Name: 重建线粒体膜动力学的模型膜平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 了解线粒体内膜融合的体外重组平台技术，使用Langmuir-Blodgett系统和荧光显微镜定量分析膜蛋白动态。该方法为研究线粒体膜动力学和细胞健康机制提供了近天然环境的实验工具。

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作者感谢查尔斯·H·胡德基金会儿童健康研究奖以及马萨诸塞州总医院分子生物学系的大力支持。

1. 脂质混合物的制备
<ol>
	<li>通过将1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）、L-α-磷脂酰肌醇（肝来源PI）、心磷脂以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基聚乙二醇-2000]（18:1 PEG2000 PE）溶解于氯仿中，配制脂质储备液，终浓度为25 mg/mL。将荧光染料标记的脂质（TexasRed DHPE 和 Cy5 DOPE）以1 mg/mL的浓度溶于氯仿中。将脂质溶液储存于棕色瓶中，瓶塞需耐氯仿，并用聚四氟乙烯胶带进一步密封。溶液可在-20 °C下保存长达6个月。</li>
	<li>配制溶液A和溶液B。
	<ol>
		<li>混合脂质以制备溶液A（终浓度1 mg/mL），其中包含DOPC（52.8 mol%）、POPE（20 mol%）、肝来源PI（7 mol%）、心磷脂（20 mol%）以及0.2 mol%荧光染料。</li>
		<li>配制溶液B（终浓度1 mg/mL），其中包含DOPC（47.8 mol%）、POPE（20 mol%）、肝来源PI（7 mol%）、心磷脂（20 mol%）、DOPE-PEG2000（5 mol%）以及0.2 mol%荧光染料。</li>
		<li>使用玻璃注射器将计算体积的储备液加入棕色瓶中以制备脂质混合物。通过向瓶中添加额外的氯仿调节至最终体积。 
		注意：用于荧光相关光谱（FCS）时，将荧光染料标记脂质的比例降低至0.002 mol%，并用DOPC补足其余部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脂质双层的制备
<ol>
	<li>将显微镜盖玻片在 520 °C 下烘烤 30 分钟。烘烤后，将盖玻片冷却至室温。</li>
	<li>称取约 10 g 氢氧化钠，边搅拌边加入 500 mL 甲醇中。搅拌 2 小时，持续向溶液中添加氢氧化钠，直至开始出现沉淀。整个操作过程中务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>依次用 10% 十二烷基硫酸钠溶液、含饱和氢氧化钠的甲醇溶液和 50 mM 盐酸清洗玻片（每种条件下均超声清洗 30 分钟）。每次更换溶液之间，用超纯水清洗玻片 10 分钟。 
	注意：尽管强烈建议使用新鲜溶液制备玻片，但每种溶液最多可重复使用 5 次或 1 个月内（以先到者为准）。每次使用前务必充分搅拌混合溶液。</li>
	<li>将清洗后的盖玻片密封保存在盐酸溶液中，最多可保存 2 周，以确保良好的双层膜质量。若保存在超纯水中，则需在一周内使用。</li>
	<li>使用氯仿和超纯水清洗 Langmuir-Blodgett 提拉系统的聚四氟乙烯槽，直至槽表面无润湿现象。向槽表面喷洒氯仿，用纤维素擦拭纸彻底擦拭 3 次，再用超纯水冲洗，并通过抽吸去除水分，重复该过程 3 次。</li>
	<li>用洁净的超纯水覆盖槽的表面。</li>
	<li>从清洗液或超纯水中取出两片表面处理过的盖玻片，用超纯水冲洗约 30 秒。</li>
	<li>将盖玻片背对背放置，用基底夹具固定玻片。通过 Langmuir 控制软件手动点击“dipper down”，将玻片浸入水面以下。</li>
	<li>调零膜天平，小心地将溶液 B 逐滴铺展在气-水界面上（图 2A）。确保脂质仅在气-水界面铺展，氯仿和脂质液滴不得沉降至聚四氟乙烯槽底部。若未确保此条件，将形成脂质“通道”，阻碍单层膜的形成。</li>
	<li>当膜天平读数达到约 15–20 mN/m 时停止加样，静置约 10–15 分钟。点击“start experiments”启动屏障控制器，调节表面积，使膜天平读数升至 37 mN/m，并维持该压力约 20–30 分钟（图 2B）。</li>
