Name: 穆林切除伤口愈合模型与组织学形态性伤口分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学习小鼠全层切除伤口愈合模型与组织学形态计量分析方法。本技术利用连续切片对整个伤口进行精确测量，有效检测愈合缺陷，为皮肤再生研究提供可靠的定量评估工具。

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我们感谢Dunnwald实验室所有成员多年来为优化本实验方案所做出的贡献，特别感谢Gina Schatteman坚持不懈地推动使用连续切片技术进行伤口分析，使得本方案的建立成为可能。本研究工作获得了美国国立卫生研究院/国家关节与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）对Martine Dunnwald（项目编号：AR067739）的经费支持。

所有实验均按照联邦法规以及爱荷华大学的政策和程序进行，并已获得爱荷华大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 动物与饲养
<ol>
	<li>使用毛囊处于休止期的8-10周龄所需品系的成年小鼠。</li>
	<li>手术当天，将小鼠分至清洁笼具中单独饲养，以尽量减少对伤口的干扰。</li>
</ol>
2. 手术
注意：无需维持无菌手术条件。尽管应在动物之间注意保持无菌，但打孔活检本身是在洁净但非无菌的表面上进行的。每只动物的手术持续时间为10至15分钟。
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>将动物置于诱导室中麻醉1-2分钟，异氟烷蒸发器的流速设为4-5%，氧气流量计设为每分钟1升。有关其他麻醉方案，请参见讨论部分。</li>
		<li>在开始操作前确认麻醉效果充分。可通过牢固地捏压脚趾来判断麻醉深度。</li>
		<li>将小鼠从诱导室转移至鼻罩，并将异氟烷流速降至1.5%，氧气流量计调至0.5 L/min。</li>
		<li>由于操作时间超过5分钟，需在双眼涂抹眼用软膏。</li>
		<li>使用加热垫维持小鼠正常体温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伤口部位准备
	<ol>
		<li>使用电动理毛剪沿尾侧向头侧方向，剃除小鼠肩部背部的毛发。若需制作两个以上伤口，可根据需要进一步剃除背部下方的毛发。</li>
		<li>使用剃须刀片，以与小鼠背部成20˚角的方向，沿头侧向尾侧方向仔细刮净已剪毛区域的残留毛发（图1A）。</li>
		<li>用聚维酮碘棉签清洁剃净的皮肤区域。</li>
		<li>用无菌70%异丙醇预处理垫擦拭皮肤，以减少碘棉签可能引起的皮肤刺激。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>造模
	<ol>
		<li>在背部正中线肩胛骨之间捏起皮肤，将夹起的皮肤褶从身体上轻轻拉起（图1B）。</li>
		<li>将小鼠侧卧放置，使皮肤褶平展于铺有洁净纸巾或类似材料的平面上。在纸巾下方垫一层牙科蜡，以保护下方表面不被损伤（图1C）。</li>
		<li>将所需尺寸的皮肤活检打孔器尽可能贴近身体放置，并让皮肤自然放松。切勿拉伸皮肤，否则伤口尺寸将大于指定打孔器的尺寸（图1D）。</li>
		<li>向下按压完成打孔，可采用轻微 rocking（摇动）动作，以确保皮肤双侧各层均被完全穿透（图1E）。每只动物均应使用新的活检打孔器。</li>
		<li>从伤口中取出打孔组织（图1F）。若仍有组织连接，可使用无菌剪刀和镊子将打孔组织与周围皮肤分离。根据后续伤口愈合分析计划，对打孔活检对照组织进行相应处理（参见讨论部分的建议）。</li>
		<li>从与伤口相同距离的位置拍摄宏观照片，或在画面中包含标尺，以便测量初始伤口面积，并排除异常数据点。</li>
		<li>根据批准的动物实验方案，至少给予24小时镇痛处理。例如：缓释型布托啡诺SR-LAB，皮下注射单次剂量0.5–2 mg/kg，可提供48小时镇痛（其他替代方案和注意事项参见讨论部分）。</li>
		<li>在小鼠苏醒过程中持续监测，直至其能够保持直立姿势并在笼内正常行走。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 创伤后监测
<ol>
	<li>根据研究者确定的实验终点，并按照机构规程进行每日监测小鼠状况。示例包括：感染、明显体重减轻或弓背姿势。</li>
	<li>以与初次手术后相同的标准方式，每日进行宏观拍照记录。</li>
</ol>
4. 伤口取材
<ol>
	<li>在符合批准的动物实验方案的前提下，于损伤后预定时间点处死小鼠。</li>
	<li>以与先前拍摄照片一致的方式，对伤口部位进行标准化的大体摄影图2A，C).</li>
	<li>使用解剖刀在伤口周围切取一个较大的矩形区域（图2D，E).</li>
	<li>使用剪刀和镊子将皮肤从下方组织上剥离并剪开，游离出一块矩形组织图2F)。&#160;&#160;置于培养皿中（图 2G).</li>
	<li>收获伤口。将伤口周围各侧未受伤组织修剪成矩形，保留2 mm宽。&#160;(图2H，I）。参见 讨论 以获取伤口样本的替代方案。</li>
	<li>根据后续研究的需要处理伤口。每只小鼠至少保留一个伤口用于石蜡包埋及组织学分析。</li>
</ol>
5. 伤口固定与包埋
<ol>
	<li>固定伤口
	<ol>
		<li>将伤口组织置于新配制的4%多聚甲醛溶液中，在室温下固定3小时，然后转移至4 ˚C过夜。无需使用电镜级多聚甲醛，也不需过滤溶液8。</li>
		<li>用1×PBS洗涤伤口两次，每次30分钟。</li>
		<li>用70%乙醇替换PBS，并在4 ˚C保存直至包埋。若需检测抗原，应在24–48小时内处理组织以避免抗原丢失；若仅评估组织学特征，则可在1–2周内处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理并包埋伤口
	<ol>
		<li>将每个伤口转移至包埋盒中。使用铅笔标记包埋盒，因为后续处理过程会去除墨水痕迹。</li>
		<li>通过逐步提高乙醇浓度进行脱水、二甲苯透明，最后用石蜡浸润组织，完成组织处理；此过程可手动或使用自动组织处理机进行（表1）。</li>
		<li>将伤口以90˚（“直立”）方向嵌入包埋模具的水平面中（图3A,B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 第0天伤口面积分析
<ol>
	<li>下载 NIH-Image J 或 NIH-Fiji 免费软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）。</li>
	<li>打开一张包含第 0 天伤口照片的文件。</li>
	<li>在 分析 | 设定测量值 下方勾选“面积”选项。</li>
	<li>在 分析 菜单中选择“设定比例尺”。如果研究中包含宏观测量，请输入像素距离、对应的实际距离以及距离单位（= 长度单位）；若仅需相对测量，则可跳过此步骤。</li>
	<li>在 Fiji 工具栏中选择“自由手绘选区”。</li>
	<li>勾勒出伤口的周长轮廓。</li>
	<li>点击 分析 菜单下的 测量。</li>
	<li>创建一个电子表格，用于记录每只动物每个伤口的测量数据。</li>
	<li>将测得的伤口面积复制到电子表格中。</li>
	<li>计算特定实验中所有伤口的平均面积及标准差。</li>
	<li>将超出平均值两个标准差范围的任何伤口从组织学分析中剔除。</li>
</ol>
7. 连续切片
<ol>
	<li>将包埋石蜡的伤口组织块在 4 ˚C 下冷藏过夜。</li>
	<li>将石蜡块安装在切片机的样品夹上，并调整方向，使刀片能够垂直切割组织块。调整石蜡块的方向，使组织“直立”于 90˚，以便同时切到表皮和真皮（图 3C,D）。</li>
	<li>制备 2–4 条包含 20–30 个切片的石蜡切片带，每个切片厚度为 7 µm。</li>
	<li>使用干燥的画笔和解剖剥离针，将每条切片带转移至一个坚固且便于操作的表面，例如硬质黑色塑料板。</li>
	<li>用剃刀刀片分离每条切片带的最顶层切片，并将其放置在显微镜载玻片上。</li>
