Name: 自由行为 秀丽隐杆线虫 的钙成像，具有良好控制，非局部化振动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学习利用非局部化振动对自由行为的秀丽隐杆线虫进行钙成像技术。该方法通过精确控制振动刺激，量化神经钙电流响应，为无创研究行为神经机制提供了有效工具。

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感谢Caenorhabditis遗传中心提供本研究所用的菌株。本出版物得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（B）（课题编号 JP18H02483）、创新领域“&#34;软体机器人科学&#34;”项目（课题编号 JP18H05474）、日本医疗研究开发机构（AMED）PRIME项目（课题编号 19gm6110022h001）以及岛津基金会的资助。

1. 培养线虫直至进行钙成像
<ol>
	<li>在进行钙成像实验前四天，使用细胞涂布器将两头成年ST12线虫转移至一个新的线虫生长培养基（NGM）平板上（材料表），该平板上已用Escherichia coli OP50菌液以约4 mm × 4 mm的方形模式划线接种，以便线虫在钙成像过程中大部分时间停留在细菌区域内12。</li>
	<li>将该NGM平板置于20 °C培养箱（材料表）中培养4天。</li>
</ol>
2. 硬件设置
<ol>
	<li>准备一台配备压电装置用于刺激的显微镜13，一个2倍物镜、一个高速sCMOS相机、图像分光光学元件、一个x-y轴电动载物台、一个用于激发的LED光源，以及一台计算机（图1）。sCMOS相机的关键参数包括2560 x 2160有效像素，像素尺寸为6.5 µm，接口选项配备10-tap Camera Link。X-Y电动载物台的主要参数包括110 mm x 75 mm行程范围，最大速度250 mm/s，加速度2,000 mm/s²。2 最大加速度，以及0.25 µm的单向重复定位精度。</li>
	<li>打开计算机和x-y轴电动载物台控制器。</li>
	<li>打开放大器并设置 体积 调节器调至10和 鲈鱼 和 高音 调节器调至 8。</li>
	<li>打开LED光源的488 nm和560 nm光线以激发GCaMP和TagRFP。将光源控制盒中470 nm和550 nm的光强调节至5%，使LED光照强度适合成像。 
	&#8203;注意：在此LED强度下，记录过程中GCaMP和TagRFP荧光不会发生光漂白。</li>
</ol>
3. 钙成像的软件设置
<ol>
	<li>在 Windows 系统中下载并安装三种软件：鼠标宏软件、振动属性控制软件、运行追踪软件的程序以及用于数据分析的软件（材料表）。</li>
	<li>双击追踪软件文件。</li>
	<li>点击 运行 按钮，并等待 5 分钟以使软件稳定（图 2A）。</li>
	<li>输入曝光时间和 binning 参数。使用 0.033 秒的曝光时间与 2 × 2 binning 可确保图像采集流畅（图 2B）。 
	注意：为降低内存负载，仅显示每第 10th 帧图像。</li>
	<li>设置图像采集参数（图 2C）。例如，当以 10 秒间隔重复记录 500 帧图像两次时，在 总图像数 框中输入 1000，在 图像数 框中输入 500，在 间隔 (s) 框中输入 10。</li>
	<li>开启 采集 按钮（图 2D）。</li>
	<li>利用图像分光光学元件将荧光图像分束，两个图像（GCaMP 通道，500–525 nm（图 2E）；TagRFP 通道，584–676 nm（图 2F））将投射到 sCMOS 相机的两个半区。校准 GCaMP 与 TagRFP 通道的坐标（图 2G），并保存软件设置。</li>
	<li>设置数据文件的输出目录（图 2H）。</li>
