Name: 从小鼠腹内脂肪库分离成脂肪和纤维炎症基质细胞亚群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学习使用荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术从小鼠腹内白色脂肪组织中分离成脂肪和纤维炎症基质细胞亚群的方法，为代谢疾病研究提供可靠的细胞分离方案。

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作者感谢 Lisa Hansen 和 Kirsten Vestergaard 提供出色的技术支持，感谢 P. Scherer、N. Joffin 和 C. Crewe 对手稿的审阅。作者感谢德克萨斯大学西南医学中心（UTSW）流式细胞术核心实验室在建立本文所述实验方案过程中提供的卓越指导和帮助。R.K.G. 的研究工作得到美国国立卫生研究院（NIH）下属国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）R01 DK104789、NIDDK RC2 DK118620 和 NIDDK R01 DK119163 项目的资助。J.P. 受丹麦创新基金博士前奖项资助。

所有动物实验方案和操作均已获得德克萨斯大学西南医学中心机构动物使用与护理委员会的批准。
1. 从性腺白色脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）
<ol>
	<li>从6至8周龄小鼠中分离性腺白色脂肪组织，并将脂肪团块置于1× PBS溶液中。</li>
	<li>合并最多4个脂肪组织（建议来自1至2只小鼠的2至4个脂肪团块），在含有200 µL消化缓冲液（1× HBSS、1.5% BSA和1 mg/mL胶原酶D）的10 mL烧杯中剪碎组织。</li>
	<li>将剪碎的组织转移至含有10 mL消化缓冲液的50 mL离心管中。</li>
	<li>在37 °C水浴中振荡孵育1小时。</li>
	<li>通过100 µm细胞滤网过滤消化后的组织，以去除未消化的组织。</li>
	<li>用含2% FBS的PBS将滤液稀释至30 mL，于4 °C以600 x g离心5分钟。吸除含有成熟脂肪细胞的上清液。</li>
	<li>立即进行后续首选的细胞分离方法。</li>
</ol>
2. 使用流式细胞术分离APC和FIP
<ol>
	<li>轻轻摇动离心管，将沉淀溶解于1 mL 1×红细胞裂解缓冲液中。</li>
	<li>在室温下孵育1–2分钟。</li>
	<li>加入10 mL含2% FBS的PBS溶液，并通过40 µm细胞滤网转移至干净的50 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以600 x g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀重悬于400–800 µL含Fc阻断剂（1:200）的2% FBS/PBS溶液中。</li>
	<li>在4 °C下孵育10分钟。</li>
	<li>将含有≤106个细胞/mL的400 µL–800 µL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，并加入抗体。抗体浓度详见材料表部分。
	<ol>
		<li>分别准备以下对照管：1）未染色细胞，2）单色对照，3）FMO（荧光减一）对照。</li>
		<li>使用PDGFRβ、CD45、CD31、CD9、LY6C抗体对样本进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C下避光孵育15分钟。</li>
	<li>在4 °C下以600 x g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于400 µL含2% FBS的PBS溶液中。</li>
	<li>在4 °C下以600 x g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于400–800 µL含2% FBS的PBS溶液中，随后通过带40 µm滤膜帽的滤器转移至5 mL聚苯乙烯圆底流式管中，用于FACS分析。</li>
	<li>按照以下步骤进行设门分析：
	<ol>
		<li>使用未染色和单色对照进行补偿调节。</li>
		<li>使用FMO对照设定实验门控。</li>
		<li>参照图1所示的设门策略获取APCs和FIPs。将APCs设为CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9-，FIPs设为CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分选后的细胞收集至含有500 µL 100%血清的离心管中，并将细胞置于冰上保存。</li>
	<li>在4 °C下以600 x g离心5分钟。加入2% FBS/PBS洗涤细胞，再次在4 °C下以600 x g离心5分钟。弃去上清液，使用沉淀的细胞进行后续操作。</li>
	<li>将沉淀的细胞重悬于适量体积的性腺APC培养基（用于细胞培养）或适用于后续分析的适当缓冲液中。</li>
</ol>
3. 脂肪生成性与非脂肪生成性组分的免疫磁珠分离
<ol>
	<li>按照步骤 1.1–1.7 从性腺白色脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）。</li>
	<li>吸除上清液，并将 SVF 沉淀重悬于 10 mL 的 1× 商业化 MS 缓冲液中。</li>
	<li>通过 40 µm 细胞滤网过滤细胞悬液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 600 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将沉淀细胞重悬于 100 µL 的 1× MS 缓冲液中。</li>
	<li>进行 CD31+ 和 CD45+ 细胞的耗竭操作（如下所述，图 2A，步骤 1），以去除内皮细胞和造血系细胞。
	<ol>
		<li>使用细胞计数仪计数细胞，并将细胞浓度调整至 ≤ 1 × 108 个细胞/mL。</li>
		<li>向细胞悬液中加入生物素标记的 CD31 和 CD45 抗体，每 106 个细胞各加 ≤ 0.25 µg，冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 4 mL 的 1× MS 缓冲液洗涤细胞。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 600 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，并将沉淀用 100 µL 的 1× MS 缓冲液重悬。</li>
