Name: 实现蛋白质快速光化学氧化的实时补偿，用于确定蛋白质地形变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习使用快速光化学氧化蛋白质技术进行实时剂量监测，以分析蛋白质构象变化和相互作用。该方法适用于多种缓冲体系，可应用于药物开发中的蛋白质结构研究。

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我们感谢美国普通医学科学研究所提供的研究经费，资助编号R43GM125420-01，用于支持台式FPOP设备的商业化开发，以及资助编号R01GM127267，用于开发高能FPOP的标准化和剂量测定方案。

1. 准备用于FPOP的光学平台和毛细管
警告：KrF 准分子激光器对眼睛具有极高危害性，直接或反射的激光均可能造成永久性眼损伤。操作时务必佩戴适当的护目镜，尽量避免在光束路径附近放置任何反射物体，并采用工程控制措施防止未授权人员接触工作中的激光器，同时限制任何杂散反射光。
<ol>
	<li>准备FPOP光学平台。
	<ol>
		<li>开启激光器进行预热。将激光器设置为外部触发、恒定能量、不更换气体模式。设置每脉冲激光能量（通常在80-120 mJ/脉冲之间）。</li>
		<li>搭建光学平台，将平凸透镜（直径30 mm，焦距120 mm，未镀膜）置于激光束路径中，并在后方设置非反射挡板以吸收光线，如图3A所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="带有毛细管、紫外剂量计、透镜的激光光谱装置，用于光学激发和分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：FPOP实验用光学平台。（A）将样品与H2O2、腺嘌呤自由基剂量计和谷氨酰胺清除剂混合后装入注射器。样品通过流动被推入熔融石英毛细管，并穿过KrF准分子紫外激光器的聚焦光路。紫外光将H2O2光解为羟基自由基，后者氧化蛋白质和腺嘌呤剂量计。注射器的流动在下一次激光脉冲前将已照射的样品推出激光光路，使被照射区域之间保留未照射的排除体积。氧化反应发生后，样品立即通过一个串联的紫外分光光度计，测量腺嘌呤在265 nm处的紫外吸光度。随后，样品被注入淬灭缓冲液，以消除残留的H2O2和次级氧化剂。（B）通过在毛细管后方粘贴一张彩色便签纸，并用248 nm激光照射，从而测量光斑尺寸。光斑宽度用于计算样品流速，而光斑中心毛细管的轮廓阴影则用于光学平台的对准。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>截取适当长度的熔融石英毛细管（外径 360 µm，内径 100 µm），并使用套管通过低死体积连接器将其连接至气密性注射器。</li>
	<li>在样品经激光照射后，使用丁烷喷灯轻轻烧除毛细管上在线剂量计在 265 nm 处读取吸光度信号位置的聚酰亚胺涂层。用浸有甲醇的无尘布轻轻擦拭毛细管上的残留物。入射激光位置处的聚酰亚胺涂层可同样用丁烷喷灯烧除，或使用低功率激发的准分子激光烧除。 
	注意：等待毛细管冷却后再操作，因在热毛细管上使用甲醇存在火灾隐患。</li>
	<li>将该毛细管穿过激光光路并插入在线剂量计中。
	<ol>
		<li>按下在线剂量计顶部的杠杆以打开铰链，取下磁性固定夹。将毛细管放入在线剂量计的精密加工凹槽中，并使用磁性固定夹固定毛细管位置。将剂量计铰链盖在毛细管上，并压下直至杠杆锁定到位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用剂量测定软件，点击 开始闪光 按钮以启动准分子激光发射。在激光控制软件中将预设激光能量设置为 50–100 mJ/脉冲，并在剂量测定软件的“设置”选项卡中将预设重复频率设置为 10–20 Hz。
	<ol>
		<li>使用安装在电动线性位移台上的平凸透镜聚焦激光束。使用卡尺在粘性纸片上精确测量毛细管位置处激光光斑的宽度和高度，以计算入射能量密度（mJ/mm2），如 图 3B 所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在毛细管附近放置一个不透明光阑，以确保无论由于透镜移动或激光每脉冲能量变化导致的光束尺寸改变，毛细管的被照宽度保持一致18。
	<ol>
		<li>在激光发射状态下，移动电动位移台至其运动范围的各个位置。确保光束始终居中于光阑，并在整个过程中可观察到毛细管的轮廓。在电动位移台运动范围内的每一点，光阑直径必须小于入射聚焦光束的宽度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 20 µL/min 的流速使水通过毛细管至少一分钟，以清洗毛细管。
	<ol>
		<li>点击剂量计软件上的 开始采集 + 自动归零 按钮，将剂量计以水为基准归零并开始数据采集。 
		注意：若 FPOP 的缓冲体系在 265 nm 处具有显著紫外吸收，则应以缓冲液而非水对 FPOP 系统进行归零。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在注射泵上设置计算所得的流速。
	<ol>
		<li>蛋白样品的流速取决于每次激光脉冲的照射体积（VIrr）、每秒激光脉冲数（R）以及期望的未照射排除体积分数（FEx），后者用于校正层流效应和样品扩散（推荐值为 0.15–0.30）2,19,20。根据毛细管内径（单位：mm，记为 d）和激光光斑在毛细管上的照射宽度（即光阑宽度，单位：mm，记为 w），使用以下公式计算 VIrr（单位：µL）： 
		VIrr = π(d/2)2w</li>
		<li>根据以下公式计算所需流速（单位：µL/min）： 
