Name: 荧光染料标记脂质体体内组织特异性细胞摄取的制备、给药和评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习制备荧光标记脂质体并评估其体内细胞摄取的方法，采用超声乳化、旋转蒸发和流式细胞术技术，为药物递送和细胞生物学研究提供可重复的实验方案。

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作者谨此感谢 Michael Solga 及流式细胞术核心实验室的其他工作人员提供的流式细胞术培训与技术支持。作者还感谢 Shiva Sai Krishna Dasa、Dustin K. Bauknight、Melissa A. Marshall、James C. Garmey、Chantel McSkimming、Aditi Upadhye 和 Prasad Srikakulapu 在脂质体的制备（SSKD、DKB）、组织收获（MAM、JCG）以及流式细胞术染色与样本采集（AU、PS、CM）方面提供的协助。本研究得到了阿斯利康公司、R01HL 136098、R01HL 141123 和 R01HL 148109 项目、美国心脏协会 16PRE30770007 项目以及 T32 HL007284 奖学金的资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一个三部分实验方案：（i）制备负载抗糖尿病药物tesaglitazar并标记荧光脂质染料的脂质体；（ii）通过小鼠眶后静脉注射给予脂质体；（iii）采集、处理并染色组织，通过流式细胞术在细胞水平检测脂质体的摄取情况。本方案概述了约150 µm脂质体的制备及其在脂肪组织、血液和脾脏中摄取情况的评估。该脂质体制备方法可放大生产，主要在室温下操作，并采用反相蒸发法以最大化药物包封率并去除有机溶剂。使用本方案，纯化后的脂质体样品中药物tesaglitazar浓度可达2 mg/mL。制备好的脂质体可在HEPES缓冲液中4 °C保存超过一年。根据我们的经验，其平均粒径变化极小。通过超滤法使用10 kDa离心滤膜将脂质体与游离药物分离后，紫外分光光度法检测显示药物含量损失低于10%。
在制备脂质体的过程中，有一些关键步骤和因素需要考虑。首先，操作流程的顺序至关重要，必须严格遵守。其次，在包载tesaglitazar时所使用的溶液pH值必须维持在7.4，以最大化其溶解度和有效包载效率。第三，设备和滤膜的正确组装可确保每一步骤的产物具有合适的粒径和纯度。例如，若100 nm和200 nm滤膜未正确组装，则可能导致脂质体批次粒径不均且不符合预期。第四，在药物包载前必须彻底去除乙酸钙，以最大化tesaglitazar向脂质体内的转移。为检测乙酸钙是否完全去除，可采用高速离心法去除脂质体后，测定非脂质体溶液中的乙酸钙水平。第五，记录并称量每一步骤中加入脂质体制备体系的所有物料质量至关重要，以确保能够准确计算浓度并维持所需物料比例。最后，若操作技术不当，可能导致过度的异质性。必须使用动态光散射（DLS）及其他方法（如电子显微镜）对这一参数进行充分检测。为提高均一性，可考虑调整所选滤膜孔径或串联使用两层滤膜。
此外，在全面开展本实验方案之前，必须提前规划并优化流式细胞术的对照和抗体组合（表1，表3）。应测试抗体以确保染色时使用了适当的浓度，并尽量减少荧光染料之间的重叠。在设计抗体组合时，还必须考虑脂质体制备过程中所用染料的激发和发射波长。在我们的实验结果中，使用了DiD染料，其激发和发射波长与别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC）和AlexaFluor 647等荧光染料相似。因此，我们在抗体组合中未选择与这些荧光染料偶联的抗体。此外，本实验方案未包含同型对照。原因是本方案所选用的抗体均为经过充分验证、商业可得的抗体。然而，如果计划使用此前未优化过的抗体，建议在开展完整实验前，先在目标组织上将该抗体与同型对照进行比对测试。
尽管本实验方案展示了如何从小鼠经处理后提取并处理血液、脾脏、腹股沟脂肪组织和附睾脂肪组织，但这一通用方法也可应用于其他组织。根据具体研究的组织类型，其处理与消化方案可能需要相应调整，相关方法已在以下组织中发表：肺21、肝22、腹膜腔3、骨髓3,23、脑24。
需要考虑的本方法的一个重要局限性是，每只动物只能在一个时间点评估摄取情况。因此，将本方案与其他非侵入性成像技术结合使用，或进行相应规划以确保有足够的资源完成评估，可能是有利的。细胞摄取的时间以及细胞更替是需要考虑的重要因素：脂质体在最初24小时内会在体内循环，而根据摄取脂质体的细胞的寿命或其对摄取的反应，可能发生细胞死亡或进一步的吞噬作用。我们之前的研究表明，在不同时间点，DiD+细胞群体的特征会发生变化3。因此，在较早的时间点或与所关注机制的生物学过程最相关的时间点评估摄取情况非常重要。此外，尽管本方案可用于对整个组织中的细胞摄取进行定量，但流式细胞术无法揭示摄取细胞在组织中的定位。将该方法与组织学技术相结合，有助于弥补这一局限性。
总体而言，本方案可作为组织学和全身体荧光成像等现有方法的补充。随着流式细胞术工具和方法的持续进步，构建更大规模的抗体组合以检测越来越特异的细胞亚群将成为可能。我们建议将本方案与上述方法联合使用，以更全面地评估细胞对颗粒的摄取情况，并提供通过流式细胞术验证实验结果的机会。例如，若流式细胞术结果显示脂肪组织中的大部分颗粒被巨噬细胞摄取，则可保留同一份脂肪组织的另一等分试样，进行免疫荧光分析：将其固定、切片并用巨噬细胞标志物染色，以确认该细胞类型确实能够摄取脂质体。该联合策略可增强纳米颗粒生物分布检测的严谨性：验证细胞特异性靶向性、量化细胞摄取水平、识别非靶向摄取现象，并有望为观察到的治疗效果提供机制性假说依据。本方案还可适用于未来的研究，例如使用不同类型的脂质体、探究其他组织中的摄取情况，或在肥胖症、代谢紊乱及其他适合采用纳米颗粒递送作为治疗策略的疾病背景下测试新化合物。