		<li>加入 10 µL 链霉亲和素纳米磁珠，冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 4 mL 的 1× MS 缓冲液洗涤细胞。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 600 x g 离心 5 分钟，然后吸除上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 2.5 mL 的 1× MS 缓冲液中，并转移至 5 mL 聚丙烯管中。</li>
		<li>将管子置于磁力架中静置 5 分钟。</li>
		<li>将细胞悬液倒入干净的 15 mL 离心管中以收集未标记细胞。 
		注意：避免振荡或甩掉悬挂的液滴，以免导致非目标细胞组分污染。</li>
		<li>从磁力架上取下管子，重复步骤 3.6.9 至 3.6.11 两次，共完成 3 次洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂肪生成性与非脂肪生成性组分的分离（图 2A，步骤 2）
	<ol>
		<li>继续使用未标记组分（即 CD45- CD31- 组分）进行操作。</li>
		<li>将含有未标记细胞的 15 mL 管在 4 °C 条件下，以 600 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，并将沉淀用 100 µL 的 1× MS 缓冲液重悬。</li>
		<li>分别加入生物素标记的 LY6C 和 CD9 抗体，每 106 个细胞加 ≤ 0.25 µg，冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>按照步骤 3.6.3 至 3.6.12 完成第二次分离。</li>
		<li>收集未结合组分。未标记细胞（LY6C- CD9-）为含有脂肪前体细胞（APCs）的脂肪生成性组分（图 2A，步骤 3）。</li>
		<li>从磁力架上取下管子，重悬并用 1× MS 缓冲液洗脱结合的细胞。洗脱液或标记组分（LY6C+ CD9+）为含有纤维炎症前体细胞（FIPs）的非脂肪生成性组分（图 2A，步骤 3）。</li>
		<li>将标记和未标记组分在 4 °C 条件下，以 600 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即进行细胞培养（步骤 6），或使用未分化的前体细胞进行后续分析（步骤 4 和/或步骤 5）。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术评估成脂性与非成脂性组分的纯度
<ol>
	<li>用含有 Fc 封闭剂（1:200）的 200–400 µL 2% FBS/PBS 重悬磁珠分离的细胞组分。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中，并加入抗体。抗体浓度见材料表。
	<ol>
		<li>分别准备对照管：1）未染色细胞，2）单色对照，3）FMO 对照。</li>
		<li>向样品中加入 CD45、CD31、CD9 和 LY6C 抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 下避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 600 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞重悬于 400 µL 的 2% FBS/PBS 中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 600 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞重悬于 400–800 µL 的 2% FBS/PBS 中。通过 40 µm 滤膜帽过滤至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，用于流式细胞术分析。</li>
	<li>通过流式细胞术分析评估纯度
	<ol>
		<li>使用未染色和单色对照进行补偿调节。</li>
		<li>使用 FMO 对照设定实验门控。</li>
		<li>采用图 2B所示的门控策略对活细胞和单细胞进行圈门。</li>
		<li>按照图 2B所示对 CD45、CD31、LY6C 和 CD9 进行门控分析。</li>
		<li>使用流式细胞术软件评估分离组分中 CD45- CD31- LY6C- CD9- 细胞（APCs）和 CD45- CD31- LY6C+ 细胞（FIPs）的频率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 采用定量 PCR 进行基因表达分析以评估 FIP 和 APC 的纯度
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用市售提取试剂盒（参见材料表）从磁珠分选或流式细胞术分离的细胞中提取 mRNA。</li>
	<li>使用 cDNA 反转录试剂盒（参见材料表），按照制造商说明，取 1 µg RNA 合成 cDNA。</li>
	<li>采用 SYBR Green PCR 主混合液，通过定量 PCR 检测 APC 和 FIPs 特异性基因（表 1）的相对 mRNA 水平。
	<ol>
		<li>按如下体系配制 PCR 反应液：2× SYBR Green 染料 5 µL，cDNA 1 µL（约 50 ng/µL），上下游引物（10 µM）各 0.5 µL，水 3 µL。</li>
		<li>定量 PCR 扩增采用以下标准程序：预变性阶段：50 °C 保持 2 分钟，95 °C 保持 10 分钟；PCR 循环阶段（40 个循环）：95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过计算 ΔΔ-Ct 法，将检测值归一化至内参基因（Rps18）表达水平。</li>
	<li>采用非配对 Student’s t 检验评估统计学显著性。</li>
</ol>
6. 细胞培养与分化
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 600 x g 离心力对通过磁性或流式细胞分选（FACS）分离的细胞进行离心，持续 5 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 500 µL 性腺来源的 APC 培养基中，并将各组分中的 40,000 个细胞/孔接种至 48 孔培养板中。</li>
	<li>每 1–2 天更换一次培养基。当 APC 细胞接近汇合时，将开始分化为脂肪细胞。在同一培养基中培养的 FIP 细胞则抵抗脂肪生成过程。</li>
</ol>

