实现快速蛋白质光化学氧化中实时校正以确定蛋白质拓扑结构变化

该方法可促进蛋白质构象及蛋白质相互作用的测定。缓冲液组成、样品纯度和蛋白质浓度要求较为灵活，使该方法能够解决具有挑战性的结构问题。该技术可在多种不同的缓冲体系中实现样品的浓缩。

利用我们的剂量测定方法，研究人员可以实时监测标记反应的进行情况。该技术的一个应用领域是药物开发，因为它使研究人员能够测试差异较大的药物配方及其对蛋白质结构的影响。准备FPOP光学平台。

首先打开激光器，并将激光器设置为外部触发、恒定能量模式，且不进行气体更换。当激光器预热完成后，将每次脉冲的激光能量设置在每脉冲80至120毫焦之间，并使用丁烷喷灯轻轻灼烧毛细管上的聚酰亚胺涂层，灼烧位置应位于在线剂量计将在激光照射后于265纳米处读取吸光信号的位置。使用无尘擦拭布和甲醇轻轻擦拭毛细管上的残留物，然后将清洁后的毛细管穿过激光光路并插入在线剂量计中。

按下在线剂量计顶部的杠杆以打开铰链，并取下磁性固定夹。使用磁性固定夹将毛细管放置在在线剂量计的仪器槽内，以保持毛细管位置固定，然后合上剂量计的铰链，压紧铰链直至杠杆锁定到位。在剂量测定软件中点击“开始闪光”按钮以启动准分子激光器，并在剂量测定软件中将预设重复频率设置为10至20赫兹，同时激光发射时移动电动载物台使其完成整个运动范围，确保光束始终居中于孔径，并在整个过程中可观察到毛细管的轮廓。

然后以每分钟20 µL的流速用水冲洗毛细管至少一分钟，并在剂量计软件中点击“开始数据采集”和“自动归零”，使剂量计在开始数据采集前对水进行归零。进行FPOP实验时，将2 µL过氧化氢加入18 µL的FPOP溶液中，用移液器轻轻混合，通过离心迅速收集管底溶液，并立即使用气密注射器将溶液装入注射泵。在剂量计软件中点击“启动泵”和“开始数据采集”，以设定的流速启动注射泵流动，同时使用在线剂量计监测腺嘌呤的实时读数，直至265 nm处的吸光信号稳定，并将样品收集至废液容器中。

要开始以预设的重复频率和能量发射激光，请点击剂量计软件中的“开始闪光”按钮，并使用内置剂量计监测实时的腺嘌呤读数。激光关闭与激光开启时在265纳米处吸光度的差值，即为265纳米处的吸光度变化读数。为确保不同样品间有可比量的羟基自由基可用于与蛋白质反应。

将在线剂量计测得的265纳米处的吸光度变化值，与先前实验或对照组获得的目标265纳米吸光度变化值进行比较。若读数达到目标水平，则在激光或辐射处理后立即用淬灭缓冲液收集样品。为使有效自由基剂量一致以匹配吸光度读数，可通过调整过氧化氢浓度、改变每脉冲激光能量，或调节聚焦透镜的焦平面以提高激光注量。

若要使差分吸光度读数的变化大于10毫吸光度单位，请使用更多或更少的过氧化氢重新制备样品，并按演示方法重新运行样品。若要在实时测量中对吸光度读数进行微小调整，可使用50毫米电动载物台调节聚焦透镜的位置，从而调整入射光束的焦平面。为了测量激光辐照后样品中羟基自由基的有效含量，需使用在线紫外毛细管检测器实时监测腺嘌呤在265纳米处的差分吸光度，并通过电动载物台调节透镜位置，直至265纳米处的差分吸光度读数达到预期值。

阿达木单抗生物类似药在磷酸盐缓冲液中及其在55摄氏度加热一小时后的重链肽段足迹比较显示，当蛋白质加热形成聚集体时，所示肽段区域对溶剂表现出显著的保护作用。通过在线剂量计实时监测激光或辐射前后腺苷吸收物的差异，结果表明，在MES缓冲液中观察到的腺苷吸收物水平变化与磷酸盐缓冲液中相当。然而，肽段的平均氧化水平在MES缓冲液中低于磷酸盐缓冲液。

然而，当增加激光通量以获得相等的腺嘌呤剂量测定响应时，FPOP处理后肽段在MES缓冲液和磷酸盐缓冲液中的平均氧化值几乎相同。由于剂量测定读数受激光通量、过氧化氢浓度以及自由基清除剂的影响，需注意确保样品间的剂量测定响应接近一致。

定点突变常用于研究在FPOP中受到保护的位点。这使得研究人员能够确定这些变化是否由Alistair引起。该技术有助于比较不同缓冲液或配方中的蛋白质，使研究人员能够确定不同添加剂对蛋白质构象的影响。