	<li>在明场显微镜下观察未染色切片，确定哪些切片包含伤口组织；伤口组织可通过毛囊缺失、结缔组织或表皮形态改变和/或痂皮的存在来识别（图 4A,B）。</li>
	<li>丢弃伤口起始前最多 20 个未受伤组织切片。</li>
	<li>重复步骤 7.3 和 7.4，连续切片通过整个伤口区域，直至未染色切片中不再检测到伤口组织为止。</li>
</ol>
8. 石蜡切片的封片
<ol>
	<li>每隔5张切片用刀片分离一次石蜡切片，从第一条切带开始图3E).</li>
	<li>在显微镜载玻片上标记载玻片编号以及所有切片编号。</li>
	<li>用湿润的画笔夹取一组5个切片，漂浮于温水浴（40–45 °C）的水面上 &#730;C）将其展平。</li>
	<li>从水浴中使用一个已标记的载玻片取出一组5个切片图3F）并置于设定为37℃的载玻片加热台上 &#730;C，最长可达24小时。</li>
	<li>将载玻片直立存放于载玻片盒中。</li>
</ol>
9. 组织学染色
<ol>
	<li>每8个转移一次th 显微镜载玻片（相当于每40个）th 将石蜡切片置于染色架上，进行苏木精-伊红染色。</li>
</ol>
10. 显微成像
<ol>
	<li>使用配备 4x 物镜和数字成像功能的明场显微镜采集图像。记录图像拍摄时的标尺尺度。</li>
	<li>对每张染色切片最顶层切面的整个伤口区域进行成像，并确保包含两侧部分未受伤的组织。若伤口范围大于单张图像视野，应拍摄多张重叠图像。</li>
	<li>保存文件时需包含切片编号，用于形态计量分析。同一伤口的多张重叠图像应以切片编号后接 a、b、c 等字母进行标记。</li>
</ol>
11. 形态计量分析
注意：当伤口跨越多张图片时，应将从各单独图片中测得的数据相加，得到每个伤口切片每项指标的一个数值，并记录在电子表格中。
<ol>
	<li>在 Image J 中打开一张染色伤口图片的数字文件。分析时不要使用拼接的图片。通过寻找标记点，在放大后的重叠图片之间连续进行测量，以便在不同图片间衔接测量起点和终点。</li>
	<li>设置标尺和测量参数。
	<ol>
		<li>在 分析 菜单下选择“设置标尺”。输入像素距离、对应的已知距离以及距离单位（= 长度单位）。标尺应显示在窗口中，并与图像采集时的实际标尺一致。</li>
		<li>勾选“全局”选项，使每个打开的图像均使用相同的标尺。</li>
		<li>每次关闭并重新打开 Image J 时，均需重复步骤 11.2.1 至 11.2.2。</li>
		<li>在 分析 | 设置测量 中勾选“面积”选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量伤口长度
	<ol>
		<li>在 Fiji 工具栏中选择“自由选区”工具。</li>
		<li>从伤口一侧未受伤组织的最后一个毛囊开始，测量至另一侧未受伤组织的第一个毛囊（图 4A,B）。</li>
		<li>沿真皮-表皮交界处追踪以到达这两个标记点。若表皮未完全覆盖伤口，则沿伤口一侧的真皮-表皮交界处追踪，当迁移的表皮舌终止时，继续沿肉芽组织的上表面或肉芽组织与痂之间的交界追踪，直至到达对侧的表皮舌，最终抵达另一侧未受伤组织的第一个毛囊（图 4E,F）。</li>
		<li>在 分析 菜单下点击 测量。测量长度将以设定的标尺单位显示。</li>
		<li>创建一个电子表格以记录测量数据（补充表 1）。</li>
		<li>将测得的伤口长度复制到电子表格中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量表皮长度
	<ol>
		<li>若表皮完全覆盖伤口，则表皮长度与伤口长度相同。
		<ol>
			<li>将“伤口长度”测量值复制到 Excel 电子表格的“表皮长度”列中，并跳至步骤 11.5。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若表皮未完全覆盖伤口，则选择“自由选区”工具，沿肉芽组织的上表面或肉芽组织与痂之间的交界，测量从每一侧表皮前沿至第一个毛囊的距离（图 4C,D）。
		<ol>
			<li>在 分析 菜单下点击 测量。</li>
			<li>从伤口长度中减去该测量值，并将结果记录在电子表格的“表皮长度”一栏中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量伤口面积
	<ol>
		<li>在 Fiji 工具栏中选择“自由选区”工具。</li>
		<li>从伤口一侧未受伤组织的最后一个毛囊开始，测量至另一侧未受伤组织的第一个毛囊（图 4A,B,E,F）。</li>
		<li>沿表皮的上表面（不包括痂）进行追踪；若伤口未被表皮完全覆盖，则沿肉芽组织的上表面追踪。</li>
		<li>当到达对侧毛囊后，继续垂直向下沿毛囊进入肉芽组织，直至到达脂肪组织或肌肉。沿肉芽组织的下边界追踪至伤口对侧，再沿毛囊返回起点，闭合所选区域（图 4E,F）。</li>
		<li>在 分析 菜单下点击 测量。</li>
		<li>将测得的伤口面积复制到电子表格的“测得伤口面积”一栏中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量表皮面积
	<ol>
		<li>在 Fiji 工具栏中选择“自由选区”工具。</li>
		<li>若伤口已完全上皮化：
		<ol>
			<li>沿表皮上表面追踪，直至对侧毛囊，再沿表皮与真皮之间的真皮-表皮交界“返回”至起点，以闭合区域（图 4D）。</li>
			<li>在 分析 菜单下点击 测量。</li>
			<li>将测得的表皮面积复制到 Excel 电子表格的“测得表皮面积”一栏中，并跳至步骤 11.7。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若伤口未完全上皮化：
		<ol>
			<li>沿表皮上表面追踪至表皮前沿，再沿真皮-表皮交界返回至起点（图 4C）。</li>
			<li>在 分析 菜单下点击 测量。</li>
			<li>在伤口对侧重复步骤 11.6.3.1 和 11.6.3.2。</li>
			<li>在 分析 菜单下点击 测量。</li>
			<li>将步骤 11.6.3.2 和 11.6.3.4 所得的两个数值相加，将结果填入电子表格的“测得表皮面积”一栏中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每第 40th 个切片&#160;（即每第 8th 张玻片）上重复步骤 11.3 至 11.6。</li>
	<li>计算整个伤口的表皮面积。
	<ol>
		<li>在电子表格中“表皮长度”旁新建一列“计算表皮面积”。</li>
		<li>对除最后一张切片外的每一张切片，将“表皮长度”数值乘以 280（7 µm 厚切片 × 40 张切片）。</li>
		<li>对最后一张切片，将“表皮长度”数值乘以 7（切片厚度）。</li>
		<li>将每张切片的“计算表皮面积”数值相加，得到整个伤口的表皮面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算整个伤口的伤口面积。
	<ol>
		<li>使用伤口长度测量值重复步骤 11.8.1 至 11.8.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算整个伤口的表皮体积。
	<ol>
		<li>使用“测得表皮面积”测量值重复步骤 11.8.1 至 11.8.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算整个伤口的伤口体积。
	<ol>
		<li>使用“测得伤口面积”测量值重复步骤 11.8.1 至 11.8.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算伤口中表皮体积的百分比。
	<ol>
		<li>将总表皮体积除以总伤口体积，再乘以 100，得到百分比（无需对每张切片单独计算该比值）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算伤口面积中表皮面积的百分比。
	<ol>
		<li>将总表皮面积除以总伤口面积，再乘以 100，得到百分比。若伤口已完全上皮化，该数值应为 100。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

