利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

本方案能够在一次成像过程中同时获取多个胚胎。尽管样品制备是为使用高内涵分析仪进行多点采集而优化的，但采用本方案制备的样品也可在任何具备多点采集功能的倒置显微镜上进行成像。首先，使用挑卵工具在培养皿干净区域将15至20个胚胎排列成两行。

将胚胎的腹侧朝下摆放，使所有胚胎的头尾方向保持一致。在盖玻片上粘附一个间隔垫片，并在暴露的盖玻片玻璃凹面处涂抹10微升正庚烷胶。在胶水干燥的同时，使用剃刀刀片在两排胚胎周围切割出一个矩形区域。

在第一个矩形旁边切割第二个矩形，并使用不锈钢刮刀的直边将第二个矩形移除。小心地将刮刀的直边滑入第一个矩形下方，并将其取下。然后，将带有胚胎的切块放置在3.5厘米培养皿的外侧。

在体视显微镜下，将已准备好的盖玻片轻轻覆盖在胚胎上，并轻压使两排胚胎贴附到胶上。若不进行显微注射，则用体积比为1:1的卤代烃油700与卤代烃油27混合液填充硅胶垫片至其高度的一半。用双面胶带贴在四片式载玻片板适配器的底边边缘。

这将防止载玻片在成像过程中移动。确保胶带不要放置在物镜镜头的光路中。将盖玻片安装在四片载玻片板适配器上。

若进行胚胎显微注射，应将带有胚胎的盖玻片置于载玻片上，以防止在干燥和显微注射过程中盖玻片底部被污染。将胚胎干燥5至10分钟，随后立即用体积比为1:1的卤代烃油700与卤代烃油27覆盖，并填充硅胶垫圈至其高度的一半。使用加长上样尖端，向两到三根显微注射针中各加载约2 µL的注射液。

将一根针安装到显微注射器上，并将柱塞压至尖端的一半位置，以增加玻璃毛细管内部的气压。将玻璃针头置于载玻片上，使用新的9号剃刀以45度角切割针尖，形成一个锋利的开口尖端。注射液应流至针尖底部，但不应从针头中流出。

在针尖上方小心加入 20 微升卤代烃油，并以 45 度角重新剪开针尖。此时注射液应开始快速流出，因此请记得通过回抽活塞来调节压力。使用显微操作仪将针头置于视野中央。

然后抬起针头，将载玻片从针下取出。将胚胎置于体视显微镜载物台上，位于显微注射针下方，并在50倍放大倍数下对胚胎进行聚焦。降低针头，直至其与胚胎处于同一焦平面。

一手移动载玻片，另一手操作显微注射仪，对一排胚胎进行注射。抬起注射针，将载玻片旋转180度，使第二排胚胎暴露于显微注射针下。降低注射针，对第二排胚胎进行注射。

本方案用于研究微管在果蝇胚胎有丝分裂过程中内质网重组中的作用。定量比较了多种显微注射药物处理对内质网重组的影响。发现秋水仙素（可抑制新的微管聚合）会显著降低有丝分裂期间内质网向纺锤体极的定位。

对32个胚胎进行了延时成像数据采集。使用定制的MATLAB脚本，从12,800个感兴趣区域中分析了平均和最大强度测量值。首次尝试本方案时，请注意不要在任何一个步骤上耗时过长，否则可能错过需要成像的发育阶段。

在进行任何实验之前，请逐步练习本实验方案。我们的样品制备方法能够在一次实验中同时获取多个胚胎，从而产生足够数量的实验重复，用于定量分析。本方案有助于发育胚胎学从定性成像实验向定量成像实验的转变。

在一次成像过程中对多个胚胎进行成像的能力还可消除重复实验之间的实验噪声。