使用自由浮动组织切片进行基于组织学的染色
2020年8月25日
自由浮动技术允许研究人员进行基于组织学的染色，包括对固定组织切片进行免疫组织化学，以可视化生物结构、细胞类型以及蛋白质表达和定位。这是一种高效可靠的组织化学技术，可用于研究多种组织，例如大脑、心脏和肝脏。
这种自由漂浮技术可用于对小鼠脑组织样品进行减少免疫组织化学。自由浮动技术具有几个优点。采集较厚的组织切片，进行大规模研究，每等分试样使用 30 至 40 片切片，以及样品的长期储存。
如果您是第一次尝试这种技术，我们建议您练习对实验不重要的部分安装，以获得该方法的经验。切片前至少一到两个小时，在适当的组织切割温度下将感兴趣的样品放在低温恒温器中。当组织准备好时。
使用低温恒温器采集 20 至 50 微米厚的切片，并将切片放入 6 孔或 12 孔板的 PBS 填充孔中的单个插入物中。采集完所有切片后，每次洗涤用大约 6 mL 的剂量覆盖样品，进行 3 次 5 分钟的洗涤，然后将切片的每个孔转移到两个 mL 微量离心管中，每个试管含有 1 至 1.5 mL 的储存溶液。然后将样品储存在零下 80 摄氏度直至染色。
对于组织切片染色，将样品平衡至室温 10 至 20 分钟，然后将切片倒入新的六孔板中的插入物中。当所有储存溶液排空后，将插入片段移至新的孔中，每孔含有大约 6 mL TBS，每次洗涤 3 次，每次洗涤 5 分钟，每次洗涤新鲜 TBS，在轨道摇床上，室温下以低速运行。最后一次洗涤后，向每个孔中加入 7 mL 新鲜制备的封闭透化溶液，在摇床上室温孵育 30 分钟。
孵育结束时，将 1 mL 目标一抗溶液加入每个插入管的 2 mL 微量离心管中，并将每个插入管中的所有切片转移到适当的 2 mL 离心管中。然后将管子放在旋转的混合器上。每分钟增加约 7 转，在 4 摄氏度下过夜孵育。
第二天早上，将每支试管中的切片倒入新的六孔板中的单个孔插件中，并在每次洗涤中用新鲜 TBS 洗涤切片 2 次，每次洗涤 30 秒，每次洗涤 10 分钟。最后一次洗涤后，将切片组转移到单独的 2 ml 微量离心管中，每管含有 1 mL 适当的二抗溶液，并在室温下在轨道振荡器上避光孵育样品 2 小时。孵育结束时，将切片倒入新的六孔板中的插入物中，用新鲜的 TBS 洗涤样品 2 次，每次洗涤 30 秒，每次洗涤 1 次，每次洗涤 15 分钟，避光。
最后一次洗涤后，将切片倒入玻璃矩形组织室中，四分之三装满 TBS，然后将载玻片浸入 TBS 中。如果需要，使用细画笔和放大灯，小心地将切片引向载玻片，并在载玻片上轻轻敲击切片，确保没有皱纹或褶皱。当所有切片都捕获到载玻片上后，让载玻片在室温下避光干燥约 10 至 15 分钟，直到切片不透明，并在切片上涂上适当的水性封片剂。
使用镊子将盖玻片放在培养基上，然后用一张滤纸用力按压盖玻片以去除多余的培养基。然后可以使用合适的显微镜对切片进行成像，或将其储存在设置为 4 摄氏度的深色载玻片盒中。从这些代表性图像中观察到，可以使用自由漂浮法对小鼠脑组织切片进行荧光免疫组织化学分析，以检查神经胶质纤维酸性蛋白的表达。
这种方法也适用于在低表达转基因小鼠脑样品或非荧光组织化学染色方案（如甲酚紫）中揭示低表达蛋白，例如 GFP。其他外周组织也适合使用这种技术，无需修改，正如在这些低水平 GFP 表达肝组织样品中观察到的那样。使用自由浮动技术时要记住的最重要的一点是轻柔地处理切片，尤其是在转移过程中以及当样品位于摇床或旋转器上时。
除了免疫荧光染色外，该方法还可以很容易地修改为其他组织化学染色，如苏木精、伊红和甲酚紫，或用于色原免疫组织化学。
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概述
自由漂浮技术用于固定组织切片的免疫组织化学染色，允许可视化生物结构、细胞类型和蛋白表达。这种方法特别适用于研究脑、心脏和肝脏等各种组织，并具有较厚的组织切片和适合大规模研究等优点。
关键研究组成部分
研究领域
- 组织学
- 免疫组织化学
- 组织分析
背景
- 自由漂浮技术的优点包括更容易处理和可能的长期样本存储。
- 这种方法适用于多种生物组织，无需修改。
- 它增强了在各种样本类型中低表达蛋白的检测。
使用的方法
- 免疫组织化学染色
- 小鼠脑组织样本
- 荧光显微镜
主要结果
- 该技术允许识别神经胶质纤维酸性蛋白表达。
- 它在低蛋白表达情况下显示出效果，例如在GFP转基因小鼠样本中。
- 其他染色方法如苏木精和伊红也可以使用这种技术。
结论
- 该研究强调了自由漂浮技术在组织染色和分析方面的多功能性。
- 研究人员在实验过程中轻柔处理样本以保持完整性是至关重要的。
常见问题
Executive Industry Relevance
The free-floating immunohistochemistry technique enables efficient processing of thick tissue sections for large-scale studies, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and peripheral tissue research. By improving antibody penetration and allowing batch handling of 30-40 sections per aliquot, it enhances reproducibility and throughput in discovery workflows. This approach is particularly valuable for studying protein expression patterns in complex tissues such as brain, where 3D reconstruction of neural projections informs target confidence and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of protein expression and localization in thick tissue sections, supporting functional target validation and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates handling of large numbers of sections per aliquot, reducing labor in large-scale biomarker screening campaigns.
- Predictive Value: Improves antibody penetration compared to slide-mounted methods, increasing confidence in detection of low-abundance targets such as GFP in transgenic models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with multiple histochemical stains including hematoxylin and eosin, cresyl violet, and chromogen immunohistochemistry, enabling flexible assay development.
