助&amp;中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、深圳市科技创新委员会基础研究项目（JCYJ20170817172116272）、广东省高水平医院建设专项资金（2019）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学学科建设基金（2016031638）、深圳市卫生和计划生育委员会科研项目（SZXJ2017021，SZXJ2018059）

所有实验均严格遵守深圳大学第一附属医院深圳市第二人民医院机构审查委员会的相关指南和规定。
1. 设计猪特异性引物
<ol>
	<li>使用 NCBI 软件进行全基因组 BLAST 分析，以鉴定与人类、猴或小鼠不同的猪特异性基因&#160;(www.ncbi.nlm.nih.gov)</li>
	<li>根据19个猪特异性基因设计引物（表1) 使用 Primer 5 软件</li>
</ol>
2. 提取基因组DNA
注意：使用商用基因组DNA提取试剂盒（材料表）提取基因组DNA（包括猪、猴、志愿者人类、移植猪组织的猴以及含猪源细胞的小鼠的血液样本）。
<ol>
	<li>分别将上述样品的500 µL全血加入不同的微量离心管中。</li>
	<li>向上述微量离心管中加入20 µL蛋白酶K和500 µL裂解缓冲液&#160;，然后充分振荡混匀。</li>
	<li>将这些微量离心管置于56 °C水浴中10分钟，并在此过程中振荡2-3次，直至溶液变澄清。</li>
	<li>短暂离心，以去除管盖内壁上的液滴。加入500 µL无水乙醇，充分振荡。</li>
	<li>将混合液转移至吸附柱中，在12,000 rpm（约13,400&#160;× g）条件下离心2分钟。</li>
	<li>向每个吸附柱中加入800 µL洗涤液，在12,000 rpm（&#160;约13,400 × g）条件下离心1分钟。将吸附柱在室温下放置数分钟，以干燥残留的洗涤液。 
	注意：洗涤液由制造商提供。</li>
	<li>将吸附柱转移至另一干净的离心管中，向吸附膜中央加入50 µL洗脱缓冲液，在室温下静置2-5分钟。在6,200 × g条件下离心1分钟，随后在12,000 rpm（约13,400 × g）条件下再次离心1分钟。 
	注意：洗脱缓冲液由制造商提供，但也可使用含有10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和0.1 mM EDTA的TE缓冲液进行DNA洗脱。</li>
	<li>将DNA溶液于-20 °C保存。</li>
</ol>
3. 验证引物的特异性
注意：上述19对引物的物种特异性已通过PCR确认，PCR使用了聚合酶（材料表）以及表1中列出的引物进行。
<ol>
	<li>配制预混溶液：将 12.5 µL 的 2x PCR 预混液&#160;（材料表）、1 µL 的 5' 引物（10 µM）、1 µL 的 3' 引物（10 µM）以及 8.5 µL 的 ddH2O 混合。配制时需额外增加 2 个样本的量。</li>
	<li>将 23 µL 预混溶液分装至 0.2&#160;mL 微量离心管中，每管加入 2 µL 基因组 DNA，并小心盖紧管盖。随后轻轻混匀并短暂离心。</li>
	<li>将 0.2&#160;mL 微量离心管放入 PCR 仪中，进行以下程序：变性：95 °C 持续 5 秒；退火：60 °C 持续 30 秒；延伸：72 °C 持续 30 秒。</li>
	<li>按以下步骤进行琼脂糖凝胶电泳：
	<ol>
		<li>称取 1.2 g 琼脂糖加入含有 100 mL 1x TAE 缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热煮沸 5 分钟。待溶液冷却至约 70 °C 后，加入 5 µL 核酸染料（材料表）。沿培养板边缘缓慢倒入溶液，并在室温下静置至凝胶完全凝固。</li>
		<li>将 5 µL 样品与 2-Log DNA Ladder（0.1–10.0 kb）或 Marker I（0.1–0.6 kb）分别加入琼脂糖凝胶加样孔中，上述样品均包含 1 µL 的 6x DNA 上样缓冲液。然后在 120 mA 条件下电泳，直至条带充分分离。</li>
		<li>使用紫外成像仪观察含有 DNA 片段的琼脂糖凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对上述样品进行琼脂糖凝胶电泳，以分离扩增的 DNA 片段，并通过紫外成像仪进行观察。利用 PCR 方法，首先鉴定了特异性扩增猪基因组 DNA 的引物（图 2A）。进一步验证了这些引物在猴/人基因组 DNA 混合样本或小鼠基因组 DNA 混合样本中对猪 DNA 的特异性扩增能力（图 2B）。最终，两种具有物种特异性的引物分别在猪-猴动脉补片模型和/或猪-鼠细胞移植模型中被证实可特异性扩增猪源 DNA（图 2C）。</li>
</ol>
4. cpsDNA 的标准曲线
<ol>
	<li>将含有猪源DNA片段的pMD19-T质粒转化至DH5α中，该质粒可由引物#4或引物#11（表1）特异性扩增。使用50 µg/mL氨苄青霉素筛选阳性菌落。 
	人/猴队列中的引物#4（正向：5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′，反向：5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′） 
	小鼠模型用引物#11（正向：5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′，反向：5′-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTC T-3′） 
	注：所有引物的详细信息见表1。</li>
	<li>按照以下步骤提取上述质粒。
	<ol>
		<li>从新鲜划线的选择性平板上挑取单菌落，接种于1–5 mL含有适当选择性抗生素的LB培养基中。在37 °C、剧烈振荡（300 rpm）条件下培养12–16小时。</li>
		<li>室温下以10,000 × g离心1分钟。弃去上清液。</li>
		<li>加入250 µL溶液I/RNase A。通过涡旋或反复吹打充分混匀。细胞沉淀的完全重悬对于获得高产量至关重要。 
		注：使用前必须将RNase A加入溶液I中。</li>