双侧切除性伤口模型是一种高度可定制的实验方法，可用于研究伤口愈合的多种不同方面。在开展伤口愈合研究项目之前，研究人员应进行功效分析，以确定检测特定效应大小缺陷所需的伤口数量。目前文献中对于应将单只小鼠还是单个伤口作为生物学重复存在不一致，但最近一项研究表明，同一只动物身上的两个伤口之间不存在显著相关性4。这表明来自同一只动物的伤口彼此独立，可被视为生物学重复，从而减少检测缺陷所需的小鼠数量。当研究效应较小、需要大量伤口才能达到统计学显著性时，这一点尤为重要4。此外，功效计算的结果可能会影响每只动物身上制造的伤口数量，目前每只动物制作2个或4个伤口最为常见。
手术方案本身也具有高度灵活性。尽管我们推荐使用异氟烷挥发器进行麻醉，因为手术时间短且恢复迅速（每只小鼠约10–15分钟），但对于没有挥发器的实验人员，也可选用注射类麻醉剂，如氯胺酮/赛拉嗪或戊巴比妥钠。选择合适的镇痛药物尤为关键，因其与伤口愈合的炎症阶段密切相关。应谨慎使用非甾体抗炎药（NSAIDs），例如氟尼辛葡甲胺或美洛昔康，因为...