	<li>以 22 mm/min 的速度提升盖玻片，同时保持表面张力为 37 mN/m。通过 Blodgett 提拉过程，气-水界面上的脂质单层膜（含聚合物锚定）将转移至盖玻片表面（图 2C），形成脂质双层的下层叶。</li>
	<li>通过抽吸清除气-水界面残留物，并用超纯水冲洗槽体。</li>
	<li>使用氯仿、乙醇和超纯水清洗一个单孔玻片（如 Shaefer 玻片），使用前将洁净的玻片置于槽中，确保其下方有超纯水层。使孔面朝上对准气-水界面，并加入新鲜超纯水直至完全覆盖玻片。重复步骤 2.8。</li>
	<li>使用硅胶吸盘夹持步骤 2.4 中带有脂质单层膜的盖玻片（确保单层膜面远离吸盘），轻轻将脂质单层推至气-水界面，在界面处保持盖玻片约 2–3 秒，然后将其压向玻片（图 2D）。用盖玻片取出组合玻片。 
	注意：脂质双层将位于盖玻片表面，处于两片玻片夹层区域之间（图 2E）。</li>
	<li>将带有双层膜的盖玻片置于落射荧光显微镜下成像脂质双层。若观察到荧光染料分布均匀，对双层膜的一小区域进行 30 秒光漂白，关闭光源约 30 秒至 1 分钟后再次成像，观察荧光恢复情况。脂质双层应显示荧光恢复现象。 
	注意：存在缺陷或荧光恢复不良的膜不得用于后续实验。</li>
</ol>
<img alt="朗缪尔-布洛杰特法、膜天平、脂质转移、示意图、双层膜形成、玻璃基底" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：制备聚合物锚定脂质双层膜的步骤。 
使用朗缪尔-布洛杰特浸渍法（A-C）和朗缪尔-谢弗转移法（D）制备脂质双层膜的步骤。（E）最终形成的包含脂质双层膜的“三明治”结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 蛋白质在聚合物锚定脂双层中的重建
<ol>
	<li>准备一个含有超纯水的结晶皿。取一个洁净的显微镜成像环并置于结晶皿下方。</li>
	<li>将含有脂双层的谢弗尔载玻片与盖玻片“三明治”结构浸入水中，轻轻分离谢弗尔载玻片与盖玻片，从底部握住盖玻片（远离脂双层一侧），将盖玻片转移至成像环内，并闭合成像环。 
	注意：确保带有脂双层的盖玻片始终处于水中，且成像环密封良好。</li>
	<li>用 Bis-Tris NaCl 缓冲液替换成像环中的超纯水，确保脂双层不接触任何气泡。向脂双层中加入 1.1 × 10-9 M 的正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（n-Octyl-β-D-Glucopyranoside）。立即加入含有 1.2 × 10-9 M DDM 与 1.3 × 10-12 mol 纯化的 l-Opa136 的混合物至成像环中。在台式摇床上低速孵育 2 小时（图 3）。 
	注意：所用去垢剂可能因待重构的蛋白质而异。</li>
	<li>将 30 mg SM-2 树脂珠加入 3 mL Bis-Tris 缓冲液中，使用前充分振荡。用塑料移液器向成像环中加入 5~10 µL SM-2 树脂珠，孵育 10 分钟后，通过冲洗去除树脂珠。成像环中缓冲液的最终体积为 1.5 mL。</li>
</ol>
<img alt="表面活性剂双层重建示意图；正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：将l-Opa1重建入聚合物锚定脂双层的实验流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 蛋白脂质体的制备
<ol>
	<li>准备1 mg脂质混合物A的氯仿溶液。在氮气流下蒸发氯仿20分钟，随后置于真空环境中过夜，形成脂质膜。</li>
	<li>通过将15.56 g荧光素溶解于50 mL 1.5 mol NaOH溶液中，配制含50 mM荧光素的缓冲液；室温下搅拌至荧光素完全溶解，再加入12.5 mM Bis-Tris和超纯水至终体积为500 mL，调节pH至7.5。</li>
	<li>将脂质膜悬浮于含荧光素的缓冲液中，在65 °C下加热悬浮液20分钟以充分水合脂质，通过聚碳酸酯膜挤出形成200 nm的脂质体。</li>
	<li>向0.2 mg脂质体中加入2 µg的l-Opa1（溶于0.5 µM DDM中），在4 °C下孵育1.5小时。使用3.5 kDa透析盒，在4 °C下以250 mL含25 mM Bis-Tris、150 mM NaCl和50 mM荧光素的缓冲液透析过夜以去除表面活性剂，期间更换缓冲液两次。</li>
	<li>使用PD-10脱盐柱去除多余的荧光素。</li>