	<li>关闭 采集 按钮（图 2D）。</li>
	<li>双击鼠标宏系统软件（图 3A），并设置振动参数（图 3B）。通过鼠标宏系统读取 Assay.txt 文件，使鼠标光标根据该文件中的坐标和时间表进行控制（图 3A）。设置鼠标光标的坐标（图 3A 中的洋红色方块）以及开始记录后至刺激开始的等待时间（图 3A 中的洋红色标注）。在振动控制软件中设置频率和振幅值（图 3B）。</li>
</ol>
4. 钙成像用线虫的制备
<ol>
	<li>将一只同时表达 GCaMP 和 TagRFP 的线虫从培养皿转移至一个新的 NGM 培养皿上，该培养皿上已划线接种 E. coli OP50。</li>
	<li>使用透明胶带将 NGM 培养皿固定在压电声学换能器上（图 4）。切勿将培养皿按压在驱动器上，以免改变振动频率。</li>
</ol>
5. 特定振动特性控制下的钙成像
<ol>
	<li>打开采集按钮（图2D）。</li>
	<li>在明场光和激发光（488 nm 和 560 nm）下找到线虫。</li>
	<li>将显微镜的放大倍数设置为 2.5 倍。视野范围为 1.1 mm × 1.1 mm，分辨率为 2.6 µm/像素。</li>
	<li>关闭明场光，打开定位按钮（图2I），以追踪线虫的荧光点。该定位按钮将启动 X-Y 载物台的移动，使线虫在 TagRFP 图像中荧光强度最高的区域始终保持在视野中央。 
	注意：对于flp-18启动子而言，AVA 神经元的荧光强度最强，而其他神经元的荧光信号较弱或无法检测。因此，无需使用高倍镜进行追踪，载物台将在整个记录过程中持续移动。</li>
	<li>确保图2E和2F中的强度条数值约为 1,000。若不符合，请微调光源控制盒中 470 nm 和 550 nm 的调节旋钮。</li>
	<li>按下小鼠宏系统中的运行按钮，以按照图3A所述的时间表实现鼠标光标控制。这将启动追踪软件进行记录，同时通过 Wave Gene 软件施加刺激，并持续追踪线虫。</li>
	<li>检查输出的 BMP 文件是否已正确生成。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>在桌面上创建一个文件夹，并将其命名为 CalciumImaging。</li>
	<li>在 CalciumImaging 文件夹内创建一个名为 CIResult 的文件夹，用于存放输出结果文件。</li>
	<li>双击使用 Windows 数据分析软件编写的 DualViewImaging.nb 文件。</li>
	<li>插入指向 CIResult 文件夹的文件路径（例如，DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf])（图 5）。</li>
	<li>插入包含 BMP 文件的文件夹路径（例如，SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/])（图 5），其中 XXX 表示包含 BMP 文件的文件夹名称。</li>
	<li>同时按下 Shift 和 Return 键以启动自动分析。该分析使用 TagRFP 图像中视野内最大强度区域的数值（程序中详细计算步骤参见 图 6 的图注）。</li>
	<li>检查 CIResult 文件夹中是否已正确生成以下输出文件。 
	XXX-GCaMP.tif（显示所有图像中 GCaMP 强度轨迹的图像文件） 
	XXX-GCaMP.xls（列出所有图像中 GCaMP 强度的电子表格文件） 
	XXX-TagRFP.tif（显示所有图像中 TagRFP 强度轨迹的图像文件） 
	XXX-TagRFP.xls（列出所有图像中 TagRFP 强度的电子表格文件） 
	XXX-Ratio.tif（显示所有图像中比值轨迹的图像文件） 
	XXX-Ratio.xls（列出所有图像中比值的电子表格文件）</li>
</ol>