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T.A.P. 是诺和诺德公司（Novo Nordisk A/S）的员工和股东

C57BL/6 小鼠品系是饮食诱导肥胖研究中最常用的小鼠品系。当给予高脂饮食（HFD）时，C57BL/6 小鼠会迅速增重，并出现与肥胖相关的代谢综合征的一些显著特征（如胰岛素抵抗和高脂血症）。值得注意的是，伴随高脂饮食（HFD）喂养所发生的白色脂肪组织（WAT）扩张呈现出特定脂肪库的差异性19,20,21,22,23。皮下腹股沟白色脂肪库（iWAT）的扩张几乎完全通过脂肪细胞肥大实现，而性腺白色脂肪库（gWAT）的扩张则通过脂肪细胞肥大和增生两种机制共同完成。肥胖小鼠的 gWAT 脂肪库也是代谢性炎症的显著发生部位。因此，饮食诱导肥胖小鼠的 gWAT 脂肪库为研究与肥胖相关的多种脂肪组织重塑特征提供了一个理想的模型。
近年来，最常用的前瞻性分离脂肪组织中脂肪前...

白色脂肪组织（WAT）是哺乳动物能量储存的主要场所。在该组织中，脂肪细胞（又称“脂肪细胞”）以甘油三酯的形式将多余的热量储存于大型单房性脂滴中。此外，脂肪细胞还分泌多种调节能量稳态各个方面的因子1,2,3。脂肪细胞构成了WAT体积的大部分；然而，脂肪细胞仅占WAT中总细胞数的不到50%4,5。WAT中的非脂肪细胞组分，即基质-血管组分（SVF），具有高度异质性，包含血管内皮细胞、组织驻留免疫细胞、成纤维细胞以及脂肪细胞前体细胞（APC）群体。
在能量储存需求增加时，白色脂肪组织（WAT）具有显著的体积扩张能力，这一点十分独特。维持这种组织可塑性至关重要，因为将脂质充分储存于WAT中可防止脂质异位沉积到非脂肪组织中，从而避免有害后果6。在热量过剩的情况下，各个WAT脂肪库扩张的方式是决定肥胖状态下胰岛素敏感性的关键因素7。在患有代谢综合征的肥胖个体中所观察到的病理性WAT扩张，其特征是内脏WAT脂肪库优先扩张，而代谢上更有利的皮下脂肪组织则相对减少。此外，肥胖相关的胰岛素抵抗与WAT的病理性重塑密切相关，表现为现有脂肪细胞的肥大性生长（体积增大）、血管生成不足、慢性代谢性炎症、细胞外基质成分（纤维化）积聚以及组织缺氧8,9。这些肥胖相关的WAT表型与肝脂肪变性和胰岛素抵抗有关，类似于脂质营养不良症（功能性WAT缺失）所呈现的状况。相反，在代谢健康的肥胖人群中可观察到健康的WAT扩张，其特征是保护性的皮下WAT优先扩张，并通过脂肪细胞增生实现脂肪库的扩大10。新脂肪细胞的生成由脂肪细胞前体细胞（APCs）的新生分化（称为“脂肪生成”）所介导。脂肪细胞增生通常伴随较低程度的WAT纤维化和代谢性炎症6,11。WAT微环境中的多种细胞类型直接调控肥胖状态下WAT的健康状态及其扩张能力12。因此，明确WAT中各种细胞类型的生物学功能仍是该领域的重要研究方向。
在过去十年中，已有多种策略被用于定义和分离来自人和小鼠白色脂肪组织（WAT）基质血管组分（SVF）中的原代脂肪前体细胞（APCs）13。这些策略利用基于抗体的细胞分离技术，根据细胞表面常见的间充质干细胞/前体细胞标志物的表达来分离APCs。这些方法包括使用荧光标记抗体的荧光激活细胞分选（FACS），或免疫磁珠分离法（即化学修饰的抗体）。用于APC分离的细胞表面蛋白包括PDGFRα、PDGFRβ、CD34和SCA-1。这些方法有助于富集APCs；然而，基于这些标志物分离得到的细胞群体仍具有较高的异质性。最近的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究揭示了小鼠WAT分离出的基质-血管组分（SVF）中基质细胞在分子和功能上的异质性14,15,16,17。根据我们自身的scRNA-seq和功能分析，我们已鉴定并表征了成年小鼠腹腔内WAT基质区中功能上截然不同的免疫调节型和脂肪生成型PDGFRβ+血管周围细胞亚群15。纤维炎症前体细胞（FIPs）是PDGFRβ+细胞中的一个显著亚群，可根据LY6C的表达进行分离（LY6C+ PDGFRβ+细胞）15。FIPs不具备脂肪生成能力，对多种刺激表现出强烈的促炎反应，能够产生胶原蛋白并分泌抗脂肪生成因子15。在小鼠肥胖模型中，这些细胞的促炎和促纤维化活性增强，提示其在WAT重塑过程中发挥调控作用。LY6C- CD9- PDGFRβ+亚群则代表脂肪细胞前体细胞（APCs）。这些APCs高表达Pparg及其他促脂肪生成基因，并可在体外和体内高效分化为成熟脂肪细胞15。本文提供了一种详细的实验方案，利用FACS以及结合生物素化抗体的免疫磁珠分离法，从成年小鼠腹腔内WAT库中分离上述不同细胞亚群。该方案可用于从成年雄性和雌性小鼠多个腹腔内WAT库中分离功能不同的脂肪前体细胞亚群15。对这些功能各异的细胞亚群进行独立研究，将极大促进我们对健康与疾病状态下调控脂肪生成及腹腔内脂肪组织重塑的分子机制的理解。
以下方案详细描述了从小鼠附睾白色脂肪组织中分离脂肪前体细胞的步骤；然而，该相同方法也可用于分离雄性和雌性小鼠肠系膜和腹膜后白色脂肪组织库中的相应细胞15。关于如何在小鼠中识别和分离这些脂肪库的详细方案，可参见 Bagchi 等人的研究18。本方案已针对6至8周龄小鼠的使用进行了优化。脂肪前体细胞的频率及其分化能力可能随年龄增长而下降。