人类诱导多能干细胞脑微血管内皮细胞的衍生、扩张、冷冻保存和特征化
2020年11月19日
该协议详细介绍了一种经过调整的方法，用于提取、扩展和冷冻保存通过区分人类诱导的多能干细胞而获得的大脑微血管内皮细胞，并研究 前体内 的血脑屏障特性。
iPSC 产生的 BMEC 为研究血脑屏障功能和功能障碍提供了新的实验模型。我们使用此协议来检查 BMEC 在扩增和冷冻保存后是否保持其屏障特性。该技术能够从血脑屏障破坏在疾病病理生理学中发挥作用的疾病患者中产生疾病特异性 BMEC。
为了诱导 BMEC 与人 iPSC 分化，用 DPBS 洗涤汇合的 iPSC 培养物一次，然后将细胞与适当体积的酶促 EDTA 在 37 摄氏度下孵育约 5 分钟。获得单细胞悬液后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于适当体积的补充有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的干细胞培养基中进行计数。将细胞稀释至每立方厘米浓度 10 至 4 个细胞的 1.56 倍，并将 2 毫升细胞接种到 6 孔平底的单个孔中。
在细胞培养箱中放置 24 小时后，用 E6 培养基替换每个孔中的上清液，并将板放回培养箱中再放置 4 天。为了纯化 iPSC 衍生的 BMEC，每孔用适当体积的新鲜制备的胶原蛋白 IV 和纤连蛋白溶液包被传代培养板，并在 37 摄氏度下孵育板至少两个小时。在分化的第 6 天，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于适当体积的新鲜人无内皮血清培养基中，该培养基补充有 B27、碱性成纤维细胞生长因子和视黄酸。
对于 TEER 分析，将分化的细胞接种到胶原蛋白和纤连蛋白包被的 12-transwell 过滤板的每个孔中。对于外排转运蛋白活性分析，将细胞接种到胶原蛋白和纤连蛋白包被的 24 孔平底板的每个孔中。传代培养 24 小时后，用仅补充 B27 补充剂的新鲜人无内皮血清培养基替换每个孔中的上清液。
要使用 TEER 测量 BMEC 的血脑屏障特性，请为 TEER 仪器充电过夜，然后用 70% 乙醇轻轻擦拭仪器和筷子电极，然后再将它们放入安全罩中。根据制造商的规格打开电源并校准欧姆表。插入电极并用 70% 乙醇冲洗一次，用 DPBS 冲洗一次。
将电极的短端放入插入物的非典型腔室中，将较长的一端放入空白孔的基底外侧腔中。测量阴性对照反应后，如图所示快速冲洗电极并测量第一个实验孔。记录完所有测量值后，再次冲洗筷子电极，轻轻擦拭电极，并在安全罩中风干。
为了评估细胞的外排转运蛋白活性，在培养的第 8 天，用 10 微摩尔外排转运蛋白抑制剂溶液处理适当数量的孔，并在 37 摄氏度的培养箱中放置 1 小时。孵育结束时，在培养箱中用 10 微摩尔外排转运蛋白底物溶液处理细胞 1 小时。在孵育结束时，用每孔 500 微升 DPBS 洗涤每个孔两次，然后用每孔补充 5%Triton-X 的 500 微升 DPBS 裂解细胞。
五分钟后，使用酶标仪在 485 纳米激发和 530 纳米发射下测量裂解细胞的荧光。对于转运蛋白测定中未使用的孔，用 DPBS 洗涤细胞两次，然后用每个细胞核 4% 多聚甲醛定量固定。在 E6 培养基中培养 1 天后，细胞形态与 iPSC 相似。
到第 4 天，细胞与 iPSC 明显不同，并覆盖了大部分孔。在人无内皮培养基中培养两天，可在细胞中诱导细长的鹅卵石外观。在第 8 天，单个细胞形成大部分大的鹅卵石图案。
可以进行发芽测定以证明 iPSC 衍生的 BMEC 的血管生成潜力。这导致生长因子处理三天后形成管状结构。使用该方案产生的 iPSC 衍生的 BMEC 共表达在脑、肺、肝和肾的内皮细胞中表达的紧密连接蛋白，以及在血脑屏障处表达的血管内皮标志物。
据观察，传代培养和培养基变化后 48 小时，iPSC 衍生的 BMEC 显示 TEER 值在与大鼠原代星形胶质细胞共培养的 iPSC 衍生的 BMEC 所描述的范围内。在此阶段还观察到外排转运蛋白活性。冻存后，与新鲜提取的 BMEC 相比，TEER 测量值较低。
Western blot 分析显示紧密连接标志物（如 occludin）水平降低，而免疫细胞化学显示紧密连接蛋白的雀斑和/或磨损模式。过高或过低的 iPSC 密度都会影响分化效率，并影响适当的血脑屏障特性的发展。该方法能够使用个体化 BMEC 研究屏障特性、细胞信号传导和转运蛋白活性，以模拟血脑屏障功能的生理学和病理生理学。
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概述
本研究提出了一种从人类诱导多能干细胞（iPSCs）分化、扩增和冷冻保存脑微血管内皮细胞（BMECs）的协议。它专注于使用离体模型研究血脑屏障特性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 血管生物学
背景
- BMECs在维持血脑屏障完整性方面发挥着关键作用。
- 血脑屏障的破坏与各种神经系统疾病有关。
- 人类iPSCs为个性化医疗方法提供了模型。
- 该协议允许生成疾病特异性的BMECs。
研究目的
- 优化源自iPSCs的BMECs分化协议。
- 评估扩增和冷冻保存对屏障特性的影响。
- 调查这些BMECs在研究血脑屏障功能中的适用性。
使用的方法
- 该方法依赖于通过分步细胞培养协议将人类iPSCs分化为BMECs。
- 关键步骤包括在特定培养基中培养、使用ROCK抑制剂以及用于屏障特性评估的transwell实验。
- 使用TEER测量和外流转运体实验进行功能分析。
- 在八天内监测细胞形态和分化效率。
主要结果
- BME细胞在分化后保持紧密连接特性和适当的形态。
- TEER值表明功能完整性；然而，冷冻保存降低了这些特性。
- 外流转运体活性得到证明，表明功能得以保存。
- 该方法允许对健康和疾病中的血脑屏障机制进行建模。
结论
- 该协议能够生成患者衍生的BMECs，用于研究血脑屏障功能。
- 它提供了关于冷冻保存对屏障特性影响的见解。
- 该研究对于开发针对血脑屏障的治疗策略具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Human iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (BMECs) enable the development of ex vivo blood-brain barrier (BBB) models for early-stage CNS drug discovery and mechanistic de-risking. This protocol supports the generation, expansion, and cryopreservation of BMECs, facilitating disease-relevant system modeling and functional validation of BBB properties. The approach enhances predictive confidence for BBB permeability and transporter function, directly impacting portfolio triage and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of BBB integrity and transporter activity in disease-relevant human systems.