		<li>将悬浮液转移至新的1.5 mL微量离心管中。加入250 µL溶液II。反复倒置并轻轻旋转数次，直至获得澄清裂解液。可能需要孵育2–3分钟。 
		注：避免剧烈混合，以免剪切染色体DNA并降低质粒纯度。裂解反应时间不得超过5分钟。</li>
		<li>加入350 µL溶液III。立即反复倒置数次，直至形成絮状白色沉淀。 
		注：加入溶液III后必须立即并充分混匀，以避免局部沉淀。</li>
		<li>以最大速度（≥13,000 × g）离心10分钟，形成致密的白色沉淀。立即进行下一步操作。</li>
		<li>将DNA小量纯化柱插入2 mL收集管中。</li>
		<li>小心吸取步骤4.2.7中的澄清上清液，转移至DNA小量纯化柱中。注意不要扰动沉淀，避免细胞碎片进入纯化柱。</li>
		<li>以最大速度离心1分钟。弃去滤液，收集管可重复使用。</li>
		<li>加入500 µL HBC缓冲液。以最大速度离心1分钟。弃去滤液，收集管可重复使用。 
		注：使用前HBC缓冲液必须用100%异丙醇稀释。</li>
		<li>加入700 µL DNA洗涤缓冲液。以最大速度离心1分钟。弃去滤液，收集管可重复使用。 
		注：使用前DNA洗涤缓冲液必须用100%乙醇稀释。
		<ol>
			<li>可选：重复一次DNA洗涤缓冲液洗涤步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将空的DNA小量纯化柱以最大速度离心2分钟，以干燥柱基质。 
		注：在洗脱前充分干燥DNA小量纯化柱基质非常重要。残留的乙醇可能干扰下游实验。</li>
		<li>将DNA小量纯化柱转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>直接向柱膜中心加入30–100 µL洗脱缓冲液或无菌去离子水。 
		注：DNA从小量纯化柱上的洗脱效率依赖于pH值。若使用无菌去离子水，应确保其pH值约为8.5。</li>
		<li>室温静置1分钟。</li>
		<li>以最大速度离心1分钟。 
		注：此步骤可回收约70%结合的DNA。可进行第二次洗脱以获得残留DNA，但浓度较低。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用EcoR I（15 U/µL）和Bam H1（15 U/µL）双酶切验证上述质粒22。
	<ol>
		<li>在冰上配制反应体系：加入1 µL EcoR I（15 U）、1 µL Bam H1（15 U）、2 µL 10×缓冲液、1 µg质粒DNA，ddH2O补足至20 µL总体积，充分混匀。在37 °C水浴中孵育2小时。</li>
		<li>通过1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，并如前所述在紫外光下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用ddH2O将浓缩质粒稀释为起始标准品溶液（2 × 1011 拷贝/mL）。以含有猪源DNA片段的质粒（P2）为例，计算拷贝数：
	<ol>
		<li>计算1 mL起始标准品溶液中的质粒数量：N = (2 × 1011) / (6.02 × 1023) mol。</li>
		<li>计算P2的分子量：M = 2810 bp × 650 D/bp = 2810 × 650 D（g/mol）。</li>
		<li>计算P2的质量：m = N × M = (2 × 1011) / (6.02 × 1023) mol × 2810 × 650 g/mol。</li>
		<li>计算P2的体积：V = m/C = [(2 × 1011)/(6.02 × 1023) × 2810 × 650] g/C。&#160;（C为P2的浓度（ng/µL），通过分光光度计测定）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用ddH2O将起始标准品溶液进行10倍系列稀释，得到2 × 1010 拷贝/mL、2 × 109 拷贝/mL、2 × 108 拷贝/mL、2 × 107 拷贝/mL…直至2 × 100 拷贝/mL的标准品溶液。稀释过程中需充分涡旋混匀。</li>
	<li>建立标准曲线。
	<ol>
		<li>配制qPCR反应体系（所有步骤避光操作）：将含有325 µL qPCR Mix（材料表）、13 µL 5′引物、13 µL 3′引物和169 µL ddH2O的预混液加入1.5 mL微量离心管中，充分混匀后短暂离心。</li>
		<li>将上述40 µL预混液分装至8联管中，每管加入10 µL不同浓度的标准DNA。小心封盖，混匀后短暂离心。</li>
		<li>将8联管放入qPCR仪中，按照图3所示程序运行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从血液样本中分离循环DNA
<ol>
	<li>使用含EDTA的试管，在猪-猴动脉补片模型和猪-鼠细胞移植模型中于不同时间点采集血液样本。</li>
	<li>采集约400 µL（来自猪-猴动脉补片模型）或100 µL（来自猪-鼠细胞移植模型）的血液样本，转移至1.5 mL微量离心管中。在低温、高速条件下离心（3,000 × g，4 °C，5 min），去除血液样本中的血细胞。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，并在16,000 × g 条件下离心10 min，以去除细胞碎片。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。使用商品化的血清/游离DNA提取试剂盒，按照基因组DNA提取厂商说明书中的方案2，从上述上清液中提取循环DNA。</li>
	<li>将提取的循环DNA浓缩至40 µL，并于-20 °C保存。</li>
</ol>
6. 循环猪特异性DNA的定量
<ol>
	<li>配制预混液：25 µL qPCR Mix（材料表）、1 µL 5' 引物、1 µL 3' 引物、10 µL 样品 DNA 和 13 µL ddH2O。配制时应多准备两个样本的用量。</li>
	<li>将40 µL预混液分装至8联管中，每管加入10 µL样品DNA，随后小心盖紧管盖。反应体系数量应比实际需要多准备两个。</li>
	<li>将8联管放入qPCR仪中，操作步骤与标准曲线相同。建议先运行一次标准品反应，以确保反应条件适合定量分析。qPCR反应体系的操作流程见图3。</li>
</ol>

