Name: 革兰阴性细菌败血症的新生儿成像模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解利用发光大肠杆菌O1:K1:H7建立的新生儿败血症小鼠成像模型。该方法支持实时追踪细菌播散，并将病原体负荷与炎症反应及肺部病理相关联，为临床前干预测试提供可靠平台。

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这项工作得到了提供给 C.M.R. 的机构资金支持。

<ol><li>Qazi, S. A., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+a+major+global+public+health+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: a major global public health challenge.</a> Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).</li>
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<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewss+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).</li>
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<li>Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+new+insights+into+metastasis+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).</li>
<li>Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Imaging+Reveals+Novel+Patterns+of+Colonization+and+Invasion+in+Systemic+Escherichia+coli+K1+Experimental+Infection+in+the+Neonatal+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat.</a> Infection and Immunity. 83 (12), 4528(2015).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-alpha+inhibitor+protein+administration+improves+survival+from+neonatal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice.</a> Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).</li>
<li>Pluschke, G., Pelkonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+factors+in+the+resistance+of+newborn+mice+to+K1+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Patho%22%5BJournal%5D)">Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection.</a> Microb. Patho. , 93-102 (1988).</li>
<li>Mancuso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interleukin+12+in+experimental+neonatal+sepsis+caused+by+group+B+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci.</a> Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).</li>
<li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li>
<li>Andrade, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2-induced+IL-10+production+impairs+neutrophil+recruitment+to+infected+tissues+during+neonatal+bacterial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis.</a> Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).</li>
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作者声明无利益冲突。

我们建立的肩胛下感染模型是一种用于在新生小鼠中诱导细菌性败血症的新型方法，可用于实时研究细菌病原体的纵向播散过程。活体成像技术为实时观察新生个体中细菌的播散提供了可能，这对于理解细菌播散的动力学特征，并在疾病发展的相应阶段进一步研究宿主反应与组织损伤至关重要。实验中，向新生小鼠皮下、肩胛下区域注射细菌接种物。该注射技术相较于其他常用方法（如尾静脉注射和腹腔注射）更为简便，因其对注射位点的精确定位要求较低，这一点在体型微小的幼鼠中尤为重要。通过活体成像，可在不牺牲动物的前提下，对细菌在周围组织及中枢神经系统中的增殖与播散进行长期动态评估。类似成像方法与技术此前已被用于癌症生物学与转移机制的研究20,21。此外，尽管已有研究报道在新生大鼠E. coli感染过程中使用生物发光成像技术22，但本研究将该方法应用于新生小鼠，并通过我们的实验体系实现了对小鼠败血症期间细菌动力学特征的评估。细菌的可视化依赖于动物体内细菌在不同波长下发射的生物发光信号（例如细菌荧光素酶活...