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;机械组织制备与基质血管组分（SVF）分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 和 100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚丙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;消化缓冲液（配制 10 mL）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg 胶原酶 D（终浓度 1 mg/ml）</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0.15 g BSA（终浓度 1.5%）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗原呈递细胞与非抗原呈递细胞的免疫磁珠分选&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5× MojoSort 缓冲液（MS 缓冲液）</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSort 磁力架（MS 磁架）</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L MojoSort 链霉亲和素纳米磁珠</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;纯度检测与流式细胞分析（FACS）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10× 红细胞裂解缓冲液</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc 封闭剂（小鼠 CD16/CD32）</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素标记 CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>浓度：&amp;le; 每 10^6 个细胞 0.25 &amp;micro;g&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：30-F11</td></tr><tr><td>生物素标记 CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>浓度：&amp;le; 每 10^6 个细胞 0.25 &amp;micro;g&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：MEC13.3</td></tr><tr><td>生物素标记 CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>浓度：&amp;le; 每 10^6 个细胞 0.25 &amp;micro;g&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：MZ3</td></tr><tr><td>生物素标记 LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>浓度：&amp;le; 每 10^6 个细胞 0.25 &amp;micro;g&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>浓度：稀释比 1:400&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>浓度：稀释比 1:400&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&amp;beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>浓度：稀释比 1:50&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>浓度：稀释比 1:400&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>浓度：稀释比 1:400&lt;br/&gt; 物种：小鼠&lt;br/&gt; 克隆号：MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养与分化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;性腺来源 APC 培养基（配制 500 mL）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL 含 1 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201 培养基</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 胎牛血清（FBS）** 批号#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 100% ITS 预混液</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM L-抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L 100 g/ml 基础 FGF</td><td>R&amp;D systems</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;micro;L 庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**注意：原代 APC 的成脂能力可能因不同批次的商用胎牛血清（FBS）而异。建议测试多个批次或来源的 FBS。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