</ol>
5. 成像与数据分析
<ol>
	<li>使用100倍油浸物镜（数值孔径1.4）采集TIRF图像。采用543 nm激光和488 nm激光分析标记了TexasRed-PE的脂质体以及包封钙黄绿素的蛋白脂质体。采用633 nm激光分析嵌入平面脂双层中的Cy5-PE。</li>
	<li>利用脂双层校准TIRF角度以获得最大发射信号。在25 °C下使用100倍油镜观察重组后脂双层的质量。磷脂及重组脂双层的扩散系数通过FCS测定，具体方案见文献37。</li>
	<li>向成像环中加入10 µL浓度为2 mg/mL的蛋白脂质体，静置10分钟后开始成像。在反应环中加入GTP、GMPPCP或GDP，并加入1 mM MgCl2和1 mM核苷酸。</li>
	<li>为确定s-Opa1对膜融合的影响，将s-Opa1滴加至含有l-Opa1的蛋白脂质体/支撑脂双层样品中，并记录融合事件。</li>
	<li>通过分光系统实现TexasRed-DHPE和钙黄绿素的同步成像。将488 nm和543 nm激光同时作为荧光激发光源照射样品。发射光通过560 nm分光镜分离后，分别经过带宽为42 nm的510 nm滤光片和带宽为40 nm的609 nm滤光片过滤，最终投射到相机芯片上的两个相邻区域。</li>
	<li>荧光发射信号通过带宽为40 nm的609 nm发射滤光片和带宽为70 nm的698 nm发射滤光片同时记录。显微镜系统配备一个维持在-10 °C的CMOS相机。</li>
	<li>可通过基于高斯函数的粒子识别算法对脂质体进行颗粒识别。颗粒分布和强度逐通道进行分析。使用脂双层信号作为掩模以分离颗粒。</li>
</ol>

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体外模型膜系统可在明确定义的条件下描述复杂的膜过程。这些系统能够区分出复杂分子过程所必需的最小组分，从而揭示分子机制6,15,20,38。对于膜蛋白而言，脂质体和固相支撑双层膜是常用的重建系统。与固相支撑的脂双层相比，聚合物锚定双层膜中基底与支撑膜之间的聚合物垫层允许大分子膜蛋白自由移动，使跨膜蛋白能够自由扩散和组装34。这些特性有助于我们研究线粒体内膜融合的动力学过程36。
我们采用朗缪尔-布洛杰特/朗缪尔-谢弗（Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer, LB/LS）技术制备了聚合物锚定的脂双层。该方法使我们能够构建具有不对称脂质组分的脂双层。细胞膜的叶层具有不对称的组成，而LB/LS技术可用于研究此类脂双层。通过谢弗转移法，可将整个玻璃基底覆盖上脂双层。在制备脂双层前，必须确保基底表面洁净。此外，正确执行谢弗转移需要一定的操作经验。若谢弗转移失败，可能在脂双层中引入不必要的缺陷。在本实验方案中，施加于膜天平上的压力适用于含有20%心磷脂的脂双层。对于含有其他组分的脂双层，应参考其关键组分的表面压力-面积等温线。另一种替代方法是朗缪尔-布洛杰特/囊泡融合（Langmuir-Blodgett/vesicle fusion, LB/VF）法，其中底部的脂单层从朗缪尔槽的气-水界面转移至洁净基底上，随后脂质体与支撑脂单层的上表面融合，形成最终的脂双层39。使用LB/VF法重构膜蛋白比LB/LS法更为直接，因为膜蛋白的重构可通过蛋白脂质体的融合实现。然而，囊泡融合需要加入过量的脂质体，这可能会干扰依赖于浓度的蛋白质-蛋白质相互作用的膜事件研究。
将跨膜蛋白成功且以理想的功能方向重组到聚合物锚定的脂双层和脂质体中至关重要，但实现这一目标颇具挑战性，需要设置实验对照以加以验证。对于聚合物锚定的脂双层而言，在重组过程中维持脂双层的完整性同样至关重要。表面活性剂的浓度必须保持在相对较低的水平，以防止溶解脂双层，但又需足够高以避免目标蛋白发生变性。37,40此处所述方法适用于膜蛋白的重构，以用于单分子研究，但未必适用于更大规模的研究。表面活性剂的选择是另一个重要考虑因素。通常，纯化和保存过程中使用的表面活性剂是一个良好的起点。表面活性剂的最大浓度通常比其临界胶束浓度（CMC）低约200倍36在表面活性剂维持蛋白质稳定性、防止蛋白质聚集，同时保持膜完整性的范围内36可考虑使用含有两种或三种表面活性剂的混合物。在重组为脂质体时，无需使用低浓度的表面活性剂。然而，为保持脂质体大小和形态分布的均一性，优选低于临界胶束浓度（CMC）的表面活性剂浓度。为防止内容物染料泄漏，必须对含有染料的缓冲液进行透析。