新生儿败血症是一个重要问题，因为新生儿在生命最初几天表现出独特的免疫特征，无法为机体提供足够的抗感染保护1新生儿败血症仍然是美国一项重大的医疗健康问题，仅在美国每年就导致超过75,000例病例2为了深入研究这些感染，需要建立能够模拟人类疾病特征的新型动物模型。我们已建立了一种使用新生小鼠的感染模型 E大肠杆菌 coliO1:K1:H73. E. coli 是美国新生儿败血症的第二大常见病因，但导致了大多数与败血症相关的死亡病例4,5然而，对于早产儿和极低出生体重（VLBW）婴儿而言，它是首要病因&#160;婴儿被视为独立个体5K1血清型最常与新生儿侵袭性血流感染和脑膜炎相关。6,7目前，除了抗生素和支持性治疗外，尚无其他治疗方法。与此同时，许多致病菌的抗生素耐药率持续上升，部分菌株的 E. coli 对多种常用于治疗的抗生素具有耐药性8因此，我们亟需持续开发研究新生儿脓毒症机制及其宿主反应的方法。这些研究成果有助于改进现有治疗方案并改善感染预后。
与成人相比，新生儿的免疫状态在表型和功能上均存在差异。例如，已有研究表明，脐带血来源的巨噬细胞会产生较高水平的抗炎性和调节性细胞因子，如白细胞介素（IL）-10 和 IL-27，并且在新生小鼠血清中的含量也更高9,10,11。这与新生儿细胞通常表现出较低水平的 IFN-α、IFN-ɣ、IL-12 和 TNF-α 的现象一致，而这些因子在成人细胞中更为常见10。此外，与成人相比，新生儿免疫系统倾向于产生 Th2 型和调节性 T 细胞应答12。新生儿体内中性粒细胞、T 细胞、B 细胞、NK 细胞和单核细胞的数量也有所升高，但其功能存在显著缺陷，包括细胞表面标志物表达异常和抗原呈递能力下降，提示免疫系统尚未成熟13,14,15。此外，新生儿中性粒细胞向趋化因子迁移的能力明显不足16。髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）在新生儿中也处于较高水平，并且最近被证实是 IL-27 的来源之一11。MDSCs 对 T 细胞具有强烈的抑制作用17。综上所述，这些数据表明新生儿免疫功能存在局限性，因而更易受到感染。 
为了研究细菌负荷的进展过程，并解析新生儿败血症期间保护性宿主免疫反应的机制，我们建立了一种新型感染模型。出生后3至4天的新生小鼠难以进行腹腔或尾静脉注射。在本模型中，出生第3或第4天的幼鼠通过皮下注射方式将细菌接种物或PBS注入肩胛区。由此可引发全身性感染，利用发光的E. coli O1:K1:H7，我们能够对单只新生小鼠进行纵向成像，以追踪外周组织中播散的细菌负荷。这是首个报道的利用活体成像技术来阐明败血症期间新生小鼠体内细菌播散动力学的模型3。
本文介绍了一种在新生小鼠中诱导E. coli败血症感染的实验方案3。我们详细描述了注射用细菌接种物的制备方法，以及如何采集组织以评估病理变化、通过基因表达分析检测炎症标志物，并定量分析细菌负荷量。此外，还介绍了使用发光型E. coli对感染的新生小鼠进行活体成像，以及定量分析新生小鼠免疫细胞杀菌能力的方法。这些实验方案也可经适当调整后用于研究新生儿中其他重要的细菌感染。本文所呈现的数据代表了一种在具有临床转化意义的新生儿败血症模型中，研究感染动态的全新方法。

<table><tbody><tr><td>1 mL 胰岛素注射器</td><td>Coviden</td><td>1188128012</td><td>接种物或 PBS 注射</td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td>组织病理学</td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>LSA1049201</td><td>细菌清除实验</td></tr><tr><td>动物纹身油墨膏</td><td>Ketchum</td><td>KI1482039</td><td>动物识别</td></tr><tr><td>绿色动物纹身油墨膏</td><td>Ketchum</td><td>KI1471039</td><td>动物识别</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6B.2 磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-781</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; O1:K1:H7-&lt;em&gt;lux&lt;/em&gt;（表达荧光素酶）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>在西弗吉尼亚大学内部构建</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. HP 总 RNA 提取试剂盒</td><td>Omega Bio-tek</td><td>R6812</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>DPBS，1×</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Difco 胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>236950</td><td>细菌生长</td></tr><tr><td>IL-1β 引物/探针（Mm00434228）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>细胞因子表达 qPCR</td></tr><tr><td>IL-6 引物/探针（Mm00446190）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>细胞因子表达 qPCR</td></tr><tr><td>iQ Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708860</td><td>实时定量 PCR</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>细菌清除实验</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT 及 Living Image 4.5 软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>活体成像</td></tr><tr><td>LB 肉汤，Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td>细菌生长</td></tr><tr><td>EASYstrainer（尼龙滤网）</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542 040</td><td>细胞滤筛</td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>研磨杵电动马达</td><td>Grainger</td><td>6HAZ6</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>聚丙烯研磨杵</td><td>Grainger</td><td>6HAY5</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>Prime 梯度 PCR 仪</td><td>Techne</td><td>3PRIMEBASE/02</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>TNF-α 引物/探针（Mm00443258）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>细胞因子表达 qPCR</td></tr><tr><td>TriReagent（GTCP）</td><td>Molecular Research Center</td><td>TR 118</td><td>RNA 提取</td></tr></tbody></table>