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<li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

通常，神经活动的定量分析需要引入探针和/或限制动物的身体运动。然而，在机械感觉行为的研究中，探针的侵入性引入以及对动物的束缚本身就会构成机械刺激。C. elegans 为解决这些问题提供了一个理想系统，因其具有透明的身体特征，并且其神经系统结构简单紧凑，仅包含302个神经元。结合这些优势与先前开发的诱导纳米级位移的非局域化振动的方法13，本文所展示的是一种对自由活动的 C. elegans 在受控振动刺激下进行非侵入性钙成像的方法。
机械刺激的特性由多个参数定义，例如频率、位移和持续时间。近年来，生物振动学（biotremology）作为一个新兴研究领域逐渐兴起1。此类研究的主要目的是理解生物体产生、传播和接收机械振动的机制，以及这些振动对行为的影响。许多动物（包括人类）利用振动和声波来监测周围环境。例如，蝎子通过介质传播的振动来探测猎物14。因此，振动是与周围环境进行交流的一种工具。本文所述方法可用于控...

动物常常会接触到非局部的机械刺激，例如振动或声波1,2。由于这些刺激会影响稳态、发育和繁殖，动物必须调整自身行为以应对这些刺激3,4,5。然而，介导此类行为调整的神经回路和机制仍不清楚。
线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的机械感知行为是一种简单的行为范式，当线虫接触到非局部振动时，通常会从向前运动转变为向后逃避反应6。介导该行为的神经回路主要由五种感觉神经元、四对中间神经元以及多种运动神经元组成7,8。此外，线虫在经历重复刺激的间隔训练后，会对这类机械刺激产生习惯化9,10,11。因此，这种简单的行为反应构成了研究非局部振动诱发行为及其记忆神经机制的理想系统。本文展示了一种在非局部振动作用下对自由行为线虫进行钙成像的实验方案。与先前报道的系统相比，该系统结构简单，无需额外配备用于追踪的摄像头，但仍可调节非局部振动的频率、位移和持续时间。由于AVA中间神经元的激活可引发向后逃避反应，因此以在AVA特异性启动子调控下共表达钙指示剂GCaMP和钙不敏感荧光蛋白TagRFP的线虫作为示例（详见材料表）。该方案展示了当线虫由向前运动转为向后运动时，AVA神经元的激活过程。本方案有助于深入理解机械感知行为背后的神经回路机制。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;数据分析软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DualViewImaging.nb</td><td>作者</td><td></td><td>用于获取数据的分析</td></tr><tr><td>Mathematica12</td><td>Wolfram</td><td></td><td>用于运行数据分析软件 DualViewImaging</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; OP50</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心</td><td>OP50</td><td>食物用于 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 尿嘧啶营养缺陷型 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; B.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;lite-1(ce314)&lt;/em&gt; 品系</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心</td><td>KG1180</td><td>对光不敏感的突变体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;lite-1(ce314)&lt;/em&gt; 表达由 AVA 特异性启动子调控的 NLS-GCaMP-NLS 和 TagRFP 的品系</td><td>作者</td><td>ST12</td><td>&lt;em&gt;lite-1(ce314)&lt;/em&gt; 携带在NLS（核定位信号）调控下表达NLS-GCaMP5G-NLS和TagRFP基因的突变体 &lt;em&gt;flp&lt;/em&gt;-18 启动子作为染色体外阵列</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;激光多普勒测振仪&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒测振仪</td><td>Polytec Japan</td><td>IVS-500</td><td>用于量化&amp;nbsp; 由声学换能器产生的频率和位移</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠宏观系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>检测方法.txt</td><td>作者</td><td></td><td>Windows 系统中用于时间与空间上控制鼠标光标的脚本</td></tr><tr><td>HiMacroEx</td><td>向量</td><td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td><td>基于脚本控制鼠标光标的免费下载软件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;线虫生长培养基平板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>经琼脂纯化的粉末</td><td>中野铁工</td><td>01162-15</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>和光</td><td>036-00485</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>和光</td><td>034-03002</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>二磷酸氢钾</td><td>中野电气计器</td><td>28727-95</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>LB肉汤，Lennox</td><td>中野铁工</td><td>20066-95</td><td>用于培养 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; OP50</td></tr><tr><td>无水硫酸镁</td><td>TGI</td><td>M1890</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>中野铁工</td><td>28720-65</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>中野铁工</td><td>31320-05</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm）</td><td>Nunc</td><td>150270</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;非局域振动装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>LEPY</td><td>LP-A7USB</td><td>用于可控振动刺激</td></tr><tr><td>声学换能器</td><td>MinebeaMitsumi</td><td>LVC25</td><td>用于可控振动刺激</td></tr><tr><td>WaveGene 版本 1.5</td><td>茁壮成长</td><td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td><td>免费下载用于控制振动特性的软件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;非侵入性钙成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2通道台式三相无刷直流伺服控制器</td><td>Thorlabs</td><td>BBD202</td><td>MLS203-1 位移台的兼容控制器</td></tr><tr><td>479/585 nm BrightLine 双通带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-479/585-25</td><td>用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集</td></tr><tr><td>505/606 nm BrightLine 双边标准落射荧光二向色镜分光器</td><td>Semrock</td><td>FF505/606-Di01-25x36</td><td>用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集</td></tr><tr><td>512/25 nm BrightLine 单通带滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-512/25-25</td><td>用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集</td></tr><tr><td>630/92 nm BrightLine 单通带滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-630/92-25</td><td>用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集</td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Precision T7600</td><td>Windows7，配备 Intel Xeon CPU ES-2630 和 8 GB 内存</td></tr><tr><td>高速x-y电动载物台</td><td>Thorlabs</td><td>MLS203-1</td><td>快速XY扫描台</td></tr><tr><td>图像分束光学系统</td><td>滨松光子学</td><td>A12801-01</td><td>使用 W-VIEW GEMINI 图像分光光学系统获取双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）</td></tr><tr><td>LED 光源</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td>用于产生470 nm和560 nm激发光</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Andor</td><td>Zyla</td><td></td></tr><tr><td>×2 物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>MVPLAPO2XC</td><td>工作距离 20 mm，数值孔径 0.5</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKDK66 质粒</td><td>作者</td><td>pKDK66</td><td>共注射标记物</td></tr><tr><td>pTAK83 质粒</td><td>作者</td><td>pTAK83</td><td>在控制下表达TagRFP的质粒&amp;nbsp; 的 &lt;em&gt;flp&lt;/em&gt;-18 启动子</td></tr><tr><td>pTAK144 质粒</td><td>作者</td><td>pTAK144</td><td>在控制下表达 NLS-GCaMP5G-NLS 的质粒&amp;nbsp; 的 &lt;em&gt;flp&lt;/em&gt;-18 启动子</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;追踪软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homingback.vi</td><td>作者</td><td></td><td>通过sCMOS相机和x-y电动载物台的反馈控制追踪线虫荧光斑点的SubVi文件</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>国家仪器</td><td></td><td>用于运行追踪软件</td></tr><tr><td>Zyla Control 版本 2.6CI.vi</td><td>作者</td><td></td><td>通过sCMOS相机和x-y电动载物台的反馈控制追踪线虫的荧光斑点</td></tr></tbody></table>