		流速 = 60R[VIrr (1 + FEx)]</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. FPOP 蛋白质溶液的制备
<ol>
	<li>为检测构象变化，准备两种或多种不同条件下的蛋白质样品（例如：配体结合态与无配体态；聚集体与单体；单独存在与存在蛋白质-蛋白质结合伴侣等）。</li>
	<li>根据实验需求设定FPOP所用总体积。最小体积通常取决于照射毛细管的体积以及质谱检测和相对定量所需的样品量，具体数值主要受所用LC-MS/MS系统及标记后样品处理方法的影响。本课题组常用的FPOP溶液总体积为加入过氧化氢后的20 µL。蛋白质终浓度通常为1–10 µM，并含有17 mM谷氨酰胺（用于限制羟基自由基寿命）、1 mM腺嘌呤（作为自由基剂量指示剂）13,17 和10 mM磷酸盐缓冲液（一种对羟基自由基清除能力较弱的缓冲体系）。通常需制备多个重复样品，以便对结果进行统计学建模。
	<ol>
		<li>一般情况下，每种状态至少制备三份重复样品，并额外准备至少一份不照射激光的对照样品，用于测定背景氧化水平。该FPOP溶液混合物准备18 µL。 
		注意：生物化学实验中常用的许多缓冲液和添加剂均为羟基自由基清除剂。这些缓冲液和添加剂可以使用，但可能因缓冲液对羟基自由基的清除作用而导致氧化程度降低。通常建议将所有添加剂控制在生物体系所需的最低水平，以最大化蛋白质氧化产率。应避免使用二甲基亚砜，因其易产生次级自由基；本实验室实践中发现二甲基甲酰胺是一个有效的替代选择。当使用强效羟基自由基清除型缓冲液时，FPOP溶液混合物中通常可省略谷氨酰胺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在FPOP实验前立即配制1 M过氧化氢溶液。 
	注意：供应商通常出售的30%过氧化氢含有稳定剂，可延长其保存期限。稀释后的过氧化氢应尽快使用，务必在同一天内完成使用。还应定期通过FPOP实验结合羟基自由基剂量指示剂检测过氧化氢是否发生分解。</li>
	<li>准备含有25 µL淬灭溶液的微量离心管，其中包含0.5 µg/µL甲硫氨酸酰胺和0.5 µg/µL过氧化氢酶。若FPOP所用样品体积超过20 µL，则应按比例增加淬灭溶液体积。</li>
</ol>
3. 进行FPOP实验
<ol>
	<li>在18 µL的FPOP溶液混合物中加入2 µL过氧化氢。用移液器轻轻混匀内容物，并迅速离心使溶液沉降至微量离心管底部。立即使用气密性注射器收集，并装入注射泵中。</li>
	<li>通过点击剂量计软件上的启动泵按钮，以步骤1.8.1中确定的流速（通常为8–16 µL/min）启动注射泵的流动。</li>
	<li>使用在线剂量计（见材料表）监测实时腺嘌呤读数，并将样品收集至废液中。等待Abs265信号稳定。</li>
	<li>在剂量计软件中点击启动闪光按钮，以预设的重复频率和能量开始激发激光。</li>
	<li>使用在线剂量计监测实时腺嘌呤读数（见材料表）；激光关闭与激光开启时Abs265的差值即为ΔAbs265读数。 
	注意：在过氧化氢存在下激发激光时，若Abs265读数出现高度不稳定，是由于溶液中产生气泡所致。可通过降低激光能量密度和/或过氧化氢浓度以消除气泡。</li>
</ol>
4. 进行补偿
注意：不同的配体、缓冲液等对羟基自由基的清除能力可能不同。必须确保不同样品中可用于与蛋白质反应的有效羟基自由基剂量具有可比性。这可通过确保各样品间羟基自由基剂量计响应一致来实现。采用腺嘌呤作为剂量计时，265 nm 处紫外吸光度的变化（ΔAbs265）反映有效羟基自由基剂量；ΔAbs265 越大，表示有效羟基自由基剂量越高。
<ol>
	<li>将在线剂量计测得的 ΔAbs265 读数与先前实验或对照组获得的目标 ΔAbs265 读数进行比较。若 ΔAbs265 读数低于目标值，表明羟基自由基的有效剂量不足；若 ΔAbs265 读数高于目标值，则表明有效自由基剂量过高。如果 ΔAbs265 读数已达到目标水平，则在激光照射后立即用淬灭缓冲液收集样品17。</li>
	<li>调节有效自由基剂量，使其对应的 ΔAbs265 读数与目标值一致。该调节可通过以下三种方式实现：改变过氧化氢浓度、通过调节激光脉冲能量来增加激光注量，或通过改变聚焦透镜的焦平面位置来增加激光注量。
	<ol>
		<li>若需对 ΔAbs265 读数进行较大调整（>10 mAU），则重新配制含更高或更低浓度过氧化氢的样品，并按照第 3 节所述重新运行样品。</li>
		<li>若需在实时过程中对 ΔAbs265 读数进行微调，可通过 50 mm 电动平移台调节聚焦透镜的位置，从而改变入射光束的焦平面。将焦平面移近毛细管位置会提高 ΔAbs265 读数；将焦平面远离毛细管位置则会降低 ΔAbs265 读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测腺嘌呤的 ΔAbs265，以测定激光照射后样品中羟基自由基的实际有效量13。使用在线紫外毛细管检测器进行实时监测，可实现如 4.2.2 所述的实时调节；通过电动平移台调节透镜位置，直至 ΔAbs265 读数等于目标值。实验后的紫外分光光度计吸光度测量同样准确，但每种有效自由基剂量均需使用新的样品。</li>
</ol>
5. 消化蛋白质样品
注意：胰蛋白酶最常用于FPOP中蛋白质样品的消化，本方案中使用的也是该种蛋白酶。它是一种可靠的蛋白酶，可生成在N端和C端均含有碱性位点的肽段，有助于在质谱中形成多电荷肽离子。此外，它在赖氨酸和精氨酸之后发生切割，而这两种氨基酸对羟基自由基的反应性仅为中等水平；因此，由于分析物氧化而导致消化模式改变的情况较为罕见。其他蛋白酶也已成功应用于FPOP21，但需注意确保未氧化样品与氧化样品之间的消化模式具有可比性。