皮肤伤口愈合是一个具有依次重叠阶段的复杂生物学过程。该过程需要协调在时间和空间上受到调控的细胞与分子事件，以恢复受损上皮的屏障功能。在第一阶段即炎症阶段，中性粒细胞和巨噬细胞迁移至伤口部位，激活局部和全身防御机制1。增殖阶段紧随炎症阶段并与其部分重叠，成纤维细胞开始快速增殖并迁移至肉芽组织中。远离伤口前沿的角质形成细胞定向向伤口方向增殖，同时前沿处已分化的角质形成细胞迁移以实现伤口再上皮化2。最后进入重塑与成熟阶段，在此期间肉芽组织中的成纤维细胞开始合成并沉积胶原蛋白。新生基质的重塑与有序排列可在损伤后持续长达1年3。由于涉及多种细胞类型间相互作用的事件高度复杂且相互重叠，尽管已有多年研究，伤口愈合过程中许多细胞与分子机制仍尚未完全阐明。
小鼠模型是研究伤口愈合机制的主要哺乳动物模型，因其使用方便、相对成本较低且具有遗传可操作性1,4,5。尽管已有多种类型的伤口在小鼠模型中被描述，但最常见的是切除性伤口（包括双侧打孔或直接打孔活检），其次是切开性伤口模型4。与切开性模型相比，切除性伤口模型具有明显优势，因为它天然地提供了未经历愈合过程的对照组织。作为手术操作的一部分所切除的打孔活检组织，可以与受伤组织以相同的方式进行处理，用于确立特定指标的稳态条件。此外，在评估皮肤预处理效果或确认损伤时基因修饰是否成功的情况下，切除的对照组织也可能具有重要用途4。
可通过多种不同技术评估愈合参数，包括平面测量法或组织学方法。然而，平面测量法仅能评估伤口的可见特征，且由于存在痂皮，其测量结果常与组织学观察到的愈合情况不一致，因此组织学被视为分析的“金标准”4。尽管组织学分析是金标准，但通常仅针对伤口的任意子区域进行6,7。例如，目前常见的做法是在包埋和切片前将伤口“对半”切开，以减少切片制备和数据分析所耗费的时间与资源。本方案中描述的形态计量分析方法旨在涵盖整个伤口组织，以准确反映伤口的形态学特征，并提高检测出具有较小效应量的伤口愈合缺陷的可能性。在本方案中，我们详细介绍了生成最常研究的小鼠伤口——双侧全层切除性伤口的手术方法，以及一种在该领域中极少使用的详尽且严谨的组织学分析方法。