自由活动状态下的钙成像 秀丽隐杆线虫 具有良好控制的非局域振动

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

非局域性机械力（如振动和声波）会影响从发育到稳态维持的多种生物过程。动物通过改变行为来应对这些刺激。要理解此类行为改变背后的机制，需要在目标行为发生期间对神经活动进行量化。本文报道了一种在自由活动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行钙成像的方法，同时施加特定频率、位移和持续时间的非局域性振动。该方法利用声学换能器产生精确可控的非局域性振动，并可在单细胞分辨率下量化诱发的钙信号反应。作为原理验证，本文展示了秀丽隐杆线虫（C. elegans）在对振动产生逃避反应期间，单个中间神经元 AVA 的钙反应。该系统将有助于深入理解动物对机械刺激产生行为反应背后的神经机制。

此处以在AVA中间神经元特异性启动子调控下同时表达GCaMP和TagRFP的线虫为例，展示自由活动状态下钙成像的应用 秀丽隐杆线虫GCaMP 和 TagRFP 通道数据以一系列图像形式获取，其中部分图像如图所示 图6 以及作为一部影片（补充视频 1). 我们的非局域振动系统引起的培养皿位移（图7位移也可通过在振动控制软件中设置振幅值来控制。图3B）以及 体积 放大器中的调节器（图4），而频率则通过在软件中设置频率值来调节（图4）。在成功的实验中，当以频率为630 Hz、位移约为 4.5 µm 1 秒，表明在蠕虫对非定位刺激产生向后反应期间，AVA 神经元被激活（图6GCaMP 和 TagRFP 信号...