<ol>
	<li>测定淬灭后FPOP样品的最终体积。在淬灭后的蛋白质溶液中加入500 mM Tris（pH 8.0）和10 mM CaCl2，其中含有50 mM二硫苏糖醇（DTT），使终浓度达到50 mM Tris、1 mM CaCl2和5 mM DTT。</li>
	<li>将蛋白质样品在95 °C加热15分钟。</li>
	<li>立即在冰上冷却样品2分钟。</li>
	<li>按1:20的胰蛋白酶/蛋白质质量比将胰蛋白酶加入样品中。</li>
	<li>在37 °C下振荡孵育过夜进行蛋白质消化。</li>
	<li>通过加入0.1%甲酸和/或在95 °C加热10分钟终止消化反应。</li>
	<li>在LC-MS/MS分析前立即向样品中加入2 mM DTT，并在60 °C加热15分钟。 
	注意：尽管其他研究组已报道在FPOP实验中对巯基进行烷基化处理，但在我们的实验中发现，氧化蛋白质在烷基化过程中会产生副产物（可能是由于与氧化副产物中的亲核性羰基发生反应所致）。因此，我们选择尽可能避免对巯基进行烷基化处理。</li>
</ol>
6. 进行液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
<ol>
	<li>制备流动相A，包含含0.1%甲酸的水溶液，以及流动相B，包含含0.1%甲酸的乙腈溶液。</li>
	<li>首先将样品加载到 C18 捕获柱上（300 µm 内径 x 5 毫米，100 Å 孔径 5 µm 粒径）捕获柱，并以2% 溶剂B在3分钟内以指定流速冲洗 5.0 µL/min 以去除盐类和亲水性小分子。</li>
	<li>然后在C18纳米柱（0.75 mm × 150 mm）上分离肽段 2 µm 粒径，100 Å 孔径）上，流速为 300 nL/min。梯度洗脱程序包括：在 22 分钟内，溶剂 B 从 2% 线性增加至 35%；随后在 5 分钟内升至 95% 溶剂 B，并保持 3 分钟以清洗色谱柱；然后在 3 分钟内返回至 2% 溶剂 B，并保持 9 分钟以重新平衡色谱柱。 
	注意：该梯度适用于大多数旨在进行肽段水平定量的一蛋白和二蛋白 FPOP 混合物的 LC-MS/MS 分析。在极少数情况下，若因肽段保留时间与 m/z 值相近而产生相互干扰，可能需要调整溶剂 B 的百分比以提高肽段分辨率。蛋白质组规模 FPOP22 或旨在分离肽氧化产物异构体的实验设计1,23,24,25 可能需要更长的液相色谱梯度，超出了本报告的范围。</li>
	<li>使用导电纳米喷雾发射器，将肽段直接洗脱至高分辨率质谱仪的纳米喷雾离子源中。</li>
	<li>在正离子模式下采集数据。喷雾电压设为2400 V，离子传输管温度设为 300 °C.</li>
	<li>在 m/z 250 至 2000 范围内以标称分辨率采集完整的质谱扫描 m/z 在200个60,000分辨率下进行一次全扫描，随后对丰度最高的前八个肽段离子进行八次依赖于数据的线性离子阱串联质谱（MS/MS）扫描，采用35%归一化碰撞能量的碰撞诱导解离以鉴定肽段。在30秒内对同一肽段最多碎裂五次，随后将其加入排除列表60秒。</li>
</ol>
7. 肽段平均氧化程度的数据处理与计算
<ol>
	<li>使用 MS/MS 蛋白质组学搜索引擎确定蛋白质的序列覆盖率、未氧化肽段的 m/z 值及其保留时间。</li>
	<li>将前体离子质量容差设为 10 ppm，对于胰蛋白酶消化的样品，允许最多两个漏切位点，并采用标准的胰蛋白酶切割特异性。</li>
	<li>将肽段碎片离子的质量容差设为 0.4 道尔顿。</li>
	<li>根据检测到的未修饰肽段的 m/z 比值以及主要氧化产物的已知质量偏移，计算每种肽段各种理论氧化产物的 m/z 值4,26,27,28,29。</li>
	<li>使用质谱运行数据分析软件识别这些 m/z 值对应的提取离子色谱图（图 4）。根据其 m/z 值、电荷态以及与未修饰肽段洗脱时间的相似性，鉴定肽段氧化产物。在本实验室条件下，使用上述液相梯度时，肽段氧化产物的洗脱时间通常比未修饰肽段早 240 秒至晚 180 秒。由于氧化常产生多个异构体氧化产物，因此在肽段氧化产物的提取离子色谱图中常可观察到多个部分分离的峰，如 图 4 所示。肽段氧化产物的定量基于提取离子色谱图中峰面积的积分。</li>
</ol>
<img alt="气相色谱-质谱图；示意图；显示氧化过程；M、M+16、M+32峰；时间 vs 相对丰度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：肽段及其在FPOP后氧化产物的提取离子色谱图。肽段氧化产物的m/z值基于未氧化肽段的m/z值及已知的氧化产物进行计算；并据此确定这些肽段产物的峰面积。随后利用肽段产物的峰面积计算每个肽段的平均氧化事件数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>使用以下公式计算肽的平均氧化程度。</li>
</ol>
<img alt="化学氧化态公式；P = [(单次氧化) X1 + (双次氧化) X2...]." src="/files/ftp_upload/61580/61580equ01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1">
其中，P 表示每个肽分子的平均氧化事件数，I 表示未氧化肽（Iunoxidized）以及发生 n 次氧化事件的肽的峰面积。需要注意的是，I(单次氧化) 不仅包括单个氧原子的加成，还包括研究者可能选择检测的其他较罕见的单次氧化事件（例如氧化脱羧、羰基形成等）4,26,27,28,29。