<ol><li>Buchman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+General+Surgery%22%5BJournal%5D)">Multiple organ failure.</a> Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).</li>
<li>Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+donation+after+circulatory+death%3A+current+status+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Organ donation after circulatory death: current status and future potential.</a> Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).</li>
<li>Lopez-Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+needed+Convention+against+trafficking+in+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A needed Convention against trafficking in human organs.</a> Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).</li>
<li>Sykes, M., Sachs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanting+organs+from+pigs+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science+immunology%22%5BJournal%5D)">Transplanting organs from pigs to humans.</a> Science immunology. 4 (41), 6298(2019).</li>
<li>Reardon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+life+for+pig-to-human+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New life for pig-to-human transplants.</a> Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).</li>
<li>Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Regulation+Profile+of+Mature+MicroRNA+in+the+Pig%3A+Relevance+to+Xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation.</a> BioMed Research International. 2018, 2983908(2018).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+%2FCD8%28%2B%29+T-cell+ratio+correlates+with+the+graft+fate+in+pig-to-non-human+primate+islet+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 27 (2), 12562(2020).</li>
<li>Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarkers+for+graft+rejection+in+pig-to-non-human+primate+corneal+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12515(2019).</li>
<li>Agbor-Enoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+as+a+biomarker+of+tissue+injury%3A+Assessment+in+a+cardiac+xenotransplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).</li>
<li>Vito Dabbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+symptom+reports+useful+for+differentiating+between+acute+rejection+and+pulmonary+infection+after+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+%26+Lung%22%5BJournal%5D)">Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation.</a> Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).</li>
<li>Miller, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+approaches+for+the+diagnosis+of+acute+cardiac+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.</a> Heart. 99 (7), 445-453 (2013).</li>
<li>Mandel, P., Metais, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+acides+nucl%C3%A9iques+du+plasma+sanguin+chez+l%27homme%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+des+Seances+de+l+Academie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme.</a> Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).</li>
<li>Okkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell-free+DNA+in+patients+needing+mechanical+ventilation%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation.</a> Critical Care. 15 (4), 196(2011).</li>
<li>Wagner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA--new+potential+analyte+in+clinical+laboratory+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemia+Medica%22%5BJournal%5D)">Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics.</a> Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li>
<li>Mohiuddin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+2C10R4+anti-CD40+antibody+therapy+is+critical+for+long-term+survival+of+GTKO.hCD46.hTBM+pig-to-primate+cardiac+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft.</a> Nature Communications. 7, 11138(2016).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24(2014).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).</li>
<li>Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+noninvasive+detection+of+solid+organ+transplant+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).</li>
<li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+infection+and+rejection+after+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+pig-specific+DNA+as+a+novel+biomarker+for+monitoring+xenograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (4), 12522(2019).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+mi+RNA+or+circulating+DNA+%E2%80%94Potential+biomarkers+for+organ+transplant+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection.</a> Xenotransplantation. 26 (1), 12444(2019).</li>
<li>Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+donor+DNA+concentrations+in+recipient+serum+correlate+with+pancreas-kidney+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection.</a> Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