随着人们对开发基于纳米颗粒药物递送疗法的兴趣日益增长，制备和评估颗粒分布与摄取的方法也必须持续进步、拓展，并向科研界开放1,2。本实验方案旨在评估在体内给予装载了tesaglitazar（一种过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-α/γ激动剂）的DiD标记脂质体后，哪些确切的细胞类型摄取了这些脂质体3,4。通过这些研究，我们能够确定哪些细胞类型直接受到脂质体包裹的tesaglitazar治疗的影响，评估靶向基团的有效性，并提出假说以解释我们观察到的治疗结果。此外，已有研究表明多种细胞类型具有特定的生物学功能，提示巨噬细胞、树突状细胞以及肝脏特异性的库普弗细胞等吞噬性细胞会摄取大部分脂质体5,6,7。利用本方案，我们已证实非经典吞噬细胞同样能够摄取脂质体3,4。
本方案介绍了一种优化的tesaglitazar溶解方法，通过逆相蒸发法制备脂质体，并使用醋酸钙作为远程药物装载的吸引剂。所介绍的方法适用于大多数实验室，无需难以获取的材料，也不涉及高温操作步骤。该方案制备的脂质体粒径适合体内延长循环时间8。此外，正如Su等人总结的，迄今为止，针对脂质体在体内的分布及组织摄取的评估方法已得到深入研究和验证9。正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）和荧光分子断层成像（FMT）等技术已被用于定量分析组织特异性的生物分布与摄取情况9,10,11。尽管这些技术已优化以最大限度提高体内检测灵敏度，但仍缺乏在细胞分辨率水平上定量测定脂质体体内摄取的能力。本文所述方案旨在通过流式细胞术来满足这一需求。最后，在本方案中，细胞摄取的研究聚焦于少数几种组织，包括脂肪组织。目前已有越来越多的文献探讨纳米颗粒在肥胖、代谢紊乱和炎症等疾病背景下用于递送治疗药物的潜力12,13,14,15,16,17。因此，我们认为分享一套有效处理和分析脂肪组织的方法流程尤为重要，因为脂肪组织在这些病理过程中发挥着关键作用。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25 号针头，无菌，用于眶后注射</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27 号针头，无菌，用于眶后注射</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>克隆株 RA3-6B2</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>克隆株 AFS98</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b PerCP Cy5.5 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>克隆株 M1/70</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c APC ef780 抗体</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>克隆株 N418</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>克隆株 1D3</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 FITC 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>克隆株 145-2C11</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>克隆株 390</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>克隆株 30-F11</td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>克隆株 BM8</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>脱盐离心柱</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba 离心柱</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>动态光散射 Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp; PERM 细胞通透化试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>纱布海绵</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>脂质体挤出器</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>活/死细胞染料 Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>眼科润滑剂</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20 