高通量筛选化学化合物以阐明其对细菌持留作用的影响

本文所述方案能够以高通量方式鉴定显著影响细菌持留特性的条件。该方法易于适应多种筛选需求，例如药物组合、基因文库等。由于该方法包含多个需同时进行的子步骤，可视化演示有助于研究人员精确掌控操作时间，从而获得准确结果。

首先准备微阵列细胞培养物。将250微升对数生长期的细胞转移至50毫升离心管中含25毫升新鲜改良LB培养基的培养液中。然后轻轻混匀细胞悬液，使其均匀分布。

将稀释后的细胞悬液转移至无菌的50毫升储液槽中。使用多通道移液器，将150微升细胞悬液加入含有多种化学物质的微阵列板的每个孔中。也可按照文本稿件中描述的方法手动制备微阵列。

用透气封膜覆盖微阵列板，并在37摄氏度、250 RPM条件下于摇床中孵育24小时。为制备持留菌检测板，取50毫升离心管，配制25毫升含5微克/毫升氧氟沙星的改良LB培养基，将该培养基转移至无菌储液槽中。将190微升改良LB培养基加入通用平底96孔板的每个孔中。

24小时孵育后，从摇床中取出微阵列，将10微升细胞培养物从微阵列转移至含有含氧氟沙星改良LB培养基的持留菌检测板孔中。从持留菌检测板中取10微升细胞悬液，使用圆底96孔板和多通道移液器，在290微升PBS溶液中连续稀释三次。然后将所有连续稀释的细胞悬液各取10微升点样于不含抗生素的新鲜琼脂平板上。

用透气封膜覆盖持留菌检测平板，并在37摄氏度、250 RPM条件下于摇床中孵育6小时。6小时孵育结束后，重复进行梯度稀释并将菌液点样至琼脂平板上。将琼脂平板在37摄氏度下孵育16小时。

然后计数菌落形成单位（CFU）。利用抗生素处理前及处理后6小时的CFU水平，计算每个孔中的持留菌比例。氧氟沙星（OFX）处理前的CFU计数也有助于评估渗透调节剂对大肠杆菌活力的影响。

将250微升对数生长期的细胞转移至含有微阵列筛选确定的渗透剂的25毫升新鲜改良LB培养基中。将锥形瓶置于摇床中，在250 RPM和37摄氏度条件下培养24小时。24小时后，从摇床中取出锥形瓶，将250微升菌液转移至装有25毫升新鲜改良LB培养基的250毫升挡板锥形瓶中。

向细胞悬液中加入 25 微升的氧氟沙星储备液，轻轻摇动锥形瓶，使检测培养物混合均匀。将锥形瓶置于 37 摄氏度、250 转/分钟的摇床中孵育。在处理期间每小时取样一次，包括添加氧氟沙星前的时间点，从锥形瓶中转移 1 毫升检测培养物至 1.5 毫升微量离心管中，并在 17,000 ×g 条件下离心 3 分钟。

移除950 µL上清液，并用950 µL PBS洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于100 µL PBS溶液中。取10 µL细胞悬液，加入96孔圆底板中，每次用90 µL PBS进行连续六次梯度稀释。

取10微升稀释后的细胞悬液，点样于不含抗生素的琼脂平板上。为提高检测限，将剩余的90微升细胞悬液接种至新的琼脂平板上。将平板在37°C下孵育16小时，然后计数菌落形成单位（CFUs）。

此处展示了一张用于测定 OFX 处理前后细胞培养物 CFU 水平的琼脂平板的代表性图像。第一列为对照组，第二列是培养在 100 毫摩尔硝酸钠中的细胞，第三列是培养在 60 毫摩尔硝酸钠中的细胞。

为简便起见，此处仅关注两种渗透保护剂。图中展示了在96孔板中测试的细胞培养物的菌落形成单位（CFU）数据及其持留菌比例的图形化结果。为计算持留菌比例，将持留菌数量标准化为抗生素处理前获得的细胞数量。

为了生成双相杀菌曲线，将细胞在25毫升添加了指定渗透剂的改良LB培养基中，于有挡板的烧瓶内培养24小时，随后转移至持留菌检测烧瓶中进行持留菌计数。在实施本方案时，需注意将细胞点样至琼脂平板的过程较为耗时，且需要高度集中注意力。该步骤中的任何失误均可能导致不同测试条件之间的交叉污染。

因此，在实验前练习同时观察多个样本非常重要。按照本方案，可对药物筛选板和突变细胞文库进行筛选，以研究其对细菌持留现象的影响。通过此类筛选，我们已鉴定出多种对细菌持留具有显著影响的渗透保护剂和PS条件。