Joshua S. Sharp 披露其在 GenNext Technologies, Inc. 拥有重大经济利益，这是一家致力于包括羟基自由基蛋白质足迹分析在内的蛋白质高级结构分析技术商业化的小型公司。

基于质谱的结构分析技术，包括氢-氘交换、化学交联、共价标记以及原位喷雾质谱和离子淌度，因其灵活性、高灵敏度以及处理复杂混合物的能力而迅速受到广泛关注。FPOP（快速光氧化标记）具备多项优势，使其在基于质谱的结构分析技术领域中日益流行。与大多数共价标记策略类似，FPOP可提供蛋白质拓扑结构的稳定化学快照，且兼容大多数标记后处理步骤（如胰蛋白酶消化、去糖基化等），从而避免了氢-氘交换中常见的回交和 scrambling 问题。然而，与仅靶向特定氨基酸的传统共价标记技术不同，FPOP能够在单次实验中对多种氨基酸进行广泛标记。此外，FPOP的羟基自由基与蛋白质的主要反应速度比蛋白质解折叠的速度更快，因此能够“冻结”蛋白质天然构象的化学快照14，尽管部分次级反应可能在较慢的时间尺度上发生20,31,32。与早期利用X射线同步辐射光束线进行的羟基自由基蛋白质足迹分析实验不同，FPOP可在台式设备上实现超快速标记<su...

