在革兰氏负性细菌中生成跨波子插入库，用于高通量测序
July 7th, 2020
我们描述了一种在Gram-阴性细菌中生成饱和变性突变库的方法，以及随后制备用于高通量测序的DNA安培库。例如，我们关注ESKAPE病原体 ，Acineto细菌鲍曼尼，但这个协议是适用于广泛的革兰阴性生物。
这种方法意义重大，因为它可用于不同的细菌物种，以确定重要的基因，抗生素耐药性基因和基因对感染期间体内的健身很重要。该技术的主要优点是机械共享基因组DNA和聚体-CTL版本，无需昂贵的限制性酶、适配器辐射和凝胶纯化。这种技术的影响延伸到有问题的细菌感染的治疗，因为被确定为对感染或抗生素耐药性很重要的基因可以作为新型抗微生物治疗的目标。
该方法可以深入了解复杂的基因型、表型在克阴性细菌和克阳性细菌物种上的关系，并增进我们目前对细菌遗传学的理解。首先，将隔夜培养物转移到50毫升锥形管中，并在5000次G下使用离心培养物进行7分钟的颗粒。丢弃上一杯。
使用 10 毫升血清移液器将供体菌株颗粒重新悬浮在 4.5 毫升 LB 中，并辅以二米球酸。将重新悬浮的供体菌株转移到接受者应变管中。并立即将交配悬浮液作为单独的100微升液滴分配到LB加糖板上，辅以硅球酸在室温下孵育板30分钟。
然后，小心地将盘子转移到37摄氏度的培养箱，让培养物交配一小时。孵育后，将1.5毫升LB加入每个板，并将细菌收获到50毫升锥形管中。在5000次G下用离心对交配细胞进行7分钟的磨碎。
然后，丢弃上流液，在10毫升LB中重新悬浮细胞，以去除残留的二甲酸再次使细胞产生，然后用LB重复洗涤。完成后，使用10毫升血清移液器将颗粒重新悬浮在10毫升LB中，并辅以25%甘油。根据手稿指示将细胞铺在盘子上。然后，在37摄氏度，一夜之间孵育板。
创建剩余细菌的毫升等分，并将其储存在零下80摄氏度。把冷冻交配的一块倒在冰上。然后，使用无菌玻璃珠将150微升的稀释液，扩散到每30微升150毫米的Luria-Bertani阿加板上，辅以卡那霉素。
处理含有过量交配的已用管子，并在37摄氏度下孵育板14小时。孵育后计算每个板上的菌落形成单位，以估计转子库中的总突变体。计算至少三个板的 20%，以确定整个板块组的菌落计数估计值。
计算估计菌落产量后，在每个盘子中加入三到五毫升 LB，并使用无菌刮擦工具刮掉细菌。将所有板中的细菌悬浮液拉入 50 毫升锥形管中，并在 5000 次 G 下离心，将悬浮液放入 7 分钟。丢弃上流剂，在五毫升 LB 中重新悬浮颗粒，并辅以 30%甘油。
然后，在低温中制作一毫升的转子库，并将其储存在零下80摄氏度。用TE缓冲液稀释gDNA，浓度为每微升250纳米，总体积为200微升，并放在水浴声波器中。声波化DNA产生大约300个核苷酸的片段。
确认DNA通过运行10微升未听的DNA和10微升剪切DNA，在1%的猪烤凝胶上剪切。如果需要，请重复声波。要将波莉种子尾部添加到纯DNA的三个主要端，请设置文本手稿中描述的政策反应，并在37摄氏度下孵育反应管一小时。
为了净化政策反应，在每个样品中加入40微升大小选择顺磁珠，并旋转反应管。在室温下孵育样品五分钟。然后，短暂地离心，收集管底的液体。
将管子转移到磁架上，并在室温下孵育两分钟，或直到溶液清除。小心地去除上一杯，加入200微升新鲜准备好的80%乙醇，而不会干扰珠子。孵育样品，直到溶液清除。
然后取出上一液，重复乙醇洗涤。简要地将管子离心，并放回磁架中，以去除剩余的液体。在室温下孵育样品两到五分钟，让样品干燥。
在每个管中加入25微升水。旋转它们约五秒钟或移液器向上和向下。然后，离心管收集底部的液体。
将管子转移到磁架上，让它们坐约两分钟，直到溶液清除。然后，将上一液转移到新管中，而不干扰珠子。该协议用于在 A-baumannii 菌株 ATCC 17978 中生成高密度转子库，通过使用 E-coli MFD DAP auxotroph 的细菌结合，复制质粒 pJNW684。
拉的 A-baumannii 转波子突变库用于识别健身因子，对抗微生物亚抑制浓度下的科利丁耐药性非常重要。在消耗了导致高利辛耐药性的基因突变库后，其余库拉的总gDNA从控制和实验培养物中分离。gDNA被机械剪切碎片，并在DNA片段中加入政策尾部，为测序做准备。
计算了DNA浓度，并使用基于芯片的毛细管电泳对样品进行分析，以确认库构建成功。尝试此过程时，要记住的最重要的事情是根据特定目标菌株的 CFU 计数调整交配体积，以生成高分辨率突变库。此外，接受菌株必须对抗生素耐药性标记敏感，在突变发生前使用转子。
按照这个程序，可以执行基因删除或声音说法，以敲出单个头部从测序结果获得，并验证感兴趣的基因在挑战条件下。
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概述
本研究提出了一种在革兰氏阴性细菌中生成饱和转座子突变库的方法，重点关注鲍曼不动杆菌。该技术有助于识别对细菌感染的治疗策略至关重要的基因和抗生素耐药因素。
关键研究组成部分
研究领域
- 转座子诱变
- 抗生素耐药研究
- 微生物学
背景
- 识别感染期间与体内适应性相关的基因的重要性
- 抗生素耐药病原体带来的挑战
- 高通量测序在理解细菌遗传学方面的应用
使用的方法
- 基因组DNA和Poly-CTL版本的机械共享
- 鲍曼不动杆菌ATCC 17978菌株
- 通过细菌接合产生高密度转座子库
主要结果
- 成功创建了一个转座子突变库
- 识别了在抗生素压力下对适应性重要的基因
- 对复杂的基因型-表型关系有了洞察
结论
- 该研究展示了一种检查与感染相关的重要细菌基因的新方法
- 研究结果对开发新的抗微生物治疗药物有重要意义
常见问题
Executive Industry Relevance
