一种用于大规模表观遗传学研究的半自动化ChIP-Seq实验流程

该方案的意义在于，它能够对原始样品进行高通量的ChIP-Seq分析，从而更深入地理解顺式调控机制及其在疾病中的作用。该方法的主要优势在于数据的可重复性，以及显著减少实验操作时间。进行染色质剪切时，向经甘氨酸固定、速冻并解冻的目标细胞沉淀中加入70 µL新鲜的、室温的完全裂解缓冲液，在室温下孵育1分钟，随后无气泡地重悬1分钟。

将样品在室温下再孵育一分钟，然后将细胞置于冰上。将重悬的沉淀转移至冰上的 0.65 毫升低吸附离心管中，再将离心管放入超声破碎仪的管架上。用含有 70 微升水的平衡管填补空位，并在开始超声处理前，让细胞在水浴中稳定约一分钟。

经过三个循环后，将样品从超声仪中取出，轻轻涡旋混匀，并短暂离心管子，然后将其放回支架中。对于组蛋白修饰实验，向两个芯片八联管条的每管中加入 100 微升完整的 tC1 缓冲液，并将 16 个染色质共享样品中每个样品的 20 微升分别转移至芯片八联管条的各个管中。用 80 微升完整的 tC1 缓冲液洗涤染色质管，将洗涤液收集并合并至芯片八联管条对应的管中，使每管最终溶液体积为 200 微升。

将适量抗体加入500微升TBW1缓冲液中，迅速涡旋振荡并瞬时离心。然后向新的八联管条的每管中加入70微升tBW1和30微升抗体溶液。接下来，充分涡旋混匀蛋白A磁珠溶液，并根据每0.5微克抗体加入5微升磁珠的比例，将磁珠加入新的八联管条中。

脉冲离心珠子条带，然后在芯片液体处理装置的最后一行放入已标记的空芯片八管条带。接着按照芯片16-I纯化200 D程序的要求放置其余条带，并将缓冲液加载至正确位置。测序后，将珠子用八管条磁铁捕获，并向每管转移25 µL片段化缓冲液。

将离心管从磁力架上取下，轻轻混匀，直至磁珠溶液均匀，然后将重新盖紧的离心管放入预热的ThermoMixer中孵育3分钟。孵育结束后，取出芯片液体处理仪最后一排的8联管条，向每个样本中加入2 µL Rnase A。随后对重新盖紧的离心管进行瞬时离心，并轻轻混匀，直至磁珠溶液均匀。

为纯化经标签化处理的DNA片段，将100微升D交联的DNA样品分别转移至各1.5毫升离心管中，并用100微升DNA结合缓冲液洗涤每根离心管。短暂离心洗涤液至相应离心管中，然后将样品加载至层析柱上。将层析柱放入新的1.5毫升收集管中，并直接向层析柱基质中加入9微升55摄氏度的Tris-EDTA缓冲液。

一分钟后，离心纯化柱，将每个纯化柱中的九微升洗脱液转移至冰上新的八联管中。再次用八微升Tris-EDTA缓冲液洗脱DNA片段，并将洗脱液与先前收集的DNA片段溶液合并。为扩增纯化的DNA片段样品，使用多通道移液器混匀样品，并根据需要的循环数进行扩增程序。

扩增后，使用板式磁铁捕获磁珠，并弃去上清液。每次用200 µL新鲜的80%乙醇洗涤磁珠，共洗涤三次，注意不要扰动磁珠沉淀。最后一次洗涤后，用20 µL移液枪尖头吸除多余的乙醇，并将磁珠干燥10分钟，或直至磁珠沉淀出现裂纹。

向每个干燥样品中加入 40 µL 预热的水，密封后充分涡旋振荡，并短暂脉冲离心。然后根据标准操作流程，使用荧光定量检测法对 DNA 进行定量。剪切后的染色质片段大小检测结果显示高度可重复性，14 个循环中超过 70% 的样品片段长度在 100 至 500 个碱基对之间。

如图所示，当经标签化（tagmented）样本的信号强度达到平均最大值一半时所对应的循环数，是确定最佳循环数的理想依据。当超过85%的DNA片段长度在200至1000个碱基对之间时，可获得最佳的测序数据。在这些代表性的四个基因位点富集轨迹图中，各样本的独立轨迹均显示出较高的比对质量和信噪比。

前两个位点在这些细胞类型中包含表达水平较高的基因，而后两个位点中的基因不表达，用作背景对照。在大多数成对比较中，皮尔逊相关系数显示相关性超过90%，表明生物学重复之间具有高度一致性。虽然细胞类型特异性位点在相应细胞中表现出高度富集，但看家基因显示出非常一致的组蛋白修饰。

使用少于100,000个细胞的样品进行的ChIP-Seq数据集之间的相关性分析仍表现出高度的可重复性，且在低至10,000个细胞时仍具有较高的相关性。然而，随着细胞数量的减少，背景信号有所增加，同时相关系数也有所下降。充分裂解细胞对于生成高质量数据至关重要，因为我们发现细胞裂解不完全会影响后续实验步骤的进行。

利用该方法，可对多种不同组蛋白修饰和转录因子在各类目标细胞类型中进行检测，以进一步加深对顺式调控元件的理解。