与基于脂质体的融合实验相比，我们建立的这一平台提供了一种研究膜融合每一步动力学过程的方法。该方法能够在接近天然的条件下研究跨膜融合蛋白。模型膜平台可用于研究膜蛋白的组装与寡聚化、膜的“塑形”作用，以及亚细胞环境（如线粒体内膜）中蛋白质与脂质的相互作用。该方法还可用于探索膜蛋白相互作用中的重要生理条件，例如双层膜组成的不对称性。一种关键的线粒体脂质——心磷脂，在脂质体及聚合物支撑双层膜中对双层膜特性的影响仍有待阐明。离子强度、膜厚度、膜刚度、膜曲率以及膜弹性-黏性等特性，均可能影响蛋白质组装成特定功能状态的能力。未来创造性地应用模型膜系统的研究有望揭示膜蛋白组织与功能的新机制。

膜区室化是真核细胞的一个显著特征1（图1A）。生物膜 increasingly 被认为不仅仅是二维溶剂，更被视为在调控蛋白质功能和大分子复合物组装中发挥关键作用的环境2,3。天然脂质是调控膜蛋白活性的配体3,4。膜的空间组织结构以及膜被塑造成多种形态的能力，是选择新功能的重要物理特性3,5。
模型膜平台是一类仿生系统，有助于我们理解细胞膜的结构、动态行为和功能6,7,8。模型膜通常由成分明确的脂质混合物构成，具有确定的生物物理特性（如刚度、厚度和弹性）。结合荧光成像技术，模型膜平台可实现对膜结构和功能的定量分析9,10,11。脂双层重建策略已被用于研究SNARE介导的膜融合9,10、DNA介导的膜融合12以及病毒融合11,13。此类方法的一个优势在于能够获取可观测反应事件之前各中间步骤的动力学信息14。
质膜已通过模型膜系统得到了广泛研究。具有脂质相分离的双层膜已被用于研究在细胞信号传导中起重要作用的脂筏结构11,15,16。微图案化的脂质平面双层膜17,18已被用于研究细胞受体的排列方式。聚合物或凝胶支撑的膜则被用作仿生系统，以研究膜-细胞骨架的组织结构、细胞信号传导过程中膜蛋白的分布以及细胞间接触处的迁移行为19。
人工膜系统也正在被用于研究亚细胞器20。细胞器具有特征性的形态结构，可形成独特的微环境。内质网（ER）网络即为一例。将网蛋白重构至脂质体中后，可形成与细胞内质网特性相似的管状膜结构21。加入内质网融合蛋白atlastin后，可诱导脂质体来源的脂质管形成网络结构20。这是蛋白脂质体可为细胞器形态与动态提供功能见解的一个实例。
线粒体膜的融合与分裂对于维持线粒体群体的健康至关重要22,23,24,25。一组属于动力蛋白家族的GTP酶可催化线粒体膜融合过程。Mfn 1/2 催化外膜融合，Opa1介导内膜融合26（图1B）。Opa1具有两种形式：一种为长型（l-Opa1），通过跨膜结构锚定于线粒体内膜；另一种为存在于膜间隙中的“可溶性”短型（s-Opa1）。这两种Opa1形式的比例受两种蛋白酶Oma1和Yme1L活性的调控27,28,29,30。关于Opa1调控的重要科学问题包括：两种Opa1形式（短型与长型）如何协同介导膜融合，以及它们之间的调控关系28,29,31,32,33。
本文描述了一种成功用于研究线粒体内膜融合的重建策略，该策略阐明了长型和短型Opa1蛋白在线粒体内膜融合中的作用。我们开发了一个模拟线粒体内膜的平台，该平台采用聚合物锚定的脂双层结构以及200 nm的单层囊泡。在脂双层下方使用聚合物锚定具有以下优势：第一，它可保护重建的跨膜蛋白，避免因靠近玻璃载片而受到破坏34；第二，它在脂双层与玻璃基底之间形成较厚的水层，有利于研究孔道的开放9；第三，聚乙二醇（PEG）聚合物的黏弹性特性允许膜曲率发生变化35。我们采用三色荧光成像技术对膜融合过程中的各个步骤进行表征（图1C-F）。
<img alt="线粒体膜融合示意图；步骤包括拴系、对接、半融合、内容物释放。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：线粒体膜融合的监测 
(A细胞器是细胞内的膜性区室。B) 线粒体膜融合的连续步骤。线粒体外膜的融合由 Mfn1 和/或 Mfn2 催化，而内膜融合则由 Opa1 介导。 (C-F示意图 体外 用于研究线粒体膜融合的重建平台。该平台包含两个部分：含有重组l-Opa1的蛋白脂质体和聚合物锚定的脂双层。荧光标记物包括两种不同的荧光膜染料和一种内容物标记物，可用于区分膜融合过程中的各个步骤。两种膜标记物Cy5-PE（红色）和TexasRed-PE（橙色）构成一对FRET探针对，可报告膜的紧密对接状态。标记在蛋白脂质体上的TexasRed-PE的扩散可指示脂质去混排（半融合）的发生。通过钙黄绿素信号去猝灭（绿色显示）来监测内容物的释放。