快速蛋白质光化学氧化（FPOP）是一种新兴技术，通过超快速共价修饰蛋白质的溶剂可及表面区域，随后结合液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测，用于测定蛋白质拓扑结构的变化1。FPOP利用紫外激光脉冲光解过氧化氢，在原位产生高浓度的羟基自由基。这些羟基自由基具有极高的反应活性且寿命极短，在FPOP条件下通常在微秒时间尺度内即被消耗2。羟基自由基在水中扩散，并以一般从快速（约106 M-1 s-1）到扩散控制速率的动力学与溶液中的多种有机组分发生氧化反应3。当羟基自由基遇到蛋白质表面时，会氧化蛋白质表面的氨基酸侧链，导致该氨基酸发生质量偏移（最常见的是净增加一个氧原子）4。任一氨基酸位点的氧化反应速率取决于两个因素：该氨基酸固有的反应活性（取决于其侧链结构及序列环境）4,5，以及该侧链对扩散中羟基自由基的可及性，后者与平均溶剂可及表面积密切相关6,7。在FPOP实验中，除甘氨酸外的所有标准氨基酸均已被观察到可被这些高活性羟基自由基标记，但标记产率差异较大；在实际操作中，丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、天冬酰胺（Asn）和丙氨酸（Ala）通常仅在高自由基剂量条件下才被氧化，并需通过精细且灵敏的靶向电子转移解离（ETD）碎裂技术才能鉴定8,9。氧化反应完成后，样品需进行淬灭处理，以去除过氧化氢及次级氧化剂（如超氧阴离子、单线态氧、肽基过氧化氢等）。淬灭后的样品经蛋白酶解消化，生成一系列氧化肽段混合物，其中蛋白质的结构信息以氧化产物分布模式的形式被固定为化学“快照”（图1）。采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）检测特定蛋白酶解肽段中氨基酸的氧化程度，依据氧化与未氧化肽段的相对峰强度进行定量分析。通过比较同一蛋白质在不同构象状态（例如配体结合态与无配体态）下所获得的氧化足迹，可将特定区域氧化程度的差异直接关联至该区域溶剂可及表面积的变化6,7。FPOP能够提供蛋白质拓扑结构信息，因此在蛋白质高阶结构解析中具有重要应用价值，尤其适用于蛋白质治疗药物的发现与开发过程10,11。
<img alt="蛋白质氧化过程、LC-MS/MS结果；蛋白质结构、氧化位点；质谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：FPOP 概述。 蛋白质表面被高活性的羟基自由基共价修饰。羟基自由基与蛋白质氨基酸侧链的反应速率受侧链溶剂可及性的显著影响。拓扑结构的变化（例如，如上图所示的配体结合）会保护相互作用区域内的氨基酸不与羟基自由基反应，从而导致LC-MS信号中修饰肽段强度的降低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
FPOP 溶液中的不同组分（例如配体、辅料、缓冲液）对激光光解过氧化氢产生的羟基自由基具有不同的清除活性3。同样，过氧化氢浓度、激光通量以及缓冲液组成的微小变化都可能改变有效的自由基剂量，导致在不同样品之间以及不同实验室之间难以重复 FPOP 数据。因此，使用若干种可用的羟基自由基剂量计之一来比较每个样品中可用于与蛋白质反应的羟基自由基剂量显得尤为重要12,13,14,15,16。羟基自由基剂量计通过与分析物（以及溶液中所有自由基清除剂）竞争羟基自由基池来发挥作用；通过测定剂量计的氧化量来测量羟基自由基的有效剂量。需要注意的是，“有效的羟基自由基剂量”取决于生成的羟基自由基初始浓度及其半衰期。这两个参数部分相互依赖，使得理论动力学建模较为复杂（图2）。两个样品可能具有截然不同的初始自由基半衰期，但通过调节生成的羟基自由基初始浓度，仍可维持相同的有效自由基剂量；在这种情况下，它们仍将产生相同的氧化足迹17。腺嘌呤13和 Tris12是方便的羟基自由基剂量计，因为它们的氧化水平可通过紫外光谱法实时测定，使研究人员能够快速识别有效羟基自由基剂量是否存在问题，并及时排查故障。为解决这一问题，在流动系统中辐照位点之后直接设置一个在线剂量计，用于实时监测腺嘌呤吸光度变化所产生的信号，具有重要意义。这有助于在羟基自由基清除能力差异较大的缓冲液或其他辅料中顺利开展 FPOP 实验17。这种自由基剂量补偿可实时进行，通过调节有效自由基剂量，对同一构象体可获得统计学上无显著差异的结果。
在本实验方案中，我们详细描述了使用腺嘌呤作为内部光学自由基剂量计进行自由基剂量补偿的典型FPOP实验操作步骤。该方法通过实时补偿，使研究人员能够比较不同清除能力条件下的FPOP足迹结果。
<img alt="氧化剂量计与蛋白质中羟基反应的动力学分析图；时间-浓度结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：基于剂量测定的补偿动力学模拟。 1 mM 腺嘌呤剂量计的响应被测量于 5 µM 溶菌酶分析物与1 mM初始浓度的羟基自由基（▪OH） t1/2=53 ns），并设为目标剂量计响应（黑色）。加入1 mM的清除剂辅料组氨酸后，剂量计响应（蓝色）与蛋白质氧化量均呈比例下降（青色）。羟基自由基的半衰期也随之缩短（▪OH） t1/2=39 ns）。当增加生成的羟基自由基量，使得在含有1 mM组氨酸清除剂的样品中氧化剂量计的产率与无清除剂条件下1 mM羟基自由基所产生的相当（红色）时，所发生的蛋白质氧化量也相应地变得相同（洋红色），而羟基自由基的半衰期则进一步缩短（▪OH） t1/2=29 纳秒）。经 Sharp J.S. 