定量检测猪源性循环DNA是监测异种移植免疫排斥反应的一种可行方法。Gadi等人24发现，发生急性排斥反应患者的血液中供体来源的循环DNA（ddcfDNA）含量显著高于无排斥反应患者。这些研究表明，ddcfDNA可能是监测器官移植物损伤的通用生物标志物。近年来，由于qPCR操作简便、自动化程度高、灵敏度高、特异性好且成本低，其在核酸检测分析中的应用日益广泛。
在本研究中，根据生物信息学分析结果设计了猪特异性引物，并通过常规PCR验证其特异性。利用qPCR可精确量化猪-猴动脉补片模型和猪-鼠细胞移植模型血液样本中的cpsDNA。&#160;使用物种特异性引物。该方法的主要优势如下：首先，基于高度特异性的引物，该DNA定量方法具有高灵敏度和高特异性；此外，该方法的操作流程非常简便，包括特异性引物设计、DNA提取和qPCR。&#160;一体化分析&#160;工作日，节省时间。该方法为非侵入性&#160;起始于少量血清或血浆样本。同时，我们已证明该方法具有高度可重复性22与高通量测序和飞行时间质谱...

器官衰竭是导致死亡的主要原因之一1。细胞、组织和器官移植是治疗器官衰竭的有效方法2。然而，供体器官的短缺限制了该方法的临床应用3,4。研究表明，猪可作为临床移植中人类器官的潜在来源5,6。然而，异种器官移植面临严重的免疫排斥风险。因此，对异种移植后的免疫排斥反应进行监测至关重要。目前，临床上对免疫排斥的监测主要依赖患者的体征和症状，以及实验室检查（如活检、免疫生化分析和超声检查）7,8,9。然而，这些监测方法存在诸多缺点：患者出现免疫排斥的体征和症状通常较晚10，不利于早期发现和早期干预；活检具有侵入性11，患者不易接受；免疫生化分析缺乏足够的敏感性或特异性，而超声检查则仅为辅助手段且费用较高。因此，迫切需要寻找一种有效且便捷的方法来监测免疫排斥反应。
循环DNA是一种存在于血液中的细胞外DNA。Mandel和Metais12于1948年首次报道了在外周血中存在循环DNA。在正常生理条件下，健康人血液中的循环DNA基础水平相对较低。然而，在某些病理状态下，例如肿瘤、心肌梗死、自身免疫性疾病和移植排斥反应，由于细胞凋亡和坏死导致循环DNA大量释放，血液中循环DNA的水平可显著升高13,14。循环DNA的来源与凋亡和坏死有关15，而这些过程是异种移植排斥反应的特征16。
循环DNA已被证实为一种用于癌症检测的微创生物标志物17,18,19。对供体来源的循环DNA进行高通量测序，可用于器官移植后排斥反应的可靠检测20,21。然而，该方法需要提取高浓度和高质量的DNA。除高昂的成本和耗时外，DNA的需求也限制了该方法在临床常规应用中的可行性。通过定量实时PCR（qPCR）可精确量化供体来源的循环DNA，该方法具有高度的特异性和灵敏性。因此，利用qPCR定量猪源循环DNA是监测异种移植免疫排斥反应的一种可行方法。该方法侵入性小、灵敏度高、特异性强、成本低且节省时间。猪与人类在遗传上属于不同物种，基因组序列差异显著（图1）。因此，在异种移植后，由于异种排斥反应，猪的循环DNA可释放进入受体血液中。通过受体血液中物种特异性引物的qPCR，可对猪源循环DNA（cpsDNA）进行精确定量。此前，我们已证实了cpsDNA作为异种移植生物标志物的理论依据和可行性22,23。本文中，我们将进一步披露更多实验技巧与细节。本实验包括以下步骤：首先，设计猪特异性引物，并提取基因组DNA，用于通过常规PCR验证引物的特异性；其次，构建cpsDNA的标准曲线，并从样本血液中分离cpsDNA；最后，利用&#160;qPCR对循环中的猪特异性DNA进行定量。

