在革兰氏阴性菌中构建转座子插入文库用于高通量测序

该方法具有重要意义，因为它可用于多种细菌物种，以鉴定必需基因、抗生素抗性基因以及在感染过程中对体内适应性重要的基因。该技术的主要优势在于通过机械方式共享基因组DNA和Poly-CTL编辑，从而无需使用昂贵的限制性内切酶、接头连接以及凝胶纯化步骤。该技术的应用前景延伸至难治性细菌感染的治疗领域，因为被鉴定为在感染或抗生素抗性中起重要作用的基因，可作为新型抗菌治疗药物的潜在靶点。

该方法可帮助深入了解革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中复杂的基因型与表型关系，并提升当前对细菌遗传学的认识。首先，将过夜培养物转移至50毫升锥形管中，通过在5,000 × g条件下离心7分钟，分别收集受体菌和供体菌的菌体沉淀。弃去上清液。

使用10毫升血清移液管将供体菌株沉淀重悬于4.5毫升添加了二氨基庚二酸的LB培养基中。将重悬后的供体菌株转移至受体菌株试管中。立即把接合反应液分装到添加了二氨基庚二酸的LB琼脂平板上，每板接种100微升液滴。将平板在室温下孵育30分钟。

然后，小心将平板转移至37摄氏度的培养箱中，使菌种交配培养一小时。培养结束后，向每块平板加入1.5毫升LB培养基，将细菌收集至50毫升锥形管中。在5,000 × g离心7分钟，沉淀交配后的菌体细胞。

然后，弃去上清液，并将细胞重悬于 10 毫升 LB 培养基中，以去除残留的二氨基庚二酸。再次离心收集细胞，并用 LB 培养基重复洗涤一次。完成后，使用 10 毫升血清移液管将菌体沉淀重悬于 10 毫升含有 25% 甘油的 LB 培养基中。根据文稿说明将细胞涂布于平板上。随后，将平板在 37°C 下过夜培养。

将剩余的细菌制备成每份1毫升的等分试样，并在-80摄氏度下保存。取一份冷冻接合菌液置于冰上。然后，用无菌玻璃珠将150微升的稀释液均匀涂布于每个添加了卡那霉素的30毫米×150毫米的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上。

处理含有过量交配菌液的废弃离心管，并将平板置于37摄氏度培养14小时。培养结束后，计数每个平板上的菌落形成单位，以估算转座子文库中的总突变体数量。至少选取三个平板，计数其20%的菌落，以此推算所有平板的菌落总数。

在计算出估计的菌落产量后，向每个平板中加入三到五毫升 LB 培养基，使用无菌刮菌工具刮下细菌。将所有平板中的菌液收集至 50 毫升锥形管中，于 5,000 × g 离心 7 分钟，使菌体沉淀。弃去上清液，并将沉淀物重悬于 5 毫升含有 30% 甘油的 LB 培养基中。

然后，将转座子文库以每管1毫升分装至冻存管中，并于-80摄氏度保存。用TE缓冲液将基因组DNA（gDNA）稀释至总反应体积为200微升、浓度为250纳克/微升，放入水浴超声仪中。对DNA进行超声处理，使其片段化为约300个核苷酸长度的片段。

通过在1%琼脂糖凝胶上电泳10微升未剪切的DNA和10微升剪切后的DNA，确认DNA是否已被剪切。如有需要，重复超声处理。为了在剪切DNA的3'端添加Polly接头序列，请按照文本手稿中所述设置连接反应，并将反应管在37摄氏度下孵育1小时。

为纯化反应产物，向每个样本中加入 40 µL 大小选择用顺磁性磁珠，并涡旋振荡反应管。将样本在室温下孵育 5 分钟。随后短暂离心，使液体聚集于管底。

将离心管转移至磁力架上，在室温下孵育两分钟，或直至溶液变澄清。小心移除上清液，加入200微升新鲜配制的80%乙醇，注意不要扰动磁珠。孵育样品，直至溶液变澄清。

然后去除上清液，并重复乙醇洗涤步骤。将离心管短暂离心后重新置于磁力架上，以去除残留液体。将样品在室温下孵育2至5分钟，使其充分干燥。

向每个试管中加入 25 µL 水。涡旋振荡约 5 秒钟，或用移液器吹打数次。然后离心试管，使液体聚集于管底。

将离心管转移至磁力架上，静置约两分钟，直至溶液变澄清。随后，将上清液转移至新的离心管中，注意不要扰动磁珠。本实验方案用于通过细菌接合的方式，在鲍曼不动杆菌ATCC 17978菌株中构建高密度转座子文库，所用大肠杆菌MFD DAP营养缺陷型菌株可复制质粒pJNW684。

利用拉取的鲍曼不动杆菌转座子突变体文库，鉴定在亚抑制浓度抗菌药物条件下对多粘菌素耐药性重要的适应性因子。在耗尽对多粘菌素耐药有贡献的基因突变体文库后，从对照组和实验组培养物中分离剩余文库的总基因组DNA（gDNA）。通过机械剪切将gDNA片段化，并为DNA片段添加接头序列，以准备测序。

通过基于芯片的毛细管电泳分析样品并计算DNA浓度，以确认文库构建成功。进行此操作时最重要的是，根据特定目标菌株的CFU计数调整交配体积，以生成高分辨率的突变体文库。此外，在转座子诱变前，受体菌株必须对转座子所携带的抗生素抗性标记敏感。

通过该实验流程，可对测序结果中获得的单个基因进行基因敲除或功能沉默操作，以在施加挑战性条件的情况下验证目标基因的功能。