荧光染料标记脂质体的体内组织特异性细胞摄取的制备、给药与评估

本方案结合了一种简便的制备载药脂质体的方法与全面评估细胞水平脂质体摄取的策略。该技术提供了一种无偏倚的方法，用于评估采用低温条件和易获取设备制备的荧光标记脂质体的摄取情况。为制备负载乙酸钙和tesaglitazar的荧光标记脂质体，首先使用半英寸探头在室温、20千赫兹、50%功率条件下超声30秒，将脂质的乙醚-氯仿溶液进行乳化。

立即将均质化的水和油乳液转移至配备特殊接头、纳米计和压力调节阀的旋转蒸发仪中，并将蒸发仪连接至真空管线。为去除有机溶剂，将旋转速率设为100转/分钟，真空度设为0.5个大气压。当凝胶形成并消失后，将真空度提高至0.9个大气压，然后使用配备两个气密注射器的脂质体挤出器，将脂质体水相分散液反复通过200纳米孔径的聚碳酸酯滤膜多次过滤。

通过动态光散射验证粒径分布后，使用2毫升离心柱去除脂质体中未包封的tesaglitazar，并用分光光度计测定包封药物的浓度。然后，将不超过500微升的脂质体样品加入干燥的柱层析凝胶床中。若需通过眶后注射给予脂质体，应轻轻按压暴露的眼睛上下方的皮肤，使眼球突出于面部平面之上。

然后小心地将针头尖端插入小鼠眼睛的前角处，确保针头位于眼眶下方且不接触眼眶，缓慢将脂质体注射到眶后腔。为采集血液样本，在适当的实验终点，小心地在小鼠肋骨后端边缘的皮肤处做一切口，并沿直线向上朝动物头部方向剪开约1厘米，直至暴露胸肌。在初始切口位置，做两个垂直于原切口线的小切口，朝向头部方向，然后小心地将暴露区域肋骨一侧的胸肌剪除，以便更好地接近并观察针头插入部位。

将针头插入第三和第四肋骨之间，尽量靠近肋骨中线，轻轻拉动注射器以开始采集血液。当采集到尽可能多的血液后，将血液转移至含有10微升0.5摩尔EDTA并置于冰上的微量离心管中。为提取小鼠两侧的腹股沟后组织垫，用一把镊子夹住腹膜右侧，另一把镊子夹住腹膜上方皮肤边缘。

轻轻将皮肤从膜上拉开，以分离各层组织。固定皮肤外缘，以便更好地暴露脂肪组织区域，并沿皮肤寻找腹股沟脂肪组织库。使用镊子和剪刀定位位于脂肪组织库中央的腹股沟淋巴结，并根据需要将其取出。

切除淋巴结后，用镊子小心夹住靠近固定点的脂肪组织末端，开始在脂肪组织与皮肤之间的结缔膜处进行小切口。在切割的同时将脂肪组织从皮肤上抬起，以更清楚地暴露结缔膜，随后将该脂肪组织置于含有冰上预冷HEPES缓冲液的聚乙烯小管中。为从腹腔尾端分离附睾脂肪组织，可用镊子轻轻从鼠体背部末端拉出第一个附睾脂肪组织，并辨认附着于该组织上的附睾及输精管。

然后小心地在脂肪组织库与附睾及输精管之间进行切割，将脂肪组织与其他组织分离，并将分离出的脂肪组织置于含有HEPES缓冲液的聚乙烯小瓶中，冰上保存。当所有组织均采集完毕后，使用一至两把剪刀将脂肪组织样本剪切成约0.5毫米大小的组织碎片。接着，向含有脂肪组织碎片的小瓶中加入1.5毫升浓度为2毫克/毫升的胶原酶缓冲液，将小瓶放入37°C、150转/分钟的振荡培养箱中消化30至45分钟。

30分钟后，使用1 mL移液器将样品反复吹打数次。如果组织块仍然过大而不易移液，需将样品放回培养箱中继续孵育15分钟。待样品完全消化后，再将组织碎片吹打10次，以确保形成单细胞悬液，并将每份样品分别经70 µm细胞滤网过滤至一个50 mL离心管中，每份样品使用一个独立的滤网。

用 5 毫升 FACS 缓冲液冲洗每根离心管，以收集残留的细胞，并将每次洗涤液过滤至相应装有细胞样品的冰上离心管中。所有样品过滤完成后，通过离心收集细胞，并吸除样品中的脂肪细胞上清液。接下来，小心吸除上清液，保留基质血管组分沉淀完整，然后将沉淀物重悬于每管 1 毫升 FACS 缓冲液中。

然后将悬浮液转移至冰上的新的1.5或1.7毫升离心管中，直至按照标准方案进行流式细胞术分析。动态光散射显示脂质体平均直径为163.2纳米，泽塔电位为-19.2毫伏。冷冻电子显微镜成像显示脂质体呈圆形结构，其直径的标准偏差相对较小，与动态光散射测得的平均直径一致。

以PBS处理小鼠的样本进行流式细胞术分析，可作为DiD荧光减一对照，用于建立DiD阳性门控。如本代表性分析所示，10 毫克/毫升的DiD脂质体加载浓度过高，在所检测的三种组织中均超出流式细胞仪的可定量范围。0.1 毫克/毫升的浓度显示出部分信号，但未观察到明显区别于PBS处理细胞的细胞群。

因此，建议在脂质体的制备中使用每毫升一毫克的浓度，该浓度既能与PBS对照组表现出明显差异，又可被分析仪准确读取。每种组织类型需要略微不同的设门策略，但大多数相同的细胞类型在各类组织中均可被识别。一旦确定了特定的目标细胞群体，即可定量分析每个细胞群体的总大小及其DiD阳性细胞所占频率。

准备试剂和设备，并预判每一步的预期结果至关重要。早期出现意外结果可能会影响后续实验的成败。组织学方法可用于评估脂质体在完整组织内的定位，而成像流式细胞术则可用于在单细胞水平上验证脂质体的内化情况。