<table><tbody><tr><td>100% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精预处理剂</td><td>NOVAPLUS</td><td>V9100</td><td>70% 异丙醇，无菌</td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>活检垫片</td><td>Cellpath</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>黑色塑料板</td><td></td><td></td><td>大小约等于一张纸，质地坚硬但可操作</td></tr><tr><td>明场显微镜</td><td></td><td></td><td>具备数字成像功能和 4X 物镜</td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td></td><td>22 × 60 #1</td></tr><tr><td>牙科蜡片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td></td><td></td><td>如适用，应包含标尺以显示比例</td></tr><tr><td>解剖分离针（直头）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td></td><td></td><td>22 × 22 × 12</td></tr><tr><td>包埋环</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>M460</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛发剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Conair</td><td></td><td>干湿两用加热垫</td></tr><tr><td>苏木精</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡 Type 6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Aplicare</td><td>82-255</td><td></td></tr><tr><td>组织处理盒</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>M490-2</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>ASR</td><td></td><td>.009 常规规格</td></tr><tr><td>手术刀片 #10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>锋利的外科剪刀</td><td></td><td></td><td>无菌，用于手术</td></tr><tr><td>皮肤活检打孔器</td><td></td><td></td><td>尺寸由研究人员确定</td></tr><tr><td>载玻片盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片加热台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>防脱载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 037 246</td><td></td></tr><tr><td>温控水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织包埋工作站</td><td></td><td></td><td>至少包括石蜡分配器和冷台</td></tr><tr><td>组织处理仪</td><td></td><td></td><td>至少包括带真空泵的烘箱</td></tr><tr><td>三重抗生素眼膏</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子，弯头尖端</td><td></td><td></td><td>无菌，用于手术</td></tr><tr><td>镊子，锥形尖端</td><td></td><td></td><td>无菌，用于手术</td></tr><tr><td>WypAll X60</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34865</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠全层皮肤缺损伤口愈合模型及组织形态计量学伤口分析