<table><tbody><tr><td>&lt;a&gt;琼脂糖&lt;/a&gt;</td><td>Biowest，巴塞罗那，西班牙</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室公司</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Axygen&amp;nbsp;美国加利福尼亚州联合市生物科学公司</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td>Axygen&amp;nbsp;美国加利福尼亚州联合市生物科学公司</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>中国广东省医学实验动物中心&amp;nbsp; 中国</td><td></td><td>8~10 周</td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;Fisher&amp;nbsp;美国马萨诸塞州沃尔瑟姆科学公司</td><td>Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>2-Log DNA Ladder</td><td>美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室公司</td><td>N3200S</td><td>0.1&amp;ndash;10.0 kb</td></tr><tr><td>标记物 I&amp;nbsp;</td><td>天根，北京，中国</td><td>MD101-02</td><td>0.1&amp;ndash;0.6 kb</td></tr><tr><td>DNA小柱（HiBind DNA Mini Columns）</td><td>Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯</td><td>DNACOL-01</td><td></td></tr><tr><td>DNA上样缓冲液</td><td>Solarbio，北京，中国</td><td>D1010</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I 和 E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 II</td><td>Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯</td><td>D6942</td><td></td></tr><tr><td>D6943</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoR I</td><td>Takara&amp;nbsp;日本滋贺生物</td><td>&amp;nbsp;1040S</td><td></td></tr><tr><td>中国台湾巴马小型母猪</td><td>中国深圳华大基因 Ark 生物技术有限公司</td><td></td><td>2～4个月</td></tr><tr><td>基因组DNA提取试剂盒</td><td>天根，北京，中国</td><td>DP304-02</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液</td><td>日本大阪，Toyobo</td><td>QPK-201</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统 XR</td><td>Bio-Rad，Hercules，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>雄性食蟹猴</td><td>中国广州，广东兰道生物科技</td><td></td><td>8年</td></tr><tr><td>核酸染料（Gelred）</td><td>Biotium，弗里蒙特，美国</td><td>42003</td><td></td></tr><tr><td>聚合酶（Premix Taq）</td><td>Takara&amp;nbsp;日本滋贺县，Bio</td><td>RR901A</td><td></td></tr><tr><td>pMD19-T 质粒</td><td>Takara&amp;nbsp;日本，滋贺，Bio</td><td>D102A</td><td></td></tr><tr><td>qPCR仪</td><td>Applied Biosystems QSDx，美国沃尔瑟姆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清/游离DNA提取试剂盒</td><td>天根，北京，中国</td><td>DP339</td><td></td></tr><tr><td>TAE</td><td>生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海</td><td>B548101</td><td></td></tr></tbody></table>