一种革兰氏阴性菌败血症的新生儿影像学模型

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

由于新生儿在生命最初几个月内表现出独特的免疫特征，他们面临更高的细菌性败血症风险。我们建立了一种研究大肠杆菌（E. coli）O1:K1:H7血清型致病机制的实验方案，该血清型在新生儿中可导致高死亡率。本方法利用活体成像技术，在感染进程的不同时间点对新生仔鼠进行动态观察。结合血液中细菌载量测定、炎症因子谱分析及组织病理学检查，该方法为深入理解败血症期间的感染动态提供了严谨的研究体系。在本研究中，我们构建了两种不同感染剂量模型，以比较细菌负荷与疾病严重程度。结果显示，接种后10小时即可观察到肩胛下感染引发的全身播散性感染。至24小时，发光标记的大肠杆菌（E. coli）在血液、肺脏及其他外周组织中均大量存在。肺组织中炎症细胞因子的表达在24小时显著升高，并伴随细胞浸润及组织损伤迹象，且损伤程度随感染剂量增加而加重。活体成像技术虽存在一定局限性，包括发光信号检测阈值以及新生动物在麻醉过程中可能出现的一些技术难题。尽管如此，我们发现该感染模型为深入理解新生儿小鼠败血症过程中纵向感染动态提供了新的视角，而这一过程迄今尚未得到充分研究。我们预计该模型还可进一步拓展用于研究生命早期其他重要的细菌感染性疾病。

本方案在新生小鼠中诱导了细菌性败血症，我们采用纵向活体成像、血液中细菌计数、病理组织学评估以及炎症细胞因子表达谱分析来研究疾病进程。在接种低剂量（约 2 × 106 CFUs）和高剂量（约 7 × 106 CFUs）E.coli 后，随时间推移可观察到新生仔鼠出现一系列发病症状。接受较高接种剂量的仔鼠表现出更明显的痛苦体征，包括活动能力下降、无法纠正体位，以及在感染后24小时（hpi）难以维持直立姿势。然而，不同仔鼠的发病程度存在差异，部分个体表现更为严重。在感染后立即进行成像以建立基线时，一只接受低剂量接种的动物因异氟烷暴露而死亡。至24 hpi时，六只接受高剂量接种的动物中有两只死于全身性感染（死亡率为33.3%）。无论是接受高剂量还是低剂量接种的感染仔鼠，在24 hpi时的体重均显著低于其对照组同窝仔鼠（图1A,B）。所有接受高剂量接种的仔鼠在24 hpi时均达到实验终点标准，因此该组所有感染仔鼠在成像后被实施安乐死。对部分接受低剂量接种的小鼠以及全部接受高剂量接种的小鼠（因均...

新生小鼠感染发光的 E. coli O1:K1:H7 后，会引发败血症感染，并伴随显著的肺部炎症和肺组织病理变化。本文描述了利用纵向活体成像结合系统性细菌载量计数、炎症因子谱分析及肺组织组织病理学检查，建立并进一步研究新生儿败血症模型的实验方法。