g/70 oz 无菌</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>用于组织剪切的聚乙烯小瓶</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump 热疗泵及垫片</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>径迹蚀刻聚碳酸酯膜</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore 聚碳酸酯亲水膜</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS 系统</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

荧光染料标记脂质体的体内组织特异性细胞摄取的制备、给药与评估

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

人们日益关注利用脂质体在体内递送化合物，特别是用于靶向治疗策略。根据脂质体的配方不同，其在体内可能被不同类型细胞优先摄取。这可能会影响治疗颗粒的疗效，因为不同疾病的进展具有组织和细胞类型的特异性。在本方案中，我们介绍一种使用DSPC、胆固醇、PEG-2000 DSPE以及脂质染料DiD作为荧光标记物合成并荧光标记脂质体的方法。本方案还介绍了一种在体内递送脂质体并通过流式细胞术评估细胞特异性摄取脂质体的方法。该方法可用于确定摄取脂质体的细胞类型，并量化脂质体摄取在不同细胞类型和组织中的分布及比例。尽管本方案未提及，但额外的实验方法，如免疫荧光以及流式细胞仪上的单细胞荧光成像，可进一步加强所得结果或结论的可靠性，因为这些方法允许评估细胞内染色情况。此外，根据所研究的具体组织，可能还需对方案进行相应调整。

脂质体生产
本文发表的结果与我们先前发表的研究3,4,20相似。采用本方案，预期可制备出粒径约为150‒160 nm的脂质体。动态光散射（DLS）结果显示，脂质体的平均直径为163.2 nm，泽塔电位（zeta potential）为-19.2 mV（图1A）。冷冻电子显微镜（cryo-EM）成像显示脂质体呈圆形（图1B），DLS粒径分布图显示其相对于平均直径的标准偏差较小（图1C）。
阳性脂质体结合需要 PBS 处理的对照
我们课题组先前采用该方案的研究探讨了在体内给药一周后，脂肪组织SVF、脾脏和血液中哪些细胞亚群能够与脂质体结合3,4。使用PBS处理的小鼠，对其腹腔和脾脏细胞进行染色，所用抗体组合与脂质体处理小鼠样本相同。在处理一周后采集组织（图2A）。PBS处理小鼠的样本作为DiD的FMO对照，用于设定DiD阳性门控（图2B,C）。虽然可利用DiD阳性信号设定阳性门控，但仍需使用不含DiD信号的样本验证该阳性门控是否排除了所有DiD阴性样本。
需要进行滴定以优化荧光信号
在开展完整实验之前，必须优化多种条件，包括细胞染色过程中使用的荧光标记抗体浓度以及脂质体配制过程中使用的脂质染料浓度。流式细胞仪对荧光强度具有检测上限，因此脂质体中掺入过多染料将导致样本在流式细胞仪检测时DiD信号超出可定量范围。此外，脂质体中DiD染料过多可能导致非特异性染料转移水平升高，从而影响细胞摄取结果的准确性。图3展示了通过梯度稀释脂质染料浓度以确定在所用流式细胞仪检测范围内产生最佳信号浓度的实验结果。该优化实验在最终实验所关注的组织上进行：血液（图3A）、腹股沟脂肪组织基质血管组分（SVF）（图3B）以及附睾脂肪组织基质血管组分（SVF）（图3C）。测试选用的染料浓度分别为每1 mL脂质体加入10 mg DiD（高浓度，红色）、1 mg DiD（中浓度，蓝色）或0.1 mg DiD（低浓度，灰色）。脂质体中使用的最高浓度在所有三种组织中均过高，超出了流式细胞仪的可定量检测范围（图3A‒C，红色）。最低DiD浓度显示出一定信号（图3A‒C，灰色），但未能观察到明显区别于PBS处理细胞的细胞群（图3A‒C，黑色）。定量分析显示，每种组织在不同浓度下DiD的平均荧光强度（MFI）算术均值表明，PBS对照组与中浓度DiD组之间存在明显差异（图3D）。因此，如实验方案所述，我们选择中等浓度（图3，蓝色）用于后续脂质体制备。
使用多抗体组合可实现对不同细胞亚群摄取脂质体的鉴定
使用表3中列出的抗体组合，对巨噬细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞、单核细胞和内皮细胞的标志物进行染色（图4）。每种组织类型需要略微不同的设门策略，但大多数相同的细胞类型均可在各类组织中被识别。其中一些例外情况包括内皮细胞，其通常不存在于血液中；以及单核细胞，其在血液中的频率通常高于其他组织。在确定各细胞群后，可定量分析每个细胞群体的总数量及其DiD+细胞所占频率。还可进一步计算以表征DiD+细胞群体：例如DiD+细胞中巨噬细胞、内皮细胞等所占的百分比。请注意，这些仅为示例性的设门策略，并非分析样本的唯一方法。具体分析应根据所选的抗体组合及可用的流式细胞仪而定。
<img alt="纳米颗粒表征；粒径和泽塔电位数据；透射电镜图像；直方图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：制备的脂质体的典型特性示例。 