许可转载自 美国制药评论 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>腺嘌呤</td><td>Acros Organics</td><td>147440250</td><td>溶于水，最高溶解度达 3.5 mM</td></tr><tr><td>光阑</td><td>Edmund Optics</td><td>39-905</td><td>1000 &amp;mu;m 光阑直径，镀金铜质光阑</td></tr><tr><td>光阑支架</td><td>Edmund Optics</td><td>53-287</td><td>25.8 mm 外径，精密针孔安装座</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-40</td><td>牛肝来源过氧化氢酶，冻干粉末，&amp;ge;10,000 单位/毫克蛋白</td></tr><tr><td>COMPex Pro 激光器</td><td>Coherent</td><td>1113836</td><td>COMPexPRO 102，F-V 版本，KrF 激光器，无 XeCl</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td>DTT，分子生物学级（DL-二硫苏糖醇）</td></tr><tr><td>自动馏分收集器</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>自动化馏分收集器</td></tr><tr><td>熔融石英毛细管</td><td>Molex</td><td>1068150023</td><td>Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 100 &amp;micro;m，外径 375 &amp;micro;m，型号 TSP100375</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Acros Organics</td><td>119951000</td><td>L(+)-谷氨酰胺，99%</td></tr><tr><td>透镜支架</td><td>Edmund Optics</td><td>03-668</td><td>53 mm 外径，三螺钉可调环形安装座</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>过氧化氢，30%（ACS 认证级），Fisher Chemical</td></tr><tr><td>LC-MS/MS 系统</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>Dionex Ultimate 3000 联用 Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪</td></tr><tr><td>质谱级乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td>乙腈，Optima LC/MS 级，Fisher Chemical</td></tr><tr><td>质谱级甲酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>甲酸，99.0+%，Optima&amp;trade; LC/MS 级，Fisher Chemical</td></tr><tr><td>质谱级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>水，Optima LC/MS 级，Fisher Chemical</td></tr><tr><td>MES 缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0164</td><td>MES 半钠盐</td></tr><tr><td>甲硫氨酸酰胺</td><td>Bachem</td><td>4000594.0005</td><td>H-met-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.HCl</td></tr><tr><td>微型 V 型夹具</td><td>Thor Labs</td><td>VK250</td><td>带不锈钢刀片的微型 V 型夹具</td></tr><tr><td>电动平移台</td><td>Edmund Optics</td><td>68-638</td><td>50 mm 行程电动平移台系统，带手动控制</td></tr><tr><td>Nano C18 色谱柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>164534</td><td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱</td></tr><tr><td>光学平台</td><td>Edmund Optics</td><td>56-935</td><td>18&quot; × 18&quot; 光学面包板</td></tr><tr><td>Pioneer FPOP 模块系统</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>在线 FPOP 自由基剂量测定系统</td></tr><tr><td>支架杆</td><td>Edmund Optics</td><td>58-979</td><td>3&quot; 长，&amp;frac14;-20 螺纹，支架杆</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP331-500</td><td>七水合磷酸氢二钠（无色至白色晶体），Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-500</td><td>一水合磷酸二氢钠（无色至白色晶体），Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>81065</td><td>100 &amp;micro;L，型号 1710 RN SYR，小型可拆卸针头，22s 规格，2 英寸，3 型针尖</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>788101</td><td>Legato&amp;nbsp;101 注射泵</td></tr><tr><td>捕获 C18 色谱柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>测序级修饰型胰蛋白酶</td></tr><tr><td>紫外平凸透镜</td><td>Edmund Optics</td><td>84-285</td><td>30 mm 直径 × 120 mm 焦距，未镀膜紫外平凸透镜</td></tr></tbody></table>