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

小鼠切除性伤口模型已被广泛用于研究伤口愈合过程中依次重叠的各个阶段：炎症期、增殖期和重塑期。小鼠伤口具有组织学上定义清晰且易于识别的伤口床，便于对愈合过程的各个阶段进行量化测量。在该研究领域中，通常会任意选取伤口的“中点”进行组织学分析。然而，伤口是一个三维结构，且在组织学上往往并不对称，因此需要一种定义明确且稳健的定量方法，以检测具有较小效应量的形态计量学缺陷。在本实验方案中，我们描述了在小鼠身上制备双侧全层切除性伤口的操作步骤，并详细说明如何利用图像处理软件对选定的连续切片进行形态计量参数的测量。通过结合已知的切片间距，对伤口长度、表皮长度、表皮面积和伤口面积等二维测量值进行计算，进而推算出覆盖伤口的三维表皮面积、总体伤口面积、表皮体积和伤口体积。尽管这种详细的组织学分析比传统方法更耗时耗力，但其严谨性显著提高了在固有复杂的伤口愈合过程中发现新表型的可能性。

图5展示了由不同外科医生在不同小鼠品系中制造的野生型伤口，经多位研究人员进行形态测量分析后所得的实测值与计算值的范围。如我们在本研究及文献中所述9,10，不同品系的野生型小鼠可能表现出统计学上的差异。基于这些代表性结果，我们建议在同一项研究中仅使用同一品系的小鼠。尽管我们建议由同一名研究人员完成特定研究中的全部造模操作，但只要不同操作者在第0天所制造的伤口面积之间无统计学差异，也可由多名人员担任外科操作者。最后，由于本实验方案中描述的形态测量分析工作量较大，可由多名人员分别分析同一实验的部分数据，但前提是他们对两个样本的分析结果差异不得超过5%。然而，更理想的做法是由单一名研究人员以盲法方式完成所有伤口的分析，以避免偏倚。
图6 展示了一项荟萃分析，比较了按照本研究中所述方案获得的伤口测量数据11 通...

本方案描述了如何在小鼠身上制备双侧全层切除性伤口，以及如何随后对伤口进行监测、采集和处理，以进行形态计量学分析。文中还包括如何利用连续组织学切片精确定义、定量检测形态计量缺陷的详细说明。

小鼠切除性伤口模型已被广泛用于研究伤口愈合过程中相继重叠的各个阶段：炎症、...