图A和图B使用Biorender绘制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(氰基5)</td><td>Avanti 极性脂质</td><td>货号：810335C1mg</td><td>膜荧光标记物</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>货号：880130P</td><td>脂质分子</td></tr><tr><td>1',3'-双[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰]-甘油（钠盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>货号：710335P</td><td>脂质分子</td></tr><tr><td>18:1 (&amp;Delta;9-顺式)磷脂酰胆碱（DOPC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>货号：850375P</td><td>脂质分子</td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>货号：850757P</td><td>脂质分子</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗体标记试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A20181</td><td></td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯内衬的琥珀色小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-332</td><td>用于保存脂质溶液的样品瓶</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：C0875；PubChem 物质编号：24892279</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>298-500/C295-4</td><td>Fisher 品牌的氯仿通常在脂质实验中表现可靠。</td></tr><tr><td>凹面载玻片（1 孔）</td><td>电子显微镜科学</td><td>71878-05</td><td>作为夏弗载玻片使用</td></tr><tr><td>FCS 分析工具</td><td>Smith 实验室，阿克伦大学</td><td></td><td>软件工具</td></tr><tr><td>Fiji / ImageJ</td><td>Fiji</td><td>SCR_002285</td><td>软件工具</td></tr><tr><td>Fisherbrand 盖玻片：圆形</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>用于固相支撑脂质双层的盖玻片，该产品在作者撰写手稿时已停产。替代产品为 Fisher 品牌优质盖玻片，货号：12-548-5M</td></tr><tr><td>GTP二钠盐</td><td>SIGMA-ALDRICH 公司</td><td>货号：10106399001</td><td></td></tr><tr><td>朗缪尔 &amp;与朗缪尔-布洛杰特槽</td><td>Biolin Scientific</td><td>KN2002</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-溶血磷脂酰肌醇（牛肝）（钠盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>货号：850091P</td><td>脂质分子</td></tr><tr><td>小型挤出机</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>正十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>货号：D310 25 克</td><td>用于重组的表面活性剂</td></tr><tr><td>正辛基-&amp;alpha;-D-吡喃葡萄糖苷</td><td>Anatrace</td><td>货号：O311HA 25 克</td><td>用于重组的表面活性剂</td></tr><tr><td>PC 膜 