（A）粒径和泽塔电位的测量方法如上所述，并以表格形式报告。每个参数均表示为平均值 ± 标准偏差。（B）采用冷冻电镜（Cryo-EM）对制备的脂质体进行成像。白色标尺长度为 50 nm。（C）采用动态光散射（DLS）对该批次脂质体的直径进行直方图分析。本图改编自 Osinski 等人3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PBS/脂质体注射实验；流式细胞术结果；组织采集；DiD+ 小鼠分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：PBS 或脂质体处理小鼠的代表性 DiD 染色结果。 
(A) PBS 与脂质体处理的实验示意图。PBS 或脂质体在一周内注射三次。组织于第 8 天采集。(B, C) 代表性流式图显示，经脂质体处理的小鼠呈现 DiD 染色阳性（C），而 PBS 处理的小鼠未见阳性染色（B）。FSC，前向散射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同浓度下DiD脂质体在血液和脂肪组织中摄取的流式细胞术图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：脂质体中DiD的滴定。 
制备含有三种不同浓度DiD的脂质体并注射入小鼠体内。灰色代表低浓度（每1 mL脂质体含0.1 mg DiD），蓝色代表中等浓度（每毫升脂质体含1 mg DiD），红色代表高浓度（每毫升脂质体含10 mg DiD）。以PBS处理的小鼠作为阴性对照（黑色）。注射后24小时采集血液（A，圆形）、腹股沟脂肪组织（B，三角形）和附睾脂肪组织（C，方形），并制备成单细胞悬液。使用流式细胞仪检测各样本中可检测到的DiD水平。各组织的直方图展示了不同处理组的叠加结果，以显示每种浓度下的荧光强度（A‒C）。同时对每种组织和浓度下的DiD算术平均值进行定量分析并作图（D）。SSC = 侧向散射。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术设门策略；涉及脂肪SVF、脾脏和血液；图示CD45+、CD31+细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：脂肪SVF、血液和脾脏中细胞亚群的代表性流式细胞术分析。 
(A‒C) 用于鉴定脂肪SVF (A)、脾脏 (B) 和血液 (C) 中细胞亚群及DiD+细胞的设门策略示意图。缩写：FSC = 前向散射；LD = 活/死细胞；L-DCs = 淋巴样树突状细胞；M-DCs = 髓样树突状细胞；SSC = 侧向散射。本图改编自Osinski等3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>对照</td>
			<td>目的</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">用 PBS 或生理盐水处理的小鼠</td>
			<td>使用该小鼠的细胞进行以下流式细胞术对照：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. 未染色细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. 活/死细胞单染</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. 使用完整抗体组合染色但不含脂质体荧光信号的细胞，用于分析时确定脂质体阳性信号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>该/这些小鼠还将用于确定脂质体在体内是否具有任何效应，因为实验中将包含无脂质体的对照组。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未载药脂质体</td>
			<td>如果您的脂质体中加载了化合物，则应合成一部分不含该化合物的脂质体批次，以排除脂质体本身可能引起的体内效应。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD 单独给药</td>
			<td>由于 DiD 也可能被细胞膜摄取，将部分小鼠给予与脂质体中等量的游离染料，有助于排除任何背景膜染色的影响。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>荧光减一（FMO）对照</td>
			<td>这些细胞使用除一种抗体外的所有抗体组合进行染色。与上方第 3 项类似，这有助于在分析时确定该抗体的真实阳性信号。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本方案中应使用的对照。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td>组分</td>
			<td>每批/每只小鼠所需近似体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">脂质体的制备</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>醋酸钙</td>
			<td>1 M 醋酸钙水溶液（H2O）</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 缓冲液</td>
			<td>10 mM HEPES 水溶液（H2O），pH 7.4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 中的 Tesaglitazar</td>