异种移植模型血液中循环猪特异性dna的定量分析

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

异种移植是治疗器官衰竭的一种可行方法。然而，如何有效监测异种移植后的免疫排斥反应，仍是临床医生和研究人员面临的问题。本文描述了一种简单且有效的方法，用于监测猪-小鼠细胞移植模型以及猪-猴动脉补片移植模型中的免疫排斥反应。循环DNA是一种潜在的非侵入性器官损伤生物标志物。在本研究中，通过实时定量PCR（qPCR）技术监测异种移植物排斥过程中循环的猪特异性DNA（cpsDNA）。在该实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了包含猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线。随后，利用物种特异性引物通过qPCR在猪-小鼠细胞移植模型和猪-猴动脉补片移植模型中定量cpsDNA。该方法的价值在于，其可作为一种简单、便捷、低成本且侵入性较小的方法，用于监测异种移植的免疫排斥反应。

在本实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了含有猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线（图4）。通过PCR验证了19对引物的物种特异性。随后使用物种特异性引物（引物#4和引物#11）在猪-小鼠细胞移植模型及猪-猴动脉补片移植模型中通过qPCR对猪源性细胞DNA（cpsDNA）进行定量。
采用琼脂糖凝胶电泳从上述样品中分离扩增的DNA片段，并在紫外成像仪中进行观察。通过PCR首先鉴定了特异性扩增猪基因组DNA的引物（图2A）。进一步证实了这些引物在猴/人基因组DNA混合样本或小鼠基因组DNA混合样本中具有物种特异性，能够特异性扩增猪的DNA（图2B）。最后，进一步证明了两种具有物种特异性的引物分别可在猪-猴动脉补片模型和/或猪-小鼠细胞移植模型中特异性扩增猪的DNA（图2C）。
<p class="jove_content" f...

在本实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了含有猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线。利用物种特异性引物，通过qPCR在猪-小鼠细胞移植模型和猪-猴动脉补片移植模型中对cpsDNA进行了定量检测。

异种移植模型血液中循环猪特异性DNA的定量分析

异种移植是治疗器官衰竭的一种可行方法。然而，如何有效监测异种移植的免疫排斥反应仍是一个……

异种移植是治疗的一种可行方法。然而，对异种移植免疫排斥反应进行有效监测仍是临床医生和研究人员面临的问题。本方案提供了一种简单、便捷、低成本且侵入性较小的方法，用于监测异种移植的免疫排斥反应。该技术可应用于异种移植领域，包括猪到人的胰岛移植、肾脏移植、肝脏移植和心脏移植。首先将500 µL血液样本分别转移至不同的微量离心管中。向各管中加入20 µL蛋白酶K和500 µL裂解缓冲液。然后充分振荡混匀。将试管置于56摄氏度的水浴中10分钟，孵育期间振荡2至3次，直至溶液变澄清，然后短暂离心，以去除管盖内壁的液滴。随后加入500 µL无水乙醇，充分振荡。将混合液转移至吸附柱中。然后将吸附柱离心两分钟，并弃去废液。向每根吸附柱中加入800 µL洗涤液，再离心一分钟。将吸附柱在室温下放置数分钟，以干燥残留的洗涤液。将吸附柱转移至干净的离心管中。向吸附膜中央加入50微升洗脱缓冲液，在室温下静置2至5分钟，然后离心1分钟。根据手稿说明配制PCR主混合液，随后将23微升混合液加入每个0.6毫升微量离心管中。向每个试管中加入两微升基因组 DNA，并小心混匀。然后短暂混合并离心。将试管放入 PCR 扩增仪中，开始扩增反应。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。将1.2克琼脂糖加入含有100毫米TAE的烧瓶中，在微波炉中煮沸5分钟。当琼脂糖冷却至约70摄氏度时，向烧瓶中缓慢加入5微升核酸染料，然后缓慢倒入制胶板中，在室温下静置直至凝固成胶。将每个样品以及2-Log DNA Ladder或DNA Marker 1各取5 µL加入琼脂糖凝胶的加样孔中，在120 mV下电泳，直至条带分离。使用紫外成像仪观察凝胶。按照文稿中所述进行转化后，用EcoR I和Bam HI双酶切验证质粒。将酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用紫外光照射凝胶进行观察。使用双蒸水将浓缩质粒与猪DNA片段稀释至每毫升2 × 10¹¹拷贝，作为起始标准溶液。为建立标准曲线，按照文稿中所述配制qPCR预混液，并将40微升预混液加入八联管的每管中。向各管中分别加入10微升不同浓度的标准DNA，盖上管盖，短暂混匀后离心。将试管放入qPCR仪中进行扩增。使用EDTA管从猪-猴动脉补片模型中采集约400 µL的血液样本，或从猪-小鼠细胞移植模型中采集100 µL的血液样本，然后将样本转移至1.5 mL离心管中。通过低温高速离心去除血液样本中的血细胞。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并在16,000 × g条件下离心10分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，使用商品化的血清游离DNA提取试剂盒提取循环DNA。将游离DNA的体积浓缩至40微升，并在-20摄氏度下保存。通过qPCR定量循环中的猪特异性DNA。在猪-小鼠细胞移植模型以及猪-猴动脉补片移植模型中，使用设计并优化的猪特异性引物，通过qPCR定量循环中的猪特异性DNA。采用琼脂糖凝胶电泳分离扩增的DNA片段。通过PCR鉴定出特异性扩增猪基因组DNA的引物。随后，验证了这些引物在猴或人基因组DNA样本群以及小鼠基因组DNA样本群中的物种特异性。最后，使用两种物种特异性引物扩增猪-猴动脉补片以及猪-鼠细胞移植模型中的猪源DNA。在进行该实验方案时，最重要的是要防止各类污染。该技术为研究人员探索异种移植领域的新问题提供了途径，因为它是一种简单、低成本且非侵入性的方法，可用于监测异种移植的免疫排斥反应。