0.2&amp;mu;m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>兔抗Opa1抗体</td><td>NOVUS BIOLOGICALS</td><td>货号：NBP2-59770</td><td>用于Opa1 C末端检测的抗体</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>智能成像</td><td>RRID: SCR_014300</td><td>软件工具</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯螺纹密封带</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0636085</td><td>用于样品储存的聚四氟乙烯胶带</td></tr><tr><td>得克萨斯红 1,2-二十六烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三乙基铵盐（Texas Red DHPE）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号：T1395MP</td><td>膜荧光标记物</td></tr></tbody></table>

重建线粒体膜动力学的模型膜平台

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

线粒体动力学对其多种功能及细胞应答至关重要。线粒体膜结构拥挤且空间复杂，使得在其中识别调控因子具有挑战性。对蛋白质和脂质组分进行实验性调控有助于解答特定的调控问题。然而，在细胞实验中对这些因素进行定量操控仍具难度。为研究线粒体内部膜融合的分子机制，我们引入了一种 体外 模拟线粒体膜内脂质环境的重建平台。本文详细描述了脂双层的制备以及线粒体膜蛋白的重组步骤。该平台可对线粒体膜内融合过程中的中间产物及各个转换步骤的动力学进行定量分析。本方案介绍了具有不对称脂质组成的双层膜的构建方法，并阐述了将跨膜蛋白重组至缓冲支撑双层膜中的通用注意事项。该方法也可应用于其他膜系统的研究。

重建的跨膜蛋白在膜中自由扩散，并均匀分布。
通过落射荧光显微镜验证的脂双层及其脂质流动性的示例图像如图4所示。图4A,B展示了光漂白前后脂双层中的脂质分布。使用落射荧光显微镜在重构前后对脂双层的均一性进行可视化观察（图4D,E）。通过荧光相关光谱（FCS）验证了l-Opa1在脂双层中的重构。我们采用染料标记的脂质来评估脂双层的脂质扩散能力。重构的Opa1使用荧光标记的抗Opa1 C端抗体进行标记。测得脂双层中脂质的扩散系数为1.46 ± 0.12 μm2/s，而脂双层中重构的l-Opa1扩散系数为0.88 ± 0.10 μm2/s。FCS曲线的强度读数表明，75%的l-Opa1已成功重构至脂双层中（图4G,H）。这些结果表明，l-Opa1可在聚合物锚定的脂双层中自由扩散，并具有自组装形成功能性复合物的潜力。
<img alt="用于蛋白质相互作用和扩散分析的荧光相关光谱图像与图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：模型膜中脂质与重组蛋白的分布情况。 
(A–C) 通过倒置荧光显微镜验证脂质双层及其脂质流动性的示例图像。(A) 光漂白前双层膜中均匀的脂质分布。(B) 光漂白后立即拍摄的快照。(C) 荧光恢复后成像显示，经重组后膜仍具有良好的脂质流动性。(D,E) 重组前 (D) 与重组后 (E) 脂质分布的代表性图像，表明重组过程未在双层膜中产生缺陷。l-Opa1 经 Alexa 488 标记抗体标记后的典型全内反射荧光（TIRF）图像 (F) 显示，重组后 Opa1 在膜上呈均匀分布。G. 荧光相关光谱检测 l-Opa1 信号的原始光子计数结果。对照组中未在双层膜内重组 l-Opa1，仅加入抗体并进行洗涤。l-Opa1 在膜中的扩散速度显著慢于脂质，表明跨膜 l-Opa1 成功重组 (H)。比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
荧光逐步淬灭实验表明，每个脂质体中平均重组了2-3个l-Opa1拷贝（图5A,B）。重组后，使用动态光散射（DLS）检测了Opa1重组蛋白脂质体的粒径分布（图5C）。此外，采用荧光相关光谱（FCS）验证了Opa1在蛋白脂质体中的重组情况。游离抗体的扩散系数为164 ± 22 μm2/s；标记脂质染料的脂质体扩散系数为2.22 ± 0.33 μm2/s，而与TexasRed标记的抗His抗体结合的l-Opa1蛋白脂质体的扩散系数为2.12 ± 0.36 μm2/s。