			<td>溶于 10 mM HEPES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">组织收获、处理与染色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td>
			<td>137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4，溶于重蒸水（ddH2O）</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-肝素</td>
			<td>0.1 mM 肝素 PBS 溶液</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 缓冲液</td>
			<td>20 mM HEPES PBS 溶液</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>消化缓冲液</td>
			<td>2 mg/mL I 型胶原酶溶于 HEPES 缓冲液</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC 裂解缓冲液</td>
			<td>0.158 M NH3Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM Na2EDTA，溶于 ddH2O，pH 7.2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS 缓冲液</td>
			<td>1% BSA、0.05% NaN3 PBS 溶液</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc 封闭（稀释后）</td>
			<td>Fc 封闭剂按 1:50 比例稀释于 FACS 缓冲液中</td>
			<td>250 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>固定缓冲液</td>
			<td>2% 多聚甲醛 PBS 溶液</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：需配制的溶液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">胞外染色（2倍抗体混合液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗原</td>
			<td>荧光素</td>
			<td>每100 µL检测所需抗体体积</td>
			<td>所需总体积：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0.5 µL</td>
			<td>C列 × 1.2 × 样本总数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>(0.5 µL/检测) × (1.2) × (样本数)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>(0.25 µL/检测) × (1.2) × (样本数)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>(0.25 µL/检测) × (1.2) × (样本数)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>(1.0 µL/检测) × (1.2) × (样本数)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>依此类推…</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1.5 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">配制抗体混合液时，将D列计算出的抗体体积加入FACS缓冲液或Brilliant Violet染色缓冲液*中，总体积为(50 µL × 1.2 × 样本总数)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">活/死细胞染色（1倍）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>活/死细胞染料</td>
			<td>荧光素</td>
			<td>每200 µL检测所需染料体积</td>
			<td>所需总体积：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0.67 µL</td>
			<td>C列 × 1.2 × 样本总数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">胞内染色（1倍）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗原</td>
			<td>荧光素</td>
			<td>每50 µL检测所需抗体体积</td>