白色脂肪组织（WAT）的基质血管组分（SVF）具有显著的异质性，包含多种在成年期WAT的扩展与重塑过程中发挥功能作用的细胞类型。研究这种细胞异质性所带来影响的一个巨大障碍，是难以从WAT的SVF中有效分离出功能上不同的细胞亚群，用于体外和体内分析。单细胞测序技术最近在成年小鼠腹腔内WAT脂肪库中鉴定出功能不同的成纤维-炎症性细胞和脂肪生成性PDGFRβ+血管周围细胞亚群。成纤维-炎症性前体细胞（称为“FIPs”）是一类非脂肪生成性的胶原产生细胞，可表现出促炎表型。PDGFRβ+脂肪细胞前体细胞（APCs）在体外和体内细胞移植后均具有高度脂肪生成能力。本文中，我们描述了从鼠类腹腔内WAT脂肪库中分离这些基质细胞亚群的多种方法。FIPs和APCs可通过荧光激活细胞分选（FACS）或利用生物素化抗体介导的免疫磁珠技术进行分离。分离得到的细胞可用于分子和功能分析。对基质细胞亚群进行独立的功能特性研究，将从细胞水平上拓展我们对生理或病理条件下脂肪组织重塑机制的现有认知。

本方案描述了两种可从成年小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT） depot 中分离出不同基质细胞群体的策略。可通过流式细胞荧光分选（FACS）分离获得 APCs 与 FIPs图1）或使用生物素化抗体进行免疫磁珠分离（图2）。两种方法均使用市售的试剂和抗体。免疫磁珠分离法可将gWAT基质血管组分（SVF）中的成脂性细胞与非成脂性细胞分离。流式细胞术分析显示，成脂性组分中75%的细胞为LY6C阳性。- CD9- APCs。 &#62;非脂肪生成部分中有75%为FIPs（LY6C）+ 细胞）
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61610/61610fig01.jpg" /> 
图1：PDGFR的分离 &#946; 通过FACS从性腺WAT中分离基质细...