本方案采用组织学分析方法，以获取小鼠切除性伤口的可靠形态计量学数据。利用该技术，我们可以通过一系列连续切片的子集来分析整个伤口，从而更准确地检测可能被遗漏的缺陷。本实验操作将由我实验室的研究助理 Lindsey Rhea 进行示范。在确认麻醉后的成年小鼠对足底反射无反应后，将眼膏涂抹于动物的眼睛，并使用电动推剪沿尾侧至头侧方向剃除小鼠肩部背部的毛发。用剃须刀片以与背部呈20度角的方向沿头侧至尾侧运动，去除暴露皮肤上残留的毛发，然后用一片聚维酮碘和一片70%异丙醇消毒垫擦拭清洁皮肤。为进行伤口诱导，将一张洁净的纸质毛巾铺在覆盖有牙科蜡的平坦表面上，将小鼠以俯卧位放置于毛巾上。用手指捏住小鼠肩胛骨之间的背部中线皮肤，将夹起的皮肤褶皱拉离身体。将小鼠转为侧卧位，将所需伤口大小的皮肤活检打孔器尽可能贴近身体放置，并让皮肤自然放松。采用 rocking motion（摇动方式）向下按压打孔器，穿透皮肤的所有层次，然后使用无菌剪刀和镊子从伤口处取出打孔活检组织，必要时分离周围皮肤，使打孔组织完全脱离。然后让小鼠在监测和镇痛条件下恢复。对于伤口床的形态计量分析，打开一张数字化的染色伤口图像。在“分析”菜单下选择“设置比例尺”，输入像素距离、已知距离以及长度单位，以设定比例尺和测量参数。选择“全局”和“确定”，以保持每张已打开图像的标尺一致；选择“分析”并点击“设置测量”，确认已勾选“面积”选项。测量伤口长度时，选择“自由手绘”工具，从伤口一侧未受伤组织的最后一个毛囊开始，沿真皮-表皮连接处进行描记，直至另一侧未受伤组织的第一个毛囊为止。如果表皮未完全覆盖整个伤口，则从伤口一侧迁移舌末端处的真皮-表皮连接开始，继续沿肉芽组织的上缘或肉芽组织与痂皮之间的交界处描记，直至到达伤口另一侧的迁移舌以及未受伤组织的第一个毛囊位置。然后点击“分析”和“测量”。测量长度将显示为与标尺设置相同的单位。如果表皮未覆盖整个伤口，则沿着肉芽组织的上缘或肉芽组织与痂之间的交界处，测量每个表皮前沿至第一个毛囊的距离。测量伤口面积时，使用手绘工具沿表皮上缘或肉芽组织上缘进行描记，从伤口一侧未受伤组织的最后一个毛囊开始，到另一侧未受伤组织的第一个毛囊为止。随后沿该毛囊垂直向下描记，进入肉芽组织。当到达对侧毛游戏副本和脂肪组织或肌肉时，沿肉芽组织的下缘继续描记至伤口对侧，最后沿毛囊返回起始点，闭合所围区域。如果伤口未完全上皮化，则沿表皮的上缘追踪至前沿，并沿真皮-表皮连接处返回起始点。如图所示，在对整个伤口进行二维测量时，我们能够计算出仅对伤口中部区域进行二维分析时无法获得的参数，而后者是该领域常用的分析方法。在本实验中，采用了对整个伤口或伤口中部子区域的二维伤口面积测量并取平均值，结果显示实验组之间或不同分析方法之间均无显著差异。然而，实验组之间的计算伤口体积存在显著差异，这表明对伤口愈合参数进行深入的组织学分析具有重要意义。为了获得准确的形态测量分析结果，生成大小一致的伤口并进行严格的连续切片至关重要。未染色切片可用于免疫荧光或Masson三色染色，以评估伤口愈合的其他方面；而速冻伤口组织则可与形态测量学方法结合，用于定量蛋白质分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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在本视频中，我们描述了一种在适当时间点分离结肠镜诱导的创面床以进行详细分子分析的方法。该分析有助于理解胃肠道炎症条件下创面愈合的过程。...

结肠镜引导的小鼠伤口模型：一种通过分离结肠活检诱导的伤口床以研究愈合过程的方法

一种可用于在生理和病理生理条件下评估治疗化合物的皮肤伤口愈合小鼠模型。...

小鼠伤口愈合模型

在哺乳动物发育过程中，早期妊娠阶段的皮肤伤口可以无瘢痕愈合。本文详细介绍了一种在E16.5（无瘢痕）和E18.5（有瘢痕）小鼠胚胎背部皮肤上建立胎儿无瘢痕伤口愈合的可靠且可重复的模型。...

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我们介绍一种非侵入性的体内成像方案，该方案流程简化且成本效益高，利用化学发光的鲁米诺类似物L-012，对小鼠全层皮肤缺损伤口模型中产生的活性氧（ROS）进行可视化和定量分析。...

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本文介绍了一种利用原代成纤维细胞进行体外划痕实验的方法，以及一种在小鼠中进行的体内皮肤伤口愈合实验方案。这两种实验均为评估体外和体内伤口愈合的简便方法。...

体外与体内伤口愈合分析的划痕迁移实验与背侧皮肤折叠腔技术

本文介绍了两种小鼠伤口愈合模型，一种用于评估细胞和细胞因子介导的伤口愈合反应，另一种用于量化伤口闭合速率。这些方法可与糖尿病等复杂疾病模型联合使用，以探究伤口愈合不良各个方面的潜在机制。...

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人皮肤离体伤口模型及全层染色方法用于精确评估皮肤修复

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小鼠伤口模型的建立与单细胞悬液的制备

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利用数字平面测量法评估小鼠模型中伤口闭合动力学

本文描述了一种大鼠皮肤伤口模型，可在组织修复的不同阶段，在生理或病理条件下评估各种治疗剂的效果。此外，还详细介绍了通过手动平面测量法监测组织修复过程中伤口收缩率的实验方案。...

一种大鼠外科皮肤伤口模型：用于伤口愈合研究与生物材料评估的方法

学习小鼠全层切除伤口愈合模型与组织学形态计量分析方法。本技术利用连续切片对整个伤口进行精确测量，有效检测愈合缺陷，为皮肤再生研究提供可靠的定量评估工具。

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