			<td>所需总体积：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>C列 × 1.2 × 样本总数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*若检测方案中使用了两种或以上偶联Brilliant Violet荧光素的抗体，应使用Brilliant Violet染色缓冲液。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：用于流式染色的示例抗体组合及染色混合液的计算方法。

本实验方案的目的是合成荧光标记的脂质体，并利用流式细胞术在细胞水平上鉴定脂质体在体内的定位情况。

人们对使用脂质体在体内递送化合物的兴趣日益增长，尤其是在靶向治疗策略中。根据脂质体的……

本方案结合了一种简便的制备载药脂质体的方法与全面评估细胞水平脂质体摄取的策略。该技术提供了一种无偏倚的方法，用于评估采用低温条件和易获取设备制备的荧光标记脂质体的摄取情况。为制备负载乙酸钙和tesaglitazar的荧光标记脂质体，首先使用半英寸探头在室温、20千赫兹、50%功率条件下超声30秒，将脂质的乙醚-氯仿溶液进行乳化。立即将均质化的水和油乳液转移至配备特殊接头、纳米计和压力调节阀的旋转蒸发仪中，并将蒸发仪连接至真空管线。为去除有机溶剂，将旋转速率设为100转/分钟，真空度设为0.5个大气压。当凝胶形成并消失后，将真空度提高至0.9个大气压，然后使用配备两个气密注射器的脂质体挤出器，将脂质体水相分散液反复通过200纳米孔径的聚碳酸酯滤膜多次过滤。通过动态光散射验证粒径分布后，使用2毫升离心柱去除脂质体中未包封的tesaglitazar，并用分光光度计测定包封药物的浓度。然后，将不超过500微升的脂质体样品加入干燥的柱层析凝胶床中。若需通过眶后注射给予脂质体，应轻轻按压暴露的眼睛上下方的皮肤，使眼球突出于面部平面之上。然后小心地将针头尖端插入小鼠眼睛的前角处，确保针头位于眼眶下方且不接触眼眶，缓慢将脂质体注射到眶后腔。为采集血液样本，在适当的实验终点，小心地在小鼠肋骨后端边缘的皮肤处做一切口，并沿直线向上朝动物头部方向剪开约1厘米，直至暴露胸肌。在初始切口位置，做两个垂直于原切口线的小切口，朝向头部方向，然后小心地将暴露区域肋骨一侧的胸肌剪除，以便更好地接近并观察针头插入部位。将针头插入第三和第四肋骨之间，尽量靠近肋骨中线，轻轻拉动注射器以开始采集血液。当采集到尽可能多的血液后，将血液转移至含有10微升0.5摩尔EDTA并置于冰上的微量离心管中。为提取小鼠两侧的腹股沟后组织垫，用一把镊子夹住腹膜右侧，另一把镊子夹住腹膜上方皮肤边缘。轻轻将皮肤从膜上拉开，以分离各层组织。固定皮肤外缘，以便更好地暴露脂肪组织区域，并沿皮肤寻找腹股沟脂肪组织库。使用镊子和剪刀定位位于脂肪组织库中央的腹股沟淋巴结，并根据需要将其取出。切除淋巴结后，用镊子小心夹住靠近固定点的脂肪组织末端，开始在脂肪组织与皮肤之间的结缔膜处进行小切口。在切割的同时将脂肪组织从皮肤上抬起，以更清楚地暴露结缔膜，随后将该脂肪组织置于含有冰上预冷HEPES缓冲液的聚乙烯小管中。为从腹腔尾端分离附睾脂肪组织，可用镊子轻轻从鼠体背部末端拉出第一个附睾脂肪组织，并辨认附着于该组织上的附睾及输精管。然后小心地在脂肪组织库与附睾及输精管之间进行切割，将脂肪组织与其他组织分离，并将分离出的脂肪组织置于含有HEPES缓冲液的聚乙烯小瓶中，冰上保存。当所有组织均采集完毕后，使用一至两把剪刀将脂肪组织样本剪切成约0.5毫米大小的组织碎片。接着，向含有脂肪组织碎片的小瓶中加入1.5毫升浓度为2毫克/毫升的胶原酶缓冲液，将小瓶放入37°C、150转/分钟的振荡培养箱中消化30至45分钟。30分钟后，使用1 mL移液器将样品反复吹打数次。如果组织块仍然过大而不易移液，需将样品放回培养箱中继续孵育15分钟。待样品完全消化后，再将组织碎片吹打10次，以确保形成单细胞悬液，并将每份样品分别经70 µm细胞滤网过滤至一个50 mL离心管中，每份样品使用一个独立的滤网。用 5 毫升 FACS 缓冲液冲洗每根离心管，以收集残留的细胞，并将每次洗涤液过滤至相应装有细胞样品的冰上离心管中。所有样品过滤完成后，通过离心收集细胞，并吸除样品中的脂肪细胞上清液。接下来，小心吸除上清液，保留基质血管组分沉淀完整，然后将沉淀物重悬于每管 1 毫升 FACS 缓冲液中。然后将悬浮液转移至冰上的新的1.5或1.7毫升离心管中，直至按照标准方案进行流式细胞术分析。动态光散射显示脂质体平均直径为163.2纳米，泽塔电位为-19.2毫伏。冷冻电子显微镜成像显示脂质体呈圆形结构，其直径的标准偏差相对较小，与动态光散射测得的平均直径一致。以PBS处理小鼠的样本进行流式细胞术分析，可作为DiD荧光减一对照，用于建立DiD阳性门控。如本代表性分析所示，10 毫克/毫升的DiD脂质体加载浓度过高，在所检测的三种组织中均超出流式细胞仪的可定量范围。0.1 毫克/毫升的浓度显示出部分信号，但未观察到明显区别于PBS处理细胞的细胞群。因此，建议在脂质体的制备中使用每毫升一毫克的浓度，该浓度既能与PBS对照组表现出明显差异，又可被分析仪准确读取。每种组织类型需要略微不同的设门策略，但大多数相同的细胞类型在各类组织中均可被识别。一旦确定了特定的目标细胞群体，即可定量分析每个细胞群体的总大小及其DiD阳性细胞所占频率。准备试剂和设备，并预判每一步的预期结果至关重要。早期出现意外结果可能会影响后续实验的成败。组织学方法可用于评估脂质体在完整组织内的定位，而成像流式细胞术则可用于在单细胞水平上验证脂质体的内化情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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