小鼠全层皮肤缺损伤口愈合模型及组织形态计量学伤口分析

本方案采用组织学分析方法，以获取小鼠切除性伤口的可靠形态计量学数据。利用该技术，我们可以通过一系列连续切片的子集来分析整个伤口，从而更准确地检测可能被遗漏的缺陷。本实验操作将由我实验室的研究助理 Lindsey Rhea 进行示范。

在确认麻醉后的成年小鼠对足底反射无反应后，将眼膏涂抹于动物的眼睛，并使用电动推剪沿尾侧至头侧方向剃除小鼠肩部背部的毛发。用剃须刀片以与背部呈20度角的方向沿头侧至尾侧运动，去除暴露皮肤上残留的毛发，然后用一片聚维酮碘和一片70%异丙醇消毒垫擦拭清洁皮肤。为进行伤口诱导，将一张洁净的纸质毛巾铺在覆盖有牙科蜡的平坦表面上，将小鼠以俯卧位放置于毛巾上。

用手指捏住小鼠肩胛骨之间的背部中线皮肤，将夹起的皮肤褶皱拉离身体。将小鼠转为侧卧位，将所需伤口大小的皮肤活检打孔器尽可能贴近身体放置，并让皮肤自然放松。采用 rocking motion（摇动方式）向下按压打孔器，穿透皮肤的所有层次，然后使用无菌剪刀和镊子从伤口处取出打孔活检组织，必要时分离周围皮肤，使打孔组织完全脱离。

然后让小鼠在监测和镇痛条件下恢复。对于伤口床的形态计量分析，打开一张数字化的染色伤口图像。在“分析”菜单下选择“设置比例尺”，输入像素距离、已知距离以及长度单位，以设定比例尺和测量参数。

选择“全局”和“确定”，以保持每张已打开图像的标尺一致；选择“分析”并点击“设置测量”，确认已勾选“面积”选项。测量伤口长度时，选择“自由手绘”工具，从伤口一侧未受伤组织的最后一个毛囊开始，沿真皮-表皮连接处进行描记，直至另一侧未受伤组织的第一个毛囊为止。如果表皮未完全覆盖整个伤口，则从伤口一侧迁移舌末端处的真皮-表皮连接开始，继续沿肉芽组织的上缘或肉芽组织与痂皮之间的交界处描记，直至到达伤口另一侧的迁移舌以及未受伤组织的第一个毛囊位置。

然后点击“分析”和“测量”。测量长度将显示为与标尺设置相同的单位。如果表皮未覆盖整个伤口，则沿着肉芽组织的上缘或肉芽组织与痂之间的交界处，测量每个表皮前沿至第一个毛囊的距离。

测量伤口面积时，使用手绘工具沿表皮上缘或肉芽组织上缘进行描记，从伤口一侧未受伤组织的最后一个毛囊开始，到另一侧未受伤组织的第一个毛囊为止。随后沿该毛囊垂直向下描记，进入肉芽组织。当到达对侧毛游戏副本和脂肪组织或肌肉时，沿肉芽组织的下缘继续描记至伤口对侧，最后沿毛囊返回起始点，闭合所围区域。

如果伤口未完全上皮化，则沿表皮的上缘追踪至前沿，并沿真皮-表皮连接处返回起始点。如图所示，在对整个伤口进行二维测量时，我们能够计算出仅对伤口中部区域进行二维分析时无法获得的参数，而后者是该领域常用的分析方法。在本实验中，采用了对整个伤口或伤口中部子区域的二维伤口面积测量并取平均值，结果显示实验组之间或不同分析方法之间均无显著差异。

然而，实验组之间的计算伤口体积存在显著差异，这表明对伤口愈合参数进行深入的组织学分析具有重要意义。为了获得准确的形态测量分析结果，生成大小一致的伤口并进行严格的连续切片至关重要。未染色切片可用于免疫荧光或Masson三色染色，以评估伤口愈合的其他方面；而速冻伤口组织则可与形态测量学方法结合，用于定量蛋白质分析。