本文报道了一种可在自由活动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行钙成像的系统，该系统能够实现良好控制且非局域化的振动刺激。该系统使研究人员能够以纳米级位移精确控制非局域化振动的特性，并量化秀丽隐杆线虫（C. elegans）对振动刺激响应过程中的钙离子流。

非定域性机械力（如振动和声波）会影响多种生物过程，从发育到稳态维持均受其调控。

我们的系统允许研究人员在非缩放位移条件下，激发具有精确控制特性的非局部振动，并量化刺激物对振动反应过程中的钙电流。该技术的主要优势在于，我们可以无创地研究神经机制以及行为的潜在机制。准备一个新的线虫生长培养基（NGM）平板，用细胞涂布器将大肠杆菌OP50以方格模式划线接种，以便在进行钙成像时，线虫大部分时间处于细菌区域内。在进行钙成像实验前四天，将两条成年ST12线虫转移至培养皿中，并将培养皿置于20摄氏度培养箱中培养四天。使用配备有声学换能器刺激装置、2倍物镜、高速CMOS相机和图像分光光学系统的显微镜进行钙成像。打开X Y电动载物台控制器中的精密计算机。然后打开放大器，将基础音调和高音调节器的音量调节至10和8。为激发GCaMP和标记RFP，打开LED光源的488纳米和560纳米光线。将光源控制盒上的470纳米和550纳米调节器设为5%，以使LED光线强度适合成像。下载并安装以下软件包和窗口：鼠标宏软件、振动控制软件、轨迹追踪运行软件以及数据分析软件。双击轨迹追踪软件文件，然后将曝光时间设置为 0.033 秒，像素合并设置为 2×2，以确保图像采集的流畅性。单击运行按钮，等待五分钟以使软件稳定。输入图像采集的相关信息。例如，若要连续采集500张图像且无间隔，则在“总图像数”框中输入500，在“图像”框中输入500，在“间隔”框中输入0。打开采集按钮后，使用图像分光光学元件将荧光图像分离，使GCaMP通道和tagRFP通道分别投射到CMOS相机的两个半区。校准GCaMP通道和tagRFP通道的坐标，并保存设置。然后设定数据文件的输出目录，并关闭采集。使用鼠标宏系统读取检测用文本文件，使鼠标光标根据该文件中的坐标和时间安排进行控制，并双击振动控制软件文件。开始记录后，在等待刺激的时间段内设置鼠标光标的坐标，然后在振动控制软件中设置频率和振幅值。从培养的平板中转移一只同时表达GCaMP和tagRFP的线虫至新鲜的NGM平板上，该平板上已划线接种大肠杆菌OP50。使用透明胶带将NGM平板固定在声学换能器上。进行钙成像时，启动采集按钮，并在2.5倍放大倍数下找到线虫。将视野设置为1.1 × 1.1 毫米，分辨率为每像素2.6微米。关闭白光，点击归位按钮以追踪线虫的荧光点，从而启动XY载物台的移动，使线虫在tagRFP图像中荧光强度最高的区域始终保持在视野中央。确保荧光强度值约为1000。如果未达到要求，请微调光源控制盒中470纳米和550纳米的调节装置。按下鼠标宏系统中的运行按钮以启用鼠标光标控制，并确认输出的BMP文件已正确生成。进行数据分析时，在桌面上创建一个文件夹并将其命名为“钙成像”，然后在“钙成像”文件夹内创建一个子文件夹，用于存放输出结果文件，并将其命名为“CI结果”。双击双视图成像。在数据分析软件中写入 MB 文件，并将文件路径插入到包含 BMP 文件的文件夹中的 CI 结果文件夹内。同时按下 Shift 键和回车键以启动自动分析，该分析将使用标签 RFP 图像中最大强度区域的数值。最后，检查输出文件是否已在 CI 结果文件夹中正确生成。在代表性分析中，GCaMP 和 tag RFP 通道数据以一系列图像形式获得。由非局域振动系统引起的培养皿位移也被量化。通过设置振动控制软件中的振幅值，以及音量调节器和放大器，可以控制位移；而频率则可通过在软件中设置频率值来调节。当以频率为630赫兹、位移约为4.5微米/秒的振动进行刺激时，观察到AVA神经元出现瞬时钙反应，表明在蠕虫对非局部刺激产生向后运动反应期间，AVA神经元被激活。在我们的实验流程中，仅能定量单个神经元。然而，该系统也可与生物成像方法结合，用于无创地定量多个神经元，甚至整个大脑。

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