<img alt="脂质体重悬与挤出示意图，包含Opa1蛋白、荧光强度图及粒径分布图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：蛋白脂质体的制备与表征。 
(A) 包封有淬灭型钙黄绿素的蛋白脂质体制备步骤。( B) 荧光逐步漂白的代表性数据表明，每个脂质体中平均嵌入2-3个l-Opa1拷贝。( C) 蛋白脂质体在无任何核苷酸条件下（红色），以及GTP孵育1小时后（绿色）的代表性粒径分布图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过荧光显微镜检测膜拴系、脂质分相/半融合及孔道形成。
通过全内反射荧光显微镜（TIRF）观察脂双层表面TexasRed信号的变化来监测膜拴系过程（图6A）。膜脂分相（半融合）行为通过TexasRed染料从脂质体扩散至脂双层的过程进行监测。钙黄绿素去猝灭效应有助于区分完全融合孔的形成与仅发生的脂质分相现象。由此可比较不同条件下颗粒停滞于半融合状态（图6B）与进一步进展为完全融合的颗粒（图6C）之间的差异。
膜锚定通过脂质体的稳定脂质信号来指示。两个膜之间的距离可根据两个膜上标记物之间的荧光共振能量转移（FRET）信号进行评估36。半融合的信号特征表现为钙黄绿素信号无去猝灭现象（图6B，下排），但德克萨斯红信号的快速衰减表明染料扩散进入了脂双层（图6B，上排）。完全融合（伴随孔道开放）则同时表现为脂质信号衰减和内容物释放（图6C）。可通过时间依赖性地追踪德克萨斯红和钙黄绿素的荧光强度，定量分析膜融合的动力学过程36。
<img alt="荧光显微镜分析，TexasRed-DHPE 脂质，钙黄绿素染料；随时间变化的强度图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：代表性结果展示颗粒拴系（A，比例尺 10 µm）、半融合（B，比例尺 0.5 µm）和完全融合（C，比例尺 0.5 µm）。 
（A）在加入 GTP 前，蛋白脂质体与 Opa1 重构的脂双层发生拴系。（B）半融合的一个示例。B图上排显示脂质去混溶（TexasRed 信号，红色），B图下排显示在此条件下无内容物释放（钙黄绿素信号，绿色）。（C）蛋白脂质体与脂双层融合的代表性轨迹。从下排图像中可观察到钙黄绿素去猝灭现象（下排，绿色），表明内容物释放。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

线粒体融合是线粒体动力学中重要的稳态反应。本文描述了一种 体外 用于研究线粒体内膜融合的重建系统，可解析膜拴系、对接、半融合及孔道 opening。讨论了该方法在探索细胞膜系统方面的多功能性。

线粒体动力学对于该细胞器的多种功能及细胞应答至关重要。在线粒体密集且空间结构复杂的环境中……

在本研究中，我们介绍了一种模拟线粒体内部膜脂质环境的体外重建平台。该平台可用于研究线粒体内部膜融合的分子机制。该技术的主要优势在于，可在接近天然的环境中对整合膜蛋白和膜相关蛋白进行定量研究。首先，根据手稿说明将溶液 A 和 B 混合，然后使用玻璃注射器将计算好的储存液体积加入棕色小瓶中以制备脂质混合物。通过向小瓶中添加额外的氯仿来调节至最终体积。将显微镜盖玻片在 520 摄氏度下烘烤 30 分钟。烘烤后，将其冷却至室温。在搅拌的同时，将约10克氢氧化钠加入500毫升甲醇中。搅拌两小时，并持续向溶液中加入氢氧化钠，直至出现沉淀。 依次使用10%十二烷基硫酸钠溶液、饱和氢氧化钠的甲醇溶液以及50毫摩尔盐酸溶液清洗载玻片，每种条件下均超声处理30分钟。每次处理之间，用超纯水清洗载玻片10分钟。将清洗后的盖玻片密封保存在盐酸溶液中，最多可保存两周，以确保良好的双层膜质量。使用氯仿和超纯水清洁Langmuir-Blodgett提拉系统的聚四氟乙烯槽，直至观察不到润湿现象。将氯仿喷洒在槽表面，用纤维素擦拭纸彻底擦拭三次，然后用超纯水冲洗三次，并通过抽吸去除水分。操作完成后，用洁净的超纯水覆盖槽表面。从清洗液中取出两片经过表面处理的盖玻片，用超纯水冲洗约30秒。使用基底夹具将盖玻片背对背放置以固定玻片。在Langmuir控制系统上手动点击“dipper down”，将玻片浸入水面以下。将膜天平归零，并在气-水界面处逐滴小心地铺展溶液B。确保脂质仅在气-水界面铺展，避免氯仿和脂质液滴沉降至聚四氟乙烯表面底部，否则会形成脂质通道，阻碍单层膜的形成。