Name: 利用单分子定位显微镜分析人类 iPSC 衍生肌细胞中的α-Actinin 网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习使用单分子定位显微镜技术定量评估人类iPSC衍生心肌细胞中肌节网络的成熟状态。该方法可检测常规共聚焦成像无法识别的细微结构变化，为心脏发育研究提供高分辨率成像方案。

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本研究由欧盟结构基金（ESF/14-BM-A55-0024/18）资助。此外，H.L. 得到罗斯托克大学医学中心 FORUN 项目（889001 和 889003）以及约瑟夫与凯特·克林茨基金会（T319/29737/2017）的支持。C.I.L. 得到罗斯托克大学医学中心临床科学家项目的支持。R.D. 得到德国研究基金会（DFG，DA1296/6-1）、DAMP 基金会、德国心脏基金会（F/01/12）以及联邦教育与研究部（BMBF，VIP+ 00240）的支持。
感谢 Madeleine Bartsch 在诱导多能干细胞培养和心肌分化方面的技术支持。

本方案中涉及新生小鼠和成年小鼠的所有步骤均遵循罗斯托克大学医学中心动物护理的伦理指南。
1. 诱导多能干细胞来源心肌细胞的培养与解离
<ol>
	<li>采用之前所述的二维单层培养法，将hiPSC-CMs分化培养25天17。</li>
	<li>将消化培养基预热至37 °C，支持培养基平衡至室温。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>向细胞中加入预热的消化培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育12分钟。</li>
	<li>向细胞中加入支持培养基。 
	注意：所加支持培养基的体积应为步骤1.4中所用消化培养基体积的两倍。</li>
	<li>使用5 mL血清移液管轻轻吹打使细胞脱落。</li>
	<li>在200 x g条件下离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于3 mL hiPSC-CM培养基中17。</li>
	<li>以每孔75,000个细胞的密度将细胞接种至8孔玻璃底培养板中，培养3天。</li>
</ol>
2. 成年心肌细胞的分离
<ol>
	<li>按照先前报道的方法分离并培养 NMRI 小鼠的成年心肌细胞18。</li>
	<li>将细胞接种于 8 孔玻璃腔室载玻片中，培养一天。</li>
</ol>
3. 新生儿心肌细胞的分离与培养
<ol>
	<li>新生小鼠心肌细胞的分离步骤按照先前所述方法进行，细胞来源于NMRI小鼠19。</li>
	<li>将分离的细胞以每孔75,000个细胞的密度接种于8孔玻璃培养板中，并在新生小鼠心肌细胞培养基中培养3天19。</li>
</ol>
4. α-肌动蛋白网络的免疫荧光标记
注意：为获得最佳结果，细胞应培养在8孔玻璃底培养板中。标记操作应在成像前一天进行。
<ol>
	<li>将4% PFA在37 °C预热。</li>
	<li>通过将4%多聚甲醛直接加入培养基中（1:1稀释）固定iPSC-CM，并在37 °C孵育15分钟。固定的最终PFA浓度为2%。</li>
	<li>将固定后的细胞在含0.2% Triton-X的PBS中室温孵育5分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。</li>
	<li>加入1% BSA溶液（用PBS稀释），室温孵育60分钟。</li>
	<li>在含0.05% Triton-X的1% BSA溶液中按1:100稀释α-肌动蛋白抗体，配制150 µL一抗溶液。加入细胞中，室温孵育60分钟。</li>
	<li>用0.2% BSA溶液洗涤细胞两次，每次5分钟。</li>
	<li>在含0.05% Triton-X的1% BSA溶液中按1:100稀释羊抗小鼠Alexa647二抗，配制150 µL二抗溶液。加入细胞中，室温孵育40分钟。</li>
	<li>用0.2% BSA溶液洗涤细胞两次，每次5分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。将标记后的细胞避光保存于4 °C，直至进行PALM成像。</li>
</ol>
5. PALM 成像缓冲液的制备
注意：每次实验都必须 freshly 配制 PALM 成像缓冲液。
<ol>
	<li>通过将 25 g 葡萄糖溶解于 50 mL 蒸馏水中，制备 50% 葡萄糖溶液。</li>
	<li>制备含有 50 mM Tris-HCl、10% 葡萄糖和 10 mM 氯化钠的基础缓冲液。
	<ol>
		<li>使用盐酸将 pH 值调节至约 8.0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将 0.6 mg 吡喃糖氧化酶溶解于 316 µL 基础缓冲液中，制备吡喃糖氧化酶溶液。</li>
	<li>通过将 7 mg 过氧化氢酶溶解于 500 µL 基础缓冲液中，制备过氧化氢酶溶液。充分混匀后，在 10,000 x g 下离心 3 分钟。保留上清液以供后续使用。过氧化氢酶溶液可在 4 °C 下保存数天。</li>
	<li>通过混合 316 µL 吡喃糖氧化酶溶液、25 µL 过氧化氢酶溶液、100 µL 50% 葡萄糖溶液、50 µL 半胱胺、5 µL 环辛四烯和 3.5 µL β-巯基乙醇，制备 500 µL PALM 成像缓冲液。吡喃糖氧化酶和过氧化氢酶的最终催化活性需分别为 7.5 U 和 35,000 U。 
	注意：PALM 成像缓冲液可提供 3–5 小时的最佳成像条件。若荧光染料的闪烁能力下降，请重新配制新的缓冲液分装液。</li>
