重建线粒体膜动力学的模型膜平台
2020年9月2日
线粒体融合是线粒体动力学基础的重要恒态反应。这里描述的是 一个体外 重组系统，研究线粒体内膜融合，可以解决膜系绳、对接、血融液和孔隙开口。讨论了该方法在探索细胞膜系统的多功能性。
在这个粒子中，我们引入了一个体外重组平台，它模仿线粒体内膜的脂质环境。该平台可用于研究线粒体内膜融合的分子机制。该技术的主要优点是，它允许定量研究在近本地环境中的整片膜蛋白和膜相关蛋白。
首先，根据手稿方向混合溶液 A 和 B，然后通过玻璃注射器将计算的存储溶液体积添加到琥珀小瓶中，生成脂质混合物。通过将额外的氯仿添加到小瓶中来匹配最终体积。将显微镜盖玻璃在 520 摄氏度下烘烤 30 分钟。
烘烤后，冷却至室温。搅拌时加入约10克氢氧化钠至500毫升甲醇。搅拌两小时，继续向溶液中加入氢氧化钠，直到沉淀开始显示。
在10%的硫酸钠溶液中清洁玻璃滑梯，用氢氧化钠饱和的甲醇和50毫摩尔盐酸，按顺序将幻灯片在每种条件下的声波洗30分钟。在每种情况下，用超纯水清洁玻璃滑梯 10 分钟。将清洁的盖玻璃密封在盐酸溶液中长达两周，以确保良好的双层质量。
使用氯仿和超纯水清洁朗穆尔-布洛杰特浸渍系统的聚四氟乙烯槽，直到未观察到湿润。在槽面上喷洒氯仿，用纤维素湿巾彻底擦拭三次，然后用超纯水冲洗三次，然后通过吸水去除水。完成后，用干净的超纯水覆盖槽表面。
从清洁溶液中拿两块表面处理的盖玻璃，用超纯水冲洗约 30 秒。使用基板夹将盖玻璃以背对背的方式放置，以固定玻璃滑梯。手动单击兰穆尔控制系统上的浸渍器，将玻璃滑梯浸入水面下方。
零膜平衡，并小心地在空气水界面上一滴一滴地铺开溶液B。确保脂质仅在空气水界面扩散，没有氯仿和脂质液滴沉入聚四氟乙烯表面的底部，这将形成脂质通道并防止单层形成。当薄膜平衡读数约为每米 15 到 20 毫微时，请停止添加脂质。
等待 10 到 15 分钟，然后启动屏障控制器，通过单击"开始实验"来更改表面积。等待薄膜平衡读数升高至每米 37 毫纽顿，并保持大约 20 到 30 分钟的压力。将盖玻璃以每分钟 22 毫米的速度升起，同时保持表面张力为 37 毫纽顿/米。
带聚合物系绳的脂质单层通过Blodgett浸渍工艺从空气水界面转移到盖玻璃表面，形成脂质双层层的底部传单。通过吸气清洁空气水接口，然后用超纯水冲洗槽。用氯仿、乙醇和超纯水清洗单井玻璃滑梯后，将其放在水层下方的槽上。
确保井朝向空气水接口，倒入新鲜的超纯水，直到玻璃滑梯完全覆盖，然后如前所述，将玻璃滑梯浸入水面下。使用硅吸盘用脂质单层握住盖玻璃，轻轻将脂质单层推到空气水界面。将盖玻璃在界面上握住两到三秒钟，然后将其推到幻灯片上。
用盖板把幻灯片拿出来。将盖玻璃和双层到荧光显微镜，根据文本手稿方向对脂质双层层进行成像。准备含有超纯水的结晶盘，并在盘子下面放置一个干净的显微镜图像环。
浸入这张幻灯片和盖玻璃，其中含有水底下的脂质双层玻璃。轻轻地将幻灯片和盖板分开，将盖板幻灯片从底部按住，然后将盖板玻璃转移到图像环中。用双三氯化钠缓冲液替换图像环中的超纯水，确保脂质双层层不会暴露于任何气泡。
将1.1纳米摩尔n-八基-β-葡萄糖-甲酸酯加入脂质双层层，然后立即将1.2纳米摩尔DDM和1.3个纯化L-OPA1的混合物加入图像环中。在低速的台式摇床上孵育样品两小时。将 30 毫克 SM-2 树脂珠分到三毫升双三分之一缓冲液中，然后摇动。
使用塑料移液器将 5 至 10 微升 SM-2 树脂珠添加到图像环中，并孵育 10 分钟，然后冲洗树脂珠。图像环中缓冲区的最终体积应为 1.5 毫升。在氯仿溶液中准备一毫克脂质混合物 A，然后在氮流下蒸发氯仿20分钟。
将混合物在真空下过夜，形成脂质膜。在 50 毫升 1.5 摩尔氢氧化钠溶液中溶解 15.56 克钙素，以补充含有缓冲液的 50 毫摩尔钙。在室温下搅拌混合物，直到钙化物完全溶解。
加入12.5毫摩尔二三和超纯水，最终体积为500毫升，并将pH调至7.5。在含有缓冲液的钙化物中分配脂质膜，然后在65摄氏度下加热悬浮液20分钟，使脂质完全合合。通过聚碳酸酯膜的挤出形成200纳米脂质体。
在0.5微摩尔DDM中加入两微克L-OPA1，2.2毫克脂体，在4摄氏度下孵育溶液1.5小时。用透析去除表面活性剂，用3.5千吨透析盒对250毫升25毫升的二分之二，150毫升氯化钠，和50毫摩尔钙缓冲液在4摄氏度过夜，改变缓冲液两次。使用 PD10 脱盐列删除额外的钙化物，然后按照文本手稿中所述进行成像和数据分析。
此处显示了脂质双层的荧光显微镜图像及其脂质流动性。脂质分布在照片漂白前和之后显示，均匀性在重组前和重组后显示。L-OPA1重组和脂质双层通过荧光相关光谱或FCS进行验证。
FCS 曲线表明，75% 的 L-OPA1 被重组到脂质双层层中，表明 L-OPA1 在聚合物系绳脂双层中自由扩散，具有自组装成功能复合物的潜力。荧光步漂白表明，在给定的脂体中平均重组了两到三份L-OPA1。使用DLS重组后对L-OPA1重组蛋白体的大小分布进行了测试，并使用FCS进行了验证。
使用TIRF显微镜观察脂质双层表面的德州红信号，监测膜系绳。膜脂质脱混或半液通过德州红监测，脂质体标记扩散到脂质双层。钙化物去淬火有助于区分完全融合孔径的形成和仅脂质脱混，从而可以比较粒子在半边输液时停止的条件和进入完全融合的粒子。
膜系绳由脂质体的稳定脂质信号表示，输液信号在钙蛋白信号中没有脱吸，但德州红信号的快速衰减表明染料扩散到脂质双层。完全融合的特点是脂质衰变和内容释放。尝试这种颗粒时，请记住彻底清洁盖玻璃和朗穆尔槽，以确保制造高质量的两层。
良好的空气质量对于防止双层缺陷也至关重要。这项技术为我们探索线粒体膜动力学和组织的新问题铺平了道路。令人兴奋的未来实验包括探索双层不对称、膜电位和疾病相关突变体在线粒体内膜动力学中的影响。
概述
本文介绍了一个用于研究线粒体内膜融合的体外重建平台。该系统允许对涉及线粒体动力学的分子机制进行研究，特别关注膜系留、对接、半熔合和孔开放。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 线粒体动力学
背景
- 线粒体融合对于维持线粒体功能至关重要。
- 了解融合机制可以提供有关细胞健康的洞见。
- 该研究使用模拟线粒体内膜的脂质环境。
- 这种方法允许对膜蛋白进行定量分析。
研究目的
- 开发一个用于研究线粒体内膜融合的平台。
- 探索膜动力学的分子机制。
- 为整体膜蛋白提供近乎原生的环境。
使用的方法
- 脂质混合物的制备和玻璃片的清洁。
- 使用Langmuir-Blodgett蘸取系统进行脂质单层转移。
- 使用表面荧光显微镜对脂质双层进行成像。
- 将样品与特定蛋白和缓冲液孵育以进行分析。
主要结果
- 该平台成功模拟了线粒体内膜环境。
- 实现了膜融合事件的定量测量。
- 该研究突出了脂质组成在融合动力学中的重要性。
- 结果提供了有关融合过程中分子相互作用的见解。
结论
- 该体外系统是研究线粒体动力学的有价值工具。
- 研究结果有助于理解线粒体功能和健康。
- 这种方法可以适用于细胞生物学中的其他膜系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