新生儿由于在生命最初几个月表现出独特的免疫特征，因此发生细菌性败血症的风险增加。我们已建立了一种……

本方案可在实验性新生儿败血症模型中实时追踪细菌的播散及负荷量，并能够将其他疾病标志物与病原体负荷量进行关联分析。该方案使我们能够对单个新生小鼠的败血症进行纵向分析，从而有机会实时观察和比较感染动态及细菌播散过程。利用此方法可开展针对新生儿败血症的临床前干预测试，实现对宿主控制细菌能力相关效应的监测。首先，在生物安全二级柜内将年龄相匹配的幼鼠分配至高剂量或低剂量菌液组。在出生后第3天或第4天，接种前记录所有幼鼠的体重。在生物安全柜内用PBS或高剂量、低剂量的大肠杆菌lux菌液填充胰岛素注射器，并将装好试剂的注射器置于冰上。将待注射的新生小鼠置于生物安全柜内的洁净表面上，捏起其颈部后方的皮肤，如同抓取幼鼠背部皮肤一样。将针头斜面向上插入皮肤与肌肉之间的空隙处，针尖刚能被感觉到位于皮肤下方即可。当感觉到针头在皮肤下时，在缓慢松开所捏起皮肤区域的同时注射50 µL接种物，以防止回流，然后缓慢而小心地拔出针头。当所有仔鼠均以相同方式注射后，将其放回母鼠身边。注射后立即以及在之后相应的实验时间点，将感染大肠杆菌lux的新生小鼠及其母鼠所在的笼子放入生物安全二级水平的层流罩中，并打开微型CT计算机中的软件。在系统初始化后，待载物台温度稳定在37摄氏度、CCD温度稳定在负90摄氏度时，将最多四只麻醉后的仔鼠以俯卧位放置于成像室内的成像盒中。关闭成像室门，选择生物发光成像模式。选择“开放滤光片”，然后点击“下一步”，将激发滤光片设置为“阻断”，发射滤光片设置为“开放”。选择500、520、560、580、600和620纳米。然后在将幼崽放回母鼠笼中并监测至麻醉恢复前，对幼崽进行成像。在适当的实验终点，在生物安全柜中，用70%乙醇浸湿已处死的新生鼠以防止污染，并将动物置于右侧卧位。用镊子夹住腹部与左后肢之间的皮肤，使用精细尖端的手术剪进行皮肤切口。然后继续向动物背部延伸切口，直至完全暴露脾脏。用镊子和剪刀将脾脏从腹腔中取出，并置于适合后续实验应用的溶液中。为获取肺脏，完全掀开胸部皮肤，将剪刀垂直插入胸骨基部，向上剪开，直至胸腔完全裂开。使用镊子分别夹住右肺和左肺，将肺组织从胸腔中取出。用剪刀将心脏从肺组织中移除。然后将肺组织置于适合其后续应用的溶液中。进行体外细菌杀伤实验时，将未感染的脾脏置于含有5毫升PBS（添加10%胎牛血清）的无菌60毫米培养皿中的40微米尼龙筛网上，使用无菌3毫升注射器活塞将组织研磨成单细胞悬液。将细胞转移至15毫升离心管中，通过离心收集细胞。每3至4个脾脏的细胞沉淀用1毫升红细胞裂解缓冲液重悬。室温孵育5分钟后，用PBS洗涤脾脏，并将沉淀重悬于250微升PBS中，PBS中添加牛血清白蛋白和2毫摩尔EDTA，用于细胞计数。接着，根据生产商说明书，使用相应的免疫磁珠分离Ly6 B2阳性细胞，并将富集的Ly6 B2阳性细胞以每100微升完全培养基接种1×10⁵个细胞的密度，接种至黑色或白色96孔板中。在每孔终体积为100微升的条件下，制备所需感染复数的细菌接种物，然后向每孔加入100微升细菌接种物或仅培养基，在细胞培养孵箱中孵育1小时。孵育结束后，将培养基更换为200微升新鲜的完全培养基，其中添加100微克/毫升的庆大霉素，以清除任何残留的胞外细菌，并将细胞放回细胞培养箱中继续孵育额外2小时。每次孵育结束及之后的各个实验时间点，使用酶标仪在将培养板放回细胞培养箱进行下一次读数前，测量带盖培养板中每孔的发光强度。尽管大多数动物在感染后24小时血液中细菌水平较高，但部分幼鼠血液中细菌含量较低或检测不到，提示此时感染可能已被清除。此外，在去除胞外细菌并进行后续庆大霉素处理前，用生物发光的大肠杆菌（E.coli）感染一小时的新生小鼠脾脏Ly6 B2阳性细胞，在感染后3小时表现出高水平的发光信号，随后随时间推移发光强度下降，提示细菌被逐渐清除。对活体动物中发光细菌的成像进一步证实，在感染后10小时和24小时，新生小鼠体内细菌的播散和增殖随时间增加。结合活体成像与显微CT技术，可有效识别脑、肺及其他外周组织中的感染病灶。某些高感染程度小鼠的肺部显示出与炎症性实变一致的不透明区域，这些区域与发光的细菌信号共定位。在未感染的对照组肺部中未观察到这些疑似炎性渗出物的区域。在低剂量和高剂量接种组中，炎性细胞因子表达水平相对于对照组也显著升高，并与肺泡壁明显增厚、肺泡出血增加以及炎性细胞浸润等病理变化相关。需要牢记的最重要事项是在进行注射时采用正确的技术，并在给予麻醉时严格关注新生个体的状态。通过该技术，我们能够实时观察新生儿败血症，以研究各种干预措施及旨在增强免疫反应的宿主导向治疗。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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