- Supports mechanistic de-risking by modeling patient-specific BBB dysfunction.
- Facilitates functional target validation for CNS drug delivery strategies.
- Provides a platform for hypothesis testing of BBB-related therapeutic mechanisms.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized BMEC monolayers for quantitative TEER and efflux transporter assays.
- Enables reproducible assessment of compound permeability across the BBB.
- Supports assay scalability and platform reuse for high-content screening.
- Prepares validated biological systems for downstream co-culture and organoid workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro BBB models with translational biomarker endpoints such as TEER and transporter activity.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of CNS drug candidates.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on human-relevant BBB function.
- Supports modeling of BBB dysfunction in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions iPSC-derived BMECs as a bridge from early discovery to preclinical CNS drug evaluation, supporting both target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of BBB mechanisms and pathway clarification in human-derived systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative TEER and transporter activity readouts for compound evaluation.
- Analytics: Delivers standardized measurements for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with preclinical BBB biomarkers and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse CNS drug discovery and disease modeling initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BBB permeability and transporter function for CNS portfolios.
- Operational Value: Standardizes BMEC derivation, expansion, and cryopreservation for reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-relevant BBB data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional BBB validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, differentiation, and endothelial cell biology.
- Needs access to TEER instrumentation, multi-plate readers, and immunocytochemistry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell density, media, and matrix coatings for reproducibility.
- Adaptation across disease models may require protocol optimization for specific iPSC lines.
- Lower TEER and marker localization after cryopreservation may limit some downstream applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Brain Microvascular Endothelial Cell (BMEC) Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)
1:46
iPSC-Derived BMEC Subculture and Purification
3:02
Trans-Endothelial Electrical Resistance (TEER) Measurement and Analysis
4:09
Efflux Transporter Activity and Analysis
5:22
Results: Representative BMEC Differentiation and Characterization After Passaging, Subculture, and Cryopreservation
7:18
Conclusion