实现快速蛋白质光化学氧化中实时校正以确定蛋白质拓扑结构变化

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

快速蛋白质光化学氧化（FPOP）是一种基于质谱的结构生物学技术，用于探测蛋白质的溶剂可及表面积。该技术依赖于氨基酸侧链与在溶液中自由扩散的羟基自由基发生反应。FPOP通过激光光解过氧化氢在原位产生这些自由基，从而形成瞬时的羟基自由基爆发，其衰减时间在微秒量级。当这些羟基自由基与溶剂可及的氨基酸侧链反应时，反应产物会产生可被质谱检测并定量的质量偏移。由于氨基酸的反应速率部分取决于该氨基酸平均的溶剂可及表面积，因此对蛋白质特定区域氧化程度的测量变化可直接关联到该区域在不同构象间溶剂可及性的变化（例如，配体结合态与无配体态、单体与聚集体等）。FPOP已应用于多个生物学问题的研究中，包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质构象变化以及蛋白质-配体结合。由于FPOP实验中羟基自由基的有效浓度受多种实验条件影响，因此监测蛋白质分析物所暴露的自由基有效剂量至关重要。这一监测可通过集成在线剂量计来高效实现，即通过实时测量FPOP反应信号并动态调节激光通量，以达到预期的氧化程度。借助这种补偿机制，即使使用相对较少的样品量，也能在异质样品中确定反映构象变化、配体结合表面和/或蛋白质-蛋白质相互作用界面的蛋白质拓扑结构变化。

在磷酸盐缓冲液中以及在55 °C下加热1小时后，阿达木单抗生物类似药的重链肽图谱比较显示出有趣的结果。采用学生t检验来鉴定在这两种条件下发生显著变化的肽段（p ≤ 0.05）。当蛋白质被加热形成聚集体时，肽段20-38、99-125、215-222、223-252、260-278、376-413和414-420表现出对溶剂的显著保护作用（图5）30。该实验鉴定了在加热和聚集过程中发生拓扑结构变化的肽段区域。
<img alt="多肽氧化比较，柱状图；多肽位置与平均氧化水平，实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：阿达木单抗重链的多肽水平足迹。阿达木单抗在室温下（蓝色）以...

蛋白质的快速光化学氧化是一种新兴的蛋白质结构表征技术。不同的溶剂添加剂和配体具有各异的羟基自由基清除特性。为了比较不同条件下的蛋白质结构，需要对反应中产生的羟基自由基进行实时校正，以标准化反应条件。