- Operational Value: Sections remain suspended in solution during staining, ensuring uniform reagent exposure and minimizing variability across replicates.
- Scalability: Supports long-term storage at -80°C, allowing batch processing and retrospective analysis in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Applicable to both central nervous system and peripheral tissues (e.g., liver, heart) without protocol modifications, supporting cross-target validation.
- Mechanistic De-risking: Enables 3D reconstruction of axonal and dendritic projections, providing structural context for target engagement and pathway analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates quantitative, spatially resolved protein expression data that inform go/no-go decisions in preclinical target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The free-floating method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in neuroscience and systemic toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein expression patterns in fixed tissues, enabling mechanistic insight into target biology.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence or chromogenic readouts suitable for automated imaging and image-based screening platforms.
- Analytics: Produces spatially resolved expression data that can be quantified and compared across experimental conditions to assess target modulation.
- Translational Research: Enables consistency between discovery and preclinical models by applying identical staining protocols across species and tissue types.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable platform for histological analysis that can be deployed across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances detection sensitivity and specificity in immunohistochemistry, reducing false negatives in target validation studies.
- Operational Value: Standardizes tissue handling and staining procedures, improving inter-lab reproducibility and reducing technical variability.
- Strategic Value: Increases throughput in histology-based screening, lowering cost per sample and accelerating target de-risking cycles.
- Portfolio Impact: Supports data-driven target prioritization by providing reliable, multi-parameter tissue readouts that inform biological plausibility and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue sectioning, and immunofluorescence or chromogenic detection methods.
- Dependent on access to cryostat, microtome, orbital shakers, rotating mixers, and fluorescence or brightfield microscopes.
- Necessitates standardized blocking, permeabilizing, and washing buffers to minimize non-specific binding and ensure staining consistency.
- Requires optimization of antibody concentrations and incubation times for each target and tissue type, particularly for low-abundance proteins.
- Demands careful, gentle handling of free-floating sections to prevent mechanical damage during transfers and incubation steps.