当膜天平读数达到约15至20毫牛顿每米时，停止添加脂质。等待10至15分钟，然后启动屏障控制器，通过点击“开始实验”来改变表面积。等待膜天平读数上升至37毫牛顿每米，并将压力维持约20至30分钟。以每分钟22毫米的速度提升盖玻片，同时保持表面张力为37毫牛顿每米。通过Blodgett浸渍法，将带有聚合物锚定的脂质单层从气-水界面转移到盖玻片表面，形成脂质双层的下层脂质单层。用抽吸法清洁气-水界面，并用超纯水冲洗槽体。用氯仿、乙醇和超纯水清洗单孔玻片后，将其置于水层下方的槽体中。确保小孔朝上对准空气-水界面，倒入新鲜的超纯水直至完全覆盖载玻片，然后按照之前所述方法将载玻片浸入水面以下。使用硅胶吸盘夹住带有脂单层的盖玻片，轻轻将脂单层推至空气-水界面。在界面处将盖玻片保持2到3秒，然后将其压向载玻片。取出带有盖玻片的载玻片。将盖玻片及其上的双层脂膜置于倒置荧光显微镜下，根据正文手稿中的说明对脂双层进行成像。准备一个含有超纯水的结晶皿，并在皿下方放置一个干净的显微镜成像用环。将含有脂质双层的载玻片和盖玻片浸入水面以下。从底部握住盖玻片，轻轻分离载玻片和盖玻片，并将盖玻片转移至成像环中。用 Bis-Tris 氯化钠缓冲液替换成像环中的超纯水，注意确保脂质双层不接触任何气泡。向脂质双层中加入1.1 纳摩尔的正辛基-β-葡萄糖吡喃糖苷，然后立即向成像环中加入1.2 纳摩尔 DDM 与1.3 皮摩尔纯化的 L-OPA1 的混合物。将样品置于台式摇床中，低速振荡孵育两小时。将30 毫克 SM-2 树脂珠加入3 毫升 Bis-Tris 缓冲液中并振荡。使用塑料移液管向成像环中加入 5 至 10 微升 SM-2 树脂珠，孵育 10 分钟，然后冲洗树脂珠。成像环中缓冲液的最终体积应为 1.5 毫升。在氯仿溶液中配制一毫克脂质混合物 A，然后在氮气流下蒸发氯仿 20 分钟。将混合物在真空条件下放置过夜，以形成脂质膜。通过将15.56克钙黄绿素溶解于50毫升1.5摩尔/升氢氧化钠溶液中，制备含钙的50毫摩尔/升缓冲液。在室温下搅拌混合物，直至钙黄绿素完全溶解。加入12.5毫摩尔的双-Tris和超纯水，定容至500毫升，并将pH值调节至7.5。将脂质膜分散于含钙黄绿素的缓冲液中，然后在65摄氏度加热悬浮液20分钟，使脂质充分水合。通过聚碳酸酯膜挤出形成200纳米的脂质体。加入2微克L-OPA1至0.5微摩尔DDM中，再加入2.2毫克脂质体，于4摄氏度孵育1.5小时。使用3.5千道尔顿透析盒，在4摄氏度下用250毫升含25毫摩尔bis-tris、150毫摩尔氯化钠和50毫摩尔钙缓冲液透析过夜以去除表面活性剂，期间更换缓冲液两次。使用PD10脱盐柱去除多余的钙黄绿素，随后按照文稿中所述进行成像和数据分析。此处展示了脂质双层及其脂质流动性的落射荧光显微镜图像。显示了光漂白前后脂质的分布情况，以及重组前后脂质双层的均一性。通过荧光相关光谱（FCS）验证了L-OPA1重组的脂质双层。FCS 曲线表明，75% 的 L-OPA1 被重组到脂质双层中，提示 L-OPA1 可在聚合物锚定的脂质双层中自由扩散，并具有自组装成功能复合物的潜力。荧光阶梯漂白实验显示，在特定脂质体中平均重组了两到三个拷贝的 L-OPA1。在重组后，采用动态光散射（DLS）检测 L-OPA1 重组蛋白脂质体的粒径分布，并通过 FCS 验证。通过全内反射荧光显微镜（TIRF）观察脂质双分子层表面Texas Red的信号来监测膜拴系。通过脂质体标记物Texas Red扩散至脂质双分子层，监测膜脂质去混相或半融合现象。钙黄绿素去猝灭有助于区分完全融合孔的形成与仅发生脂质去混相的情况，从而能够比较颗粒停滞于半融合状态与进一步进展至完全融合状态之间的差异。膜拴系表现为脂质体的稳定脂质信号，且钙黄绿素信号无去猝灭现象，而德克萨斯红信号的快速衰减表明染料扩散进入脂双层。完全融合则同时表现为脂质信号衰减和内容物释放。在进行此实验时，请务必彻底清洁盖玻片和朗缪尔槽，以确保制备出高质量的脂双层。良好的空气质量对于防止双层膜缺陷也至关重要。该技术为我们探索线粒体膜动力学与组织方面的新问题铺平了道路。令人期待的未来实验包括探究双层膜不对称性、膜电位以及与疾病相关的突变体对线粒体内膜动力学的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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重建线粒体膜动力学的模型膜平台

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