High-density transposon insertion libraries in Gram-negative bacteria enable systematic identification of genetic determinants underlying antimicrobial resistance and bacterial fitness. This capability is critical for de-risking target selection and advancing predictive confidence in early-stage anti-infective discovery. The streamlined protocol supports portfolio-wide interrogation of resistance mechanisms in clinically relevant pathogens, directly impacting translational research and therapeutic innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide identification of essential genes and resistance determinants in Gram-negative bacteria.
- Supports functional target validation by linking genotype to phenotype under antibiotic challenge.
- Facilitates mechanistic de-risking for anti-infective target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant libraries for robust, reproducible high-throughput screening workflows.
- Provides quantitative outputs for comparative fitness analysis across genetic backgrounds.
- Standardizes library construction, improving scalability and cross-study comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic findings with disease-relevant resistance phenotypes in ESKAPE pathogens.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of antimicrobial targets.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting validated resistance mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a reusable platform for hypothesis-driven genetic interrogation in Gram-negative pathogens.
- Discovery Biology: Systematically tests gene function and resistance pathways under selective pressure.
- Screening: Delivers high-density mutant pools for scalable, quantitative fitness assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of mutant abundance and gene essentiality across conditions.
- Translational Research: Bridges genotype-phenotype mapping to preclinical model validation for resistance targets.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to multiple Gram-negative species, supporting broad anti-infective R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and resistance mechanism elucidation.
- Operational Value: Streamlines library generation, reducing cost and technical barriers to high-throughput genetic screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for anti-infective portfolios by clarifying mechanistic risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for therapeutic development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, high-throughput sequencing, and data analysis.
- Needs access to mechanical DNA shearing, capillary electrophoresis, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for library construction and fitness assays.
- Adaptable to diverse Gram-negative pathogens but may require optimization for specific strains.
- Dependent on accurate CFU quantification and antibiotic marker sensitivity for library quality.