快速蛋白质光化学氧化（FPOP）是一种基于质谱的结构生物学技术，用于探测蛋白质的溶剂可及表面积……

该方法可促进蛋白质构象及蛋白质相互作用的测定。缓冲液组成、样品纯度和蛋白质浓度要求较为灵活，使该方法能够解决具有挑战性的结构问题。该技术可在多种不同的缓冲体系中实现样品的浓缩。利用我们的剂量测定方法，研究人员可以实时监测标记反应的进行情况。该技术的一个应用领域是药物开发，因为它使研究人员能够测试差异较大的药物配方及其对蛋白质结构的影响。准备FPOP光学平台。首先打开激光器，并将激光器设置为外部触发、恒定能量模式，且不进行气体更换。当激光器预热完成后，将每次脉冲的激光能量设置在每脉冲80至120毫焦之间，并使用丁烷喷灯轻轻灼烧毛细管上的聚酰亚胺涂层，灼烧位置应位于在线剂量计将在激光照射后于265纳米处读取吸光信号的位置。使用无尘擦拭布和甲醇轻轻擦拭毛细管上的残留物，然后将清洁后的毛细管穿过激光光路并插入在线剂量计中。按下在线剂量计顶部的杠杆以打开铰链，并取下磁性固定夹。使用磁性固定夹将毛细管放置在在线剂量计的仪器槽内，以保持毛细管位置固定，然后合上剂量计的铰链，压紧铰链直至杠杆锁定到位。在剂量测定软件中点击“开始闪光”按钮以启动准分子激光器，并在剂量测定软件中将预设重复频率设置为10至20赫兹，同时激光发射时移动电动载物台使其完成整个运动范围，确保光束始终居中于孔径，并在整个过程中可观察到毛细管的轮廓。然后以每分钟20 µL的流速用水冲洗毛细管至少一分钟，并在剂量计软件中点击“开始数据采集”和“自动归零”，使剂量计在开始数据采集前对水进行归零。进行FPOP实验时，将2 µL过氧化氢加入18 µL的FPOP溶液中，用移液器轻轻混合，通过离心迅速收集管底溶液，并立即使用气密注射器将溶液装入注射泵。在剂量计软件中点击“启动泵”和“开始数据采集”，以设定的流速启动注射泵流动，同时使用在线剂量计监测腺嘌呤的实时读数，直至265 nm处的吸光信号稳定，并将样品收集至废液容器中。要开始以预设的重复频率和能量发射激光，请点击剂量计软件中的“开始闪光”按钮，并使用内置剂量计监测实时的腺嘌呤读数。激光关闭与激光开启时在265纳米处吸光度的差值，即为265纳米处的吸光度变化读数。为确保不同样品间有可比量的羟基自由基可用于与蛋白质反应。将在线剂量计测得的265纳米处的吸光度变化值，与先前实验或对照组获得的目标265纳米吸光度变化值进行比较。若读数达到目标水平，则在激光或辐射处理后立即用淬灭缓冲液收集样品。为使有效自由基剂量一致以匹配吸光度读数，可通过调整过氧化氢浓度、改变每脉冲激光能量，或调节聚焦透镜的焦平面以提高激光注量。若要使差分吸光度读数的变化大于10毫吸光度单位，请使用更多或更少的过氧化氢重新制备样品，并按演示方法重新运行样品。若要在实时测量中对吸光度读数进行微小调整，可使用50毫米电动载物台调节聚焦透镜的位置，从而调整入射光束的焦平面。为了测量激光辐照后样品中羟基自由基的有效含量，需使用在线紫外毛细管检测器实时监测腺嘌呤在265纳米处的差分吸光度，并通过电动载物台调节透镜位置，直至265纳米处的差分吸光度读数达到预期值。阿达木单抗生物类似药在磷酸盐缓冲液中及其在55摄氏度加热一小时后的重链肽段足迹比较显示，当蛋白质加热形成聚集体时，所示肽段区域对溶剂表现出显著的保护作用。通过在线剂量计实时监测激光或辐射前后腺苷吸收物的差异，结果表明，在MES缓冲液中观察到的腺苷吸收物水平变化与磷酸盐缓冲液中相当。然而，肽段的平均氧化水平在MES缓冲液中低于磷酸盐缓冲液。然而，当增加激光通量以获得相等的腺嘌呤剂量测定响应时，FPOP处理后肽段在MES缓冲液和磷酸盐缓冲液中的平均氧化值几乎相同。由于剂量测定读数受激光通量、过氧化氢浓度以及自由基清除剂的影响，需注意确保样品间的剂量测定响应接近一致。定点突变常用于研究在FPOP中受到保护的位点。这使得研究人员能够确定这些变化是否由Alistair引起。该技术有助于比较不同缓冲液或配方中的蛋白质，使研究人员能够确定不同添加剂对蛋白质构象的影响。

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生物化学

实现蛋白质快速光化学氧化的实时补偿，用于确定蛋白质地形变化

本视频介绍了利用标记有供体和受体荧光基团的特异性抗体，通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测法来测定内源性蛋白质磷酸化水平。该技术旨在检测细胞裂解液中目标蛋白的磷酸化状态。...

时间分辨福斯特共振能量转移法用于监测细胞内蛋白质磷酸化

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。...

荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

蛋白质功能的关键步骤，特别是主链构象变化和质子转移反应，通常发生在微秒到毫秒的时间尺度上。这些动力学过程可以通过时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱技术进行研究，尤其适用于其功能由光触发的蛋白质。...

利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

本文介绍了一种获取三色单分子FRET数据并利用三维系综隐马尔可夫模型进行分析的实验方案。通过该方法，科研人员可以从复杂的蛋白质系统中提取动力学信息，包括协同效应或相关联的相互作用。...

利用三色单分子FRET研究蛋白质相互作用的相关性

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无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文利用一种称为细胞内快速光化学蛋白质氧化（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术，在活细胞中表征蛋白质结构及相互作用位点。...

利用细胞内快速光化学氧化蛋白质法表征细胞蛋白质

本方案介绍了一种利用在线自由基剂量测定和等离子体光源进行闪光氧化蛋白质足迹分析的方法。该方法取代了具有潜在危险的紫外激光，从而简化了蛋白质快速光化学氧化研究的操作，并提高了其实验重复性。...

无需激光的羟基自由基蛋白质足迹法用于蛋白质高级结构分析

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带有可移动XY载物台的培养箱平台：一种用于细胞内快速光化学蛋白质氧化的新平台

蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。...

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

本文介绍了一种利用宽场荧光显微镜对基于移动单分子荧光共振能量转移（smFRET）探针进行时空分析的方法。新开发的软件工具包能够确定运动探针的smFRET时间轨迹，包括随时间变化的准确FRET效率和分子位置。...

自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

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