</ol>
6. PALM 图像采集
<ol>
	<li>使用前至少提前3小时开启显微镜，并在成像前将样品恢复至室温，以确保热平衡。如果显微镜配备有培养箱，请将温度调节至30 °C。</li>
	<li>使用适当的清洁溶剂清洁物镜和腔室载玻片的底部。</li>
	<li>向标记细胞的一个孔中加入300 µL PALM成像缓冲液，并将腔室载玻片插入显微镜的载物台固定装置中。</li>
	<li>设置PALM图像采集参数。
	<ol>
		<li>选择1.57 N.A. 100x油镜进行采集。</li>
		<li>选择PALM模式并激活TIRF设置。</li>
		<li>调整要采集的帧数。通常采集5,000–10,000帧足以获得理想结果。然而，实际所需帧数在很大程度上取决于标记效率以及荧光染料的闪烁能力，用户可根据情况调整。</li>
		<li>将紫外激光功率设为0.1%，647激光设为0.2%。</li>
		<li>将增益水平设为50–100。</li>
		<li>开启激光照明并选择目标细胞。若信号强度过低（取决于荧光标记情况），可适当提高增益水平。</li>
		<li>关闭激光照明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PALM图像采集
	<ol>
		<li>将增益降至0，并将激光功率（647激发）提高至100%。</li>
		<li>对目标细胞进行约5秒的漂白。</li>
		<li>将增益提高至50，开始PALM图像采集。 
		注意：需调整增益以获得足够的信号强度，同时应避免像素过饱和。若信号强度下降，可提高增益水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：逐步提高紫外激光功率（0.1%–10%），以增强信号强度并促进荧光分子的闪烁行为。</li>
</ol>
7. PALM 数据的重建
<ol>
	<li>打开 Image J 软件并导入 PALM 数据。</li>
	<li>打开 Thunderstorm 插件并点击“运行分析”
	<ol>
		<li>在“相机设置”菜单中输入像素大小和 EM 增益。 
		注意：当使用 100 倍物镜和 1.6 倍放大镜头时，100 nm 的像素大小是合适的。然而，由于像素大小取决于用于 PALM 成像的显微镜和相机的硬件特性，用户需要仔细检查并调整此参数。EM 增益值可从元数据中获取。</li>
		<li>在“运行分析菜单”中设置参数如下：B 样条阶数：3，B 样条尺度：2.0，峰值强度阈值：stf(Wave.F1)，拟合半径：3，初始 sigma：1.6，放大倍数：5.0，更新频率：50，横向位移：2。点击“确定”按钮确认设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重建 PALM 图像的后处理
	<ol>
		<li>在“绘制直方图”菜单中选择“Sigma”参数。</li>
		<li>使用“矩形”工具选择一个感兴趣区域（ROI），排除可能的伪影，并将该 ROI 应用于滤波器。ROI 的数值将显示在滤波器命令框中。</li>
		<li>在 ROI 数值后添加“&amp;#38; uncertainty &#60;25”。一个可能的滤波器命令示例如下：“(sigma &#62; 48.6821 &amp;#38; sigma &#60; 1117.40) &amp;#38; uncertainty &#60;25”。应用所选的 sigma 值。</li>
		<li>在“去除重复”菜单中，输入距离阈值“10 nm”并应用。</li>
		<li>在“合并菜单”中，将最大距离设为“20”，每个分子的最大帧数设为“0”，最大关闭帧数设为“1”。应用设置。</li>
		<li>在“漂移校正菜单”中，选择互相关方法，并将“分箱数”设为“5”，“放大倍数”设为“5.0”。应用漂移校正设置。</li>
		<li>保存最终的 PALM 图像，并根据需要导出后处理数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 肌节肌丝的分析
<ol>
	<li>肌节长度分析
	<ol>
		<li>打开 Image J 软件并导入重建的 PALM 图像。</li>
		<li>在选定的肌节结构之间绘制一条垂直于 Z 盘的直线，以测量肌动蛋白结合蛋白丝之间的最短距离。</li>
		<li>在“分析”菜单中选择“轮廓分布”功能，并获取两个峰之间的长度。由于肌节长度在单个细胞内可能存在差异，应在目标细胞的不同区域至少测量 20 个肌节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z 盘厚度分析
	<ol>
		<li>打开 Image J 软件并导入重建的 PALM 图像。</li>
		<li>将重建的 PALM 图像转换为 8 位模式图像。</li>
		<li>打开脊线检测插件，并输入以下参数：线宽：20，高对比度：230，低对比度：10，sigma：0.79，下阈值：25.84，最小线长：20。</li>
		<li>勾选“估算宽度”、“延伸线条”和“显示结果”选项。</li>
		<li>点击“确定”，并从结果表格中使用“平均线宽”进行后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012%3A+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li>
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<li>Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