本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。

白色脂肪组织（WAT）的基质血管组分（SVF）具有显著的异质性，包含多种参与...的细胞类型

该方案使研究人员能够从感兴趣的鼠类模型中分离出功能和分子特征不同的腹股沟周围白色脂肪组织基质细胞亚群。该技术的优势在于所有工具和试剂均广泛可得。本实验操作将由Rana Gupta博士实验室的高级实验室研究分析师Lavanya Vishvanath进行演示。从性腺白色脂肪组织（WAT）中分离基质血管细胞后，将细胞沉淀重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育1至2分钟。加入10毫升含2% FBS的PBS终止裂解反应，并通过40微米细胞滤网将细胞过滤至新的50毫升离心管中。离心收集细胞，将沉淀重悬于400至800微升含FC阻断剂的FBS-PBS溶液中。在4°C孵育10分钟后，将400至800微升细胞转移至适当数量的试管中，用于荧光标记抗体染色，并在4°C条件下避光孵育15分钟，加入对照抗体和目标实验抗体对细胞进行标记。孵育结束后，通过离心收集细胞，每管用400微升新鲜FBS和PBS洗涤细胞一次。洗涤后，每管中加入400至800微升新鲜FBS和PBS重悬细胞沉淀，通过40微米滤膜帽过滤细胞，收集至5毫升聚苯乙烯圆底试管中，用于流式细胞术分析。设定补偿和实验门控以获取抗原呈递细胞和纤维炎性前体细胞。细胞分选后，通过离心收集并洗涤细胞，每份样品将沉淀重悬于500微升性腺抗原呈递细胞培养基中。对于脂肪生成性与非脂肪生成性细胞组分的免疫磁珠分离，将基质血管组分沉淀重悬于10毫升MS缓冲液中，并通过40微米滤器过滤细胞。计数后，通过离心收集细胞，并将细胞重悬于MS缓冲液中，浓度不超过每毫升1×10⁸个细胞。接下来，每1×10⁶个细胞加入不超过0.25微克的生物素标记抗-CD31和抗-CD45抗体，在冰上孵育15分钟。孵育结束后，用4毫升MS缓冲液通过离心洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于100微升新鲜MS缓冲液中。向细胞中加入10 µL链霉亲和素纳米磁珠，冰上孵育15分钟，随后用4 mL MS缓冲液再次洗涤。将沉淀重悬于2.5 mL新鲜MS缓冲液中，并将细胞转移至一个5 mL聚丙烯管中。将管子置于磁铁上5分钟，然后将未标记的细胞倾入一个新的15 mL离心管中。按照上述方法再重复洗涤两次，每次洗涤后移除未标记的细胞，并通过离心收集内皮细胞和造血谱系耗竭的细胞。将细胞沉淀重悬于100 µL MS缓冲液中，每1×10⁶个细胞加入不超过0.25 µg的Ly6C和CD-9抗体，在冰上避光孵育15分钟。孵育结束后，首先按照前述方法收集Ly6C阴性、CD-9阴性的成脂细胞，然后再收集Ly6C阳性的非成脂细胞。然后，通过离心收集两种细胞群体，并将细胞重悬于500 µL睾丸抗原呈递细胞培养基中，每种细胞群体分别处理。为建立用于分化的细胞培养体系，将每种细胞群体以每孔4 × 10⁴个细胞的浓度接种于48孔培养板的独立孔中，将培养板置于细胞培养箱中培养7至10天。当脂肪细胞前体细胞接近汇合时，将开始分化为脂肪细胞，而纤维性炎症前体细胞则对脂肪生成具有抗性。通过本方案，可采用FACS或免疫磁珠分离法从小鼠成年腹腔内脂肪组织（WAT）库中分离出不同的基质细胞群体，如文中所示。利用免疫磁珠分离法，可从性腺WAT的基质血管组分中分离出具有脂肪生成能力的细胞和无脂肪生成能力的细胞。流式细胞术分析显示，脂肪生成组分中约75%的细胞为Ly6C阴性、CD9阴性脂肪细胞前体细胞，而在非脂肪生成组分中，超过75%的细胞为Ly6C阳性纤维炎症祖细胞。通过任一方法分离的脂肪细胞前体细胞在接种后7至10天内可高效分化为富含脂质的成熟脂肪细胞，纯度较高。相比之下，在相同培养条件下，非脂肪生成型前体细胞则保持成纤维细胞样形态，不会分化为脂肪细胞。本方案适用于从性腺周围白色脂肪组织中分离脂肪生成型及纤维炎症性基质细胞亚群。在小鼠的其他脂肪储存部位也可发现类似的细胞群体。然而，这些细胞的筛选将依赖于不同抗体的使用。通过流式细胞术（FACS）和磁珠分选分离得到的细胞群体可用于细胞分化体外实验，或通过基因表达分析进行进一步表征。

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从小鼠腹内脂肪库分离成脂肪和纤维炎症基质细胞亚群

我们介绍了从鼠类腹股沟（皮下）和性腺周围（内脏）脂肪组织库中分离基质血管组分（SVF）的技术，以评估其基因表达和胶原酶活性。该方法包括利用免疫磁珠细胞分离技术富集Sca1high脂肪来源干细胞（ASCs）。...

脂肪库特异性Sca1high 脂肪源性干细胞（ASCs）的免疫磁珠分离

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。...

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外...

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

我们介绍一种简单的方法，利用荧光激活细胞分选技术从小鼠附睾脂肪垫中分离出高活力的脂肪前体细胞。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

本方案提供了一种高效的胶原酶消化方法，可在单次操作中从人内脏脂肪中分离出有活力的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞，包括从脂肪细胞中提取高质量RNA的方法，以及通过多种膜结合标志物染色，利用流式细胞术对SVF来源的巨噬细胞进行表型鉴定。...

从适合RNA分析和巨噬细胞表型鉴定的人类内脏脂肪组织中分离活的脂肪细胞和基质血管组分

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

本文介绍了从小鼠腹主动脉周围脂肪组织中分离的基质血管组分来源的前脂肪细胞的分离、培养及成脂诱导方法，可用于研究血管周围脂肪组织的功能及其与血管细胞之间的关系。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导基质血管组分来源的前脂肪细胞进行脂肪生成

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。...

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

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高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

学习使用荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术从小鼠腹内白色脂肪组织中分离成脂肪和纤维炎症基质细胞亚群的方法，为代谢疾病研究提供可靠的细胞分离方案。

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

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