This in vitro reconstitution platform enables quantitative analysis of mitochondrial inner-membrane fusion mechanisms in a near-native lipid environment. By isolating membrane protein dynamics from cellular complexity, the method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. It provides a scalable, reproducible system for evaluating therapeutic candidates that modulate mitochondrial dynamics, a key pathway in neurodegenerative and metabolic disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial fusion proteins like OPA1 under controlled lipid conditions to validate therapeutic targets.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying protein-lipid interactions in a defined system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of fusion intermediates and kinetics for assay standardization.
- Operational Value: Supports high-content screening of compounds affecting membrane tethering, hemifusion, or pore formation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant modeling using mutant proteins or asymmetric lipids to mimic pathophysiological states.
- Operational Value: Enables preclinical de-risking by establishing structure-function relationships for mitochondrial modulators.
Pipeline & Workflow Integration
The platform fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions in mitochondrial-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of fusion regulators by enabling direct observation of membrane remodeling events.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence-based readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides kinetic and stoichiometric data via fluorescence correlation spectroscopy and step bleaching to compare experimental conditions.
- Translational Research: Allows testing of disease-associated mutants in a controlled membrane environment to assess functional impact.
- Enterprise Reuse: The lipid bilayer system can be adapted to other organelle membranes, increasing platform utility across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false positives from cellular noise.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized lipid bilayer preparation and protein reconstitution.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage mechanistic screening before costly cellular or in vivo models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial modulators based on quantitative mechanism of action data.
Implementation Considerations
- Expertise in lipid bilayer formation and Langmuir-Blodgett techniques is required for reliable bilayer fabrication.
- Access to fluorescence correlation spectroscopy and TIRF microscopy is necessary for quantitative analysis of protein dynamics and membrane fusion.
- Standardization across teams depends on strict adherence to lipid composition, cleaning protocols, and buffer conditions.
- Adaptation to other membrane systems requires optimization of lipid ratios and protein detergents while maintaining bilayer integrity.
- Practical limitations include the technical complexity of bilayer setup and the need for specialized equipment, which may limit accessibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:37
Fabrication of Lipid Bilayers
4:41
Protein Reconstitution into the Polymer-tethered Lipid Bilayer
6:02
Preparation of Proteoliposomes
7:46
Results: Reconstituted Transmembrane Protein Diffusion and Detection of Membrane Tethering, Lipid Hemifusion, and Pore Opening
9:42
Conclusion