在体外生成具有功能的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CM）对于再生治疗、疾病建模以及药物筛选平台的开发具有重要意义。然而，这些心肌细胞成熟度不足是心血管研究中的主要障碍20。在此背景下，亟需高分辨率成像技术，以实现对iPSC来源心肌细胞结构成熟状态的监测。同时，超分辨率显微镜可成为精确分析特定蛋白功能的有力工具，这些蛋白对于肌节的正常形成至关重要，近期针对肌联蛋白（titin）和肌钙蛋白（troponin）的研究已证实了这一点10,21,22。
在本实验方案中，我们介绍了一种基于光激活定位显微镜（PALM）的方法，通过分析α-肌动蛋白素肌节网络来定量评估诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC CM）的结构成熟度。
与传统的光学显微镜相比，PALM 能够以约 20–50 nm23<...

心肌梗死或心肌病等心血管疾病（CVD）仍然是西方世界的主要死亡原因1。由于人类心脏的再生能力较弱，亟需开发促进心血管疾病恢复的新策略。这些策略包括细胞替代疗法，以补充丢失的心肌细胞（CM），以及开发新型抗心律失常药物，实现有效且安全的药物干预。研究表明，诱导性多能干细胞（iPSC）是一种极具前景的细胞来源，可用于在体外无限生成人类心肌细胞，适用于再生治疗、疾病建模以及药物筛选检测的开发2,3,4。
尽管目前已存在多种不同的心脏分化方案，但诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞（CM）仍缺乏某些表型和功能特征，限制了其在体外和体内的应用5,6。除了电生理、代谢和分子层面的变化外，心脏成熟过程还涉及肌节的结构组织，而肌节是实现细胞收缩和产生收缩力的基本功能单位7。成年心肌细胞具有高度有序的收缩装置，而iPSC来源的心肌细胞通常表现出肌节纤维排列紊乱，导致收缩能力下降以及收缩动力学异常8,9。与具有单轴向收缩模式的成熟心肌细胞不同，未成熟心肌细胞中无序的结构会导致整个细胞呈径向收缩，或促进局部收缩点的出现9,10。
为了促进心肌细胞的成熟，已采用多种方法，包括三维细胞培养技术、电刺激和机械刺激，以及使用模拟体内环境的细胞外基质11,12,13。为了评估这些不同培养条件的效果与效率，需要借助技术手段来监测和估计诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC CM）结构成熟的程度，例如通过显微成像技术。与传统的共聚焦成像相比，光激活定位显微镜（PALM）的分辨率大约高出10倍。该技术因而能够实现更精确的分析，检测到细胞结构的细微变化14。鉴于PALM成像具有高分辨率，本方法的总体目标是通过对z-盘厚度和肌节长度的精确定量，显微评估由iPSC衍生的心肌细胞中肌节的成熟度。在既往研究中，这些结构特征已被证实是评估心脏成熟度的合适参数15。例如，缺乏全长dystrophin的疾病特异性iPSC-CM与野生型细胞相比，其肌节长度和z带宽度均减小16。同样，通过测量单个肌节的长度，可用来研究拓扑线索对心脏发育的影响16。因此，我们应用该方法，通过定量测定肌节长度和z-盘厚度，评估iPSC-CM中肌节网络的结构成熟程度。

