基于组织切片的游离漂浮染色技术

这种游离漂浮技术可用于对小鼠脑组织样本进行免疫组织化学染色。游离漂浮技术具有多项优势：可获取较厚的组织切片，适用于大规模研究，每个样本可使用30至40片组织切片，并可实现样本的长期保存。

如果您是首次尝试该技术，我们建议您先练习封片一些对实验无关键影响的切片，以熟悉该方法的操作。在切片前至少一到两个小时，将待处理的样本置于冷冻切片机中，在适宜的组织切片温度下进行预平衡。待组织样本达到合适状态后。

使用冷冻切片机获取20至50微米厚的切片，并将切片分别放入六孔或十二孔板中盛有PBS的孔插内。当所有切片均制备完成后，每孔加入约6毫升PBS，进行三次、每次五分钟的洗涤，随后将各孔中的切片转移至2毫升微量离心管中，每管含1至1.5毫升保存液。然后将样品在-80摄氏度下保存，直至染色。

进行组织切片染色时，先将样本在室温下平衡10至20分钟，然后将切片倒入置于新六孔板中的插件内。待所有保存液完全排出后，将插件转移至新的孔中，每孔加入约6毫升TBS，在室温下于旋转摇床上以低速振荡洗涤，每次5分钟，共洗涤三次，每次均使用新鲜TBS。最后一次洗涤后，向每孔中加入7毫升 freshly prepared封闭透化溶液，在室温下于摇床上孵育30分钟。

孵育结束后，向每个插件对应的1个2毫升微量离心管中加入1毫升目标一抗溶液，并将每个插件中的所有切片转移至相应的2毫升离心管中。然后将离心管置于旋转混匀仪上，在4°C条件下以约每分钟7转的速度孵育过夜。

次日早晨，将每根试管中的切片分别倒入新六孔板的各个孔插件中，用新鲜的TBS缓冲液洗涤切片，每次30秒，共洗两次，再用新鲜TBS缓冲液洗涤一次，每次10分钟。最后一次洗涤结束后，将各组切片转移至单独的2毫升微量离心管中，每管加入1毫升相应的二抗溶液，在室温下置于摇床上低速孵育2小时，避光操作。孵育结束后，将切片倒出并转移至新六孔板的孔插件中，用新鲜TBS缓冲液洗涤两次，每次30秒，再洗涤一次，每次15分钟，全程避光。

最后一次洗涤后，将切片倾入一个装有TBS的玻璃矩形组织学染色缸中，TBS液面高度约为染色缸高度的四分之三，并将一张载玻片浸入TBS中。根据需要可使用细毛笔和放大灯，小心地将切片引导至载玻片附近，并轻轻敲击使切片附着于载玻片上，确保切片无皱褶或折叠。当所有切片均已被转移至载玻片上后，将载玻片在室温下避光干燥约10至15分钟，直至切片呈现不透明状态，然后在切片上滴加适量的水溶性封片剂。

使用镊子将盖玻片放置在介质上，并用一片滤纸用力按压盖玻片，以去除多余的介质。随后可使用合适的显微镜对样本进行成像，或将其存放在设置为4°C的暗盒中。如这些代表性图像所示，采用游离漂浮法进行荧光免疫组织化学分析，可用于检测小鼠脑组织切片中胶质纤维酸性蛋白的表达。

该方法也适用于检测低表达蛋白，例如在低表达GFP的转基因小鼠脑组织样本中，或在非荧光组织化学染色方案（如焦油紫染色）中显示GFP信号。其他外周组织也可直接应用此技术，无需任何修改，正如在低水平表达GFP的肝组织样本中所观察到的那样。使用游离漂浮法时最重要的是要轻柔操作切片，尤其是在转移过程中以及样本置于摇床或旋转器上时。

除了免疫荧光染色外，该方法还可轻松修改用于其他组织化学染色，如苏木精和伊红染色、焦油紫染色，或用于显色免疫组织化学。