quantification-circulating-pig-specific-dna-blood-xenotransplantation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

异种移植模型中循环猪特异性DNA的定量

我们描述了一种利用非病毒型piggyBac转座子系统将外源基因导入原代人T细胞的遗传修饰方法。通过piggyBac转座子系统修饰的T细胞可实现外源基因的稳定表达。...

piggyBac 转座子系统对人原代T细胞的改造

本方案介绍了一种准确、廉价、快速且无毒的方法，通过将第30天的猪胚胎研磨成粉末后直接进行PCR，无需苯酚-氯仿抽提和DNA柱纯化，即可鉴定胚胎性别。...

通过PCR技术对第30天猪胚胎进行准确且无酚的DNA性别鉴定

本文介绍了一种通过每周腹腔注射经细胞因子转导的基质细胞系，在患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中产生外源性细胞因子的方法。该方法拓展了PDX模型的应用范围，并为在多种PDX模型中实现外源性细胞因子的瞬时或持续递送提供了选择。...

通过注射经细胞因子转导的基质细胞系在患者来源的异种移植瘤中表达外源性细胞因子

本方案旨在描述猪肝细胞的分离方法 离体...

慢病毒载体介导的肝细胞基因治疗 离体 用于猪的自体移植

用于豚鼠外周血单个核细胞的干扰素-γ ELISpot...

优化的干扰素-γ ELISpot 法检测豚鼠疫苗接种后T细胞免疫应答

本文介绍了一种在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中诱导并评估疾病发生的方法。xenoGVHD...

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

本方案描述了一种猪同种原位肝移植模型，供体器官经20小时静态冷保存后进行移植，且在植入过程中未使用静脉-静脉转流。该方法采用简化的外科技术，缩短无肝期，并结合精细的容量管理和血管活性药物调控。...

无静脉-静脉转流的猪肝脏移植作为扩展标准供体模型

本研究提出了一种采用双房技术的巴马微型猪临床前原位心脏移植模型。该模型适用于移植免疫学、药物评价及手术技术优化，可为临床心脏移植应用提供支持。...

使用双心房技术的巴马香猪原位心脏移植临床前模型

本研究建立了两种标准化的小鼠异种移植模型，可特异性地模拟急性细胞性排斥反应和急性抗体介导的排斥反应。这些模型为研究移植物免疫排斥机制、评估免疫抑制策略以及推进异种移植的临床前研究提供了可靠的平台。...

一种用于研究异种移植中急性细胞和抗体介导排斥反应的标准化小鼠模型及三人工作流程

本研究介绍了一种使用α-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪和猕猴的临床前异位腹部心脏异种移植模型。该模型结合了优化的受体筛选、血管吻合技术以及围手术期管理策略。该模型适用于评估新型免疫抑制剂，为推进心脏异种移植研究提供了一个便捷的平台。...

一种标准化的猪到猕猴异位心脏异种移植模型

学习使用猪特异性引物和qPCR定量异种移植模型中循环猪特异性DNA的方法。该技术为监测免疫排斥反应提供了一种简单、低成本且微创的解决方案，适用于猪至小鼠和猪至猴的移植研究。

异种移植模型血液中循环猪特异性DNA的定量分析

探索更多视频