<table><tbody><tr><td>人iPSC细胞系</td><td>Takara</td><td>Y00325</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide 8孔玻璃底培养板</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A906</td><td></td></tr><tr><td>心肌细胞解离试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05025</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C40-1G</td><td></td></tr><tr><td>环辛四烯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>138924-1G</td><td></td></tr><tr><td>半胱胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30070-10g</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca²⁺和Mg²⁺的杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2-山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21237</td><td></td></tr><tr><td>Fiji图像处理软件（Image J）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Carl Roth</td><td>X997.2</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1系统</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck</td><td>8187150100</td><td></td></tr><tr><td>吡喃糖氧化酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4234-250UN</td><td></td></tr><tr><td>肌节性&amp;alpha;-肌动蛋白抗体 [EA-53]</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr></tbody></table>

利用单分子定位显微镜分析人ipsc来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

iPSC来源的心肌细胞成熟度是其在再生治疗、药物筛选和疾病建模中应用的关键问题。尽管已开发出多种分化方案，但获得具有成人心肌细胞表型特征的iPSC心肌细胞仍具挑战性。心肌细胞成熟的一个重要方面是形成高度有序的肌节网络，以确保强大的收缩能力。本文介绍了一种基于超分辨率显微技术的半定量分析方法，用于评估心肌细胞中α-肌动蛋白素网络的结构。通过光激活定位显微技术，比较了iPSC来源的心肌细胞与新生儿组织分离的心肌细胞的肌节长度和Z盘厚度。同时，我们强调了采用合适成像条件以获得可靠数据的重要性。结果表明，该方法能够以高空间分辨率对心肌细胞的结构成熟度进行定量监测，从而检测到肌节组织中细微的结构变化。

为了评估心肌细胞（CM）结构成熟的程度，首先使用α-肌动蛋白抗体对新生期、完全成熟的成年期以及诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞进行标记，以可视化肌节网络。在完成PALM成像后，对图像进行重建，并利用基于插件的图像处理软件测量Z盘厚度，该软件可自动检测单个肌丝的宽度。通过测量两个相邻强度峰之间的距离（对应于相邻肌丝）来计算肌节长度。图1展示了诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞中肌节结构的评估结果。
如图2A所示，iPSC-CM与新生心肌细胞表现出相似的α-肌动蛋白素分布模式，具有不规则且排列紊乱的肌节结构。同样，定量评估显示，α-肌动蛋白素纤维的长度和厚度几乎相同，表明iPSC-CM处于未成熟的发育状态。更准确地说，平均肌节长度约为1.83 µm（成年型 vs. iPSC-CM vs. 新生儿CM：1.91 ± 0.02、1.83 ± 0.049 µm vs. 1.82±0.03 µm，n=20个细胞），而Z盘厚度约为74 nm（成年型 vs. iPS...

形成正确的肌节网络对于诱导多能干细胞来源的心肌细胞的成熟至关重要。我们提出了一种基于超分辨率成像的方法，可对干细胞来源心肌细胞的结构成熟度进行定量评估，从而优化促进心脏发育的培养条件。

利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

iPSC来源的心肌细胞的成熟度是其在再生治疗、药物筛选和疾病建模中应用的关键问题。

该方法可用于对诱导多能干细胞来源的心肌细胞中肌节成熟度进行定量评估。利用这种基于超分辨率的技术，能够检测到肌节结构中极其细微的变化，而这是传统共聚焦成像所无法实现的。使用前至少三小时，开启显微镜并将样品恢复至室温。当显微镜准备就绪后，向已标记细胞的孔中加入 300 µL PALM 成像缓冲液，并将腔室载玻片插入显微镜的载物台支架中。选择 1.57 NA 100X 油镜，使用成像软件中的 PALM 模式并激活 TIRF 设置。将帧数设置为 5,000 至 10,000，紫外激光功率设为 0.1%，647 激光设为 0.2%，增益水平设为 50 至 100。当所有采集参数设置完毕后，打开激光照明并选择目标细胞。为获取图像，将647激光功率增加至100%，并将增益降至零。对目标细胞漂白约五秒钟后，将增益调至50，开始PALM图像采集。进行PALM数据重建时，在采集结束后，在ImageJ中打开数据并启动Thunderstorm插件。在插件中选择运行分析，并打开相机设置菜单。输入像素尺寸和电磁增益。在运行分析菜单中，将B样条阶数设置为3，B样条尺度设置为2，峰值强度阈值设置为stfwave.f1，拟合半径设置为3，初始sigma设置为1.6，放大倍数设置为5，更新频率设置为50，横向位移设置为2，然后点击“确定”。重建完成后，在绘图直方图菜单中选择sigma，使用矩形工具选择一个感兴趣区域，排除可能的伪影。将该感兴趣区域添加到滤波器中，并将感兴趣区域的值的不确定性设置为小于25。在“去除重复”选项卡中，输入 10 纳米的距离阈值。在“合并”选项卡中，将最大距离设为 20，每个分子的最大帧数设为零，最大关闭帧数设为一。在“漂移校正”选项卡中，选择互相关法，并将分箱数和放大倍数均设为五，然后保存最终的 PALM 图像并导出后处理数据。为了分析肌节长度，将感兴趣的重建PALM图像导入ImageJ，并使用线条工具在选定的肌节结构之间沿垂直于Z线的方向画一条线，以测量肌动蛋白丝之间的最短距离。在分析菜单中选择“绘制轮廓”功能，并获取两个峰之间的长度。为了分析Z线厚度，将重建的PALM图像转换为8位模式图像，并打开Ridge Detection插件。将线宽设为 20，高对比度设为 230，低对比度设为 10，sigma 设为 0.79，下阈值设为 25.84，最小线长设为 20。选择“估计宽度”、“延伸线条”和“显示结果”，然后点击确定，并使用结果表中的平均线宽进行后续分析。iPSC 来源的心肌细胞与新生细胞表现出相似的 α-肌动蛋白模式，具有不规则且排列紊乱的肌节结构。定量评估表明，两组细胞中α-辅肌动蛋白纤维的长度和厚度几乎相同，提示iPSC来源的心肌细胞处于一种未成熟的发育状态。相比之下，成年成熟心肌细胞表现出规则的肌节网络，肌节长度略有增加，Z盘厚度减小。传统共聚焦成像与PALM成像在肌节长度的测量上无显著差异。然而，当对iPSC心肌细胞进行PALM成像时，可检测到Z盘厚度显著降低。应用PALM技术后观察到分辨率提高，相应的强度图谱也支持这一结果。值得注意的是，使用低质量缓冲液获得的肌节结构似乎比在最佳成像条件下捕获的结构更厚。这种数据准确性的降低是由于荧光分子的闪烁特性减弱，导致每次定位事件中检测到的光子数减少。此外，定位精度下降，降低了重建的PALM图像的整体分辨率。同时，样品漂移可能影响荧光分子的精确定位，从而导致图像模糊。为了获得高质量的PALM图像，必须使整个成像系统充分达到热平衡，以避免成像过程中出现过度的样品漂移。通过该方法，还可利用PALM对线粒体等其他细胞结构进行成像，从而获取心肌细胞成熟度的更多参数。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

利用单分子定位显微镜分析人类 iPSC 衍生肌细胞中的α-Actinin 网络

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

肌动蛋白中的致病突变可改变细胞骨架功能。通过全内反射荧光显微镜对荧光标记的蛋白质进行成像，可定量分析细胞骨架动态。例如，在表达突变型肌动蛋白亚型 R256H 的细胞中，细胞骨架蛋白 Aip1p...

Aip1p 的动态特性因肌动蛋白中的 R256H 突变而改变

在心肌细胞中，管状膜结构形成细胞内网络。本文描述了以下优化方案：i）从小鼠心脏分离心肌细胞（包括质量控制），ii）用于先进荧光显微镜成像的活细胞染色，以及...

心房与心室心肌细胞中管状膜网络的分析

导致先天性心脏缺陷的突变需要在发育过程中对心脏结构进行体内研究，但在小鼠胚胎心脏中开展高分辨率的结构研究在技术上具有挑战性。本文介绍了一种可靠的免疫荧光与图像分析方法，用于评估发育中小鼠心脏中心肌细胞特异性结构。...

小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin...

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

该方法可用于利用带有荧光标记的肌节蛋白的多能干细胞衍生心肌细胞，检测肌节缩短。...

利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短

本实验方案描述了一种利用培养的大鼠海马神经元和三维结构照明显微镜（3D-SIM）对轴突起始段膜周骨架中的肌动蛋白环及其他组分进行可视化和测量的方法。...

使用三维结构照明显微镜（3D-SIM）测量轴突起始段膜周期性骨架的特性

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

学习使用单分子定位显微镜技术定量评估人类iPSC衍生心肌细胞中肌节网络的成熟状态。该方法可检测常规共聚焦成像无法识别的细微结构变化，为心脏发育研究提供高分辨率成像方案。

利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

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