Name: 人类诱导多能干细胞脑微血管内皮细胞的衍生、扩张、冷冻保存和特征化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习从人类诱导多能干细胞分化、扩增和冷冻保存脑微血管内皮细胞的方法，用于研究血脑屏障功能。该技术可生成疾病特异性细胞模型，助力神经科学研究。

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本工作获得了美国国家心理健康研究所生物行为研究创新新科学家奖（BRAINS奖）R01MH113858（授予R.K.）、美国国立卫生研究院奖KL2 TR002542（授予P.L.）、美国国家心理健康研究所临床科学家发展奖K08MH086846（授予R.K.）、悉尼·R·贝尔 Jr 基金会资助（授予P.L.）、多丽丝·杜克慈善基金会临床科学家发展奖（授予R.K.）、Ryan Licht Sang双相障碍基金会（授予R.K.）、Phyllis &amp;#38; Jerome Lyle Rappaport基金会（授予R.K.）、哈佛干细胞研究所（授予R.K.）以及Steve Willis和Elissa Freud（授予R.K.）的支持。我们感谢Annie Kathuria博士对本文稿的仔细审阅和宝贵意见。

人类诱导性多能干细胞（iPSCs）系通过经麻省总医院和麦克莱恩医院机构审查委员会批准的方案，由健康供体的成纤维细胞重编程获得，并如先前研究所述进行表征44,45,46。
注：简而言之，成纤维细胞通过基于 mRNA 的基因重编程技术被重编程为诱导多能干细胞（iPSC）47。iPSC 在干细胞培养基（SCM）（参见材料列表）中维持培养，并以约 1.2 × 102 个细胞/mL 的密度储存，每管加入 1 mL SCM、10 μM 的 Rho 相关蛋白激酶抑制剂（ROCKi）Y-27632 以及 10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO），置于液氮中 -160 °C 冷冻保存。以下所有操作均在生物安全柜中进行，除非另有说明。
1. 基底膜基质稀释与培养板包被
<ol>
	<li>用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）将从Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤中纯化的生长因子减少型基底膜基质稀释（1:50）。</li>
	<li>用适量稀释后的基底膜基质包被细胞培养板（例如，6孔板=1 mL，12孔板=0.5 mL），并在37 °C孵育至少1小时。</li>
</ol>
2. iPSC 培养维护
注意：6 孔平底板中每孔的最大汇合度约为 1.2 × 106 个细胞。
<ol>
	<li>将冻存的iPSCs在含有10 μM Y-27632的SCM中解冻，并接种至经稀释的生长因子减少型基底膜基质包被的6孔板中。</li>
	<li>解冻后前24小时，使用含10 μM Y-27632的SCM培养iPSCs。24小时后更换新鲜培养基。</li>
	<li>在传代前，使用SCM维持iPSCs培养，直至细胞汇合度达到80–90%。
	<ol>
		<li>通过将分化所需细胞密度（15,600 个细胞/cm2）乘以孔的表面积来计算所需iPSC数量。对于平底6孔板，将15,600 个细胞/cm2乘以9.6 cm2，总计每孔149,760个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>传代时，用Hanks’平衡盐溶液（HBBS）洗涤细胞，随后在37 °C下用非酶性乙二胺四乙酸（EDTA）（见材料清单）孵育5分钟。
	<ol>
		<li>使用细胞刮轻轻刮下细胞，并将细胞收集至新鲜SCM中。</li>
		<li>将细胞接种至经稀释SCM包被的细胞培养板中，按步骤2.3所述条件进行培养；或以约1.2 × 106 个细胞/mL的密度，重悬于含10 μM Y-27632和10% DMSO（v/v）的1 mL SCM中，分装至冻存管，于液氮中-160 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将iPSCs分化为BMECs
注意：非酶法 EDTA 将细胞分离成团块，而酶法 EDTA（参见材料表）可将细胞分离成单细胞悬液。视黄酸（RA）应避光保存。
<ol>
	<li>用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤iPSCs一次。加入酶解EDTA（6孔板加1 mL，12孔板加0.5 mL，24孔板加0.25 mL），于37℃孵育约5分钟。 &#176;C，以获得单细胞悬液。</li>
	<li>收集细胞，在室温下以 300 × g（相对离心力）离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于含有 10 &#956;M Y-27632</li>
	<li>使用台盼蓝和自动细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞密度。以每平方厘米15,600个细胞的密度接种细胞。2 或每孔149,760个细胞接种于6孔平底培养板（表面积为9.6 cm²）2/孔）置于含10 &#956;M Y-27632 处理 24 小时。</li>
	<li>24小时后开始诱导分化，将SCM更换为E6培养基。随后4天内每天更换一次E6培养基。</li>
	<li>在分化第4天，将E6培养基更换为添加了稀释（1:200）B27添加剂、20 ng/mL bFGF和10 &#956;M RA。接下来的48小时内不要更换此培养基。</li>
	<li>在 199 mL hESFM 中加入 1 mL 50 倍浓缩的 B27 补充剂，配制含稀释（1:200）B27 的 200 mL hESFM，混匀。</li>
	<li>通过将 50 重新溶解，配制 20 ng/mL 的 bFGF &#956;250 中的 bFGF 克数 &#956;L Tris 缓冲液（5 mM Tris，pH 7.6，150 mM NaCl）以配制 200 &#956;g/mL 储存液。通过混合 20 &#956;200 L &#956;g/mL bFGF 与 200 mL hESFM 混合使用。</li>
	<li>准备 10 &#956;首先，通过将2.5 mL DMSO加入100 mg RA粉末中，配制40 mg/mL的RA储备液。将该浓度稀释至3 mg/mL，制成10 mM的储备液。配制含10 mM RA的200 mL hESFM &#956;M RA通过混合200 &#956;10 L&#956;200 mL hESFM 中的 M RA</li>
</ol>
4. 涂布IV型胶原蛋白（COL4）和纤连蛋白（FN）基质以纯化iPSC来源的BMEC
<ol>
	<li>加入 2 mL 无菌水至 2 mg 纤连蛋白（FN）中，配制浓度为 1 mg/mL 的 FN 储存液。加入 5 mL 无菌水至 5 mg IV 型胶原蛋白（COL4）中，配制浓度为 1 mg/mL 的 COL4 储存液。
	<ol>
		<li>将 FN 在 37 °C 下溶解至少 30 分钟，COL4 在室温下溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用无菌水将 FN 储存液稀释至终浓度为 100 μg/mL，将 COL4 储存液稀释至终浓度为 400 μg/mL。</li>
	<li>使用含 400 μg/mL COL4 和 100 μg/mL FN 的混合溶液包被所需培养板（6 孔板 = 1 mL COL4/FN 溶液，12 孔板 = 0.5 mL，24 孔板 = 0.25 mL，12 孔 Transwell 小室 = 0.25 mL）。</li>
	<li>将培养板在 37 °C 下孵育至少 2 小时或过夜；对于 Transwell 小室，建议至少孵育 4 小时。</li>
</ol>
5. 诱导多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞的传代培养与纯化
注意：在分化第6天，由于细胞汇合度不同，使用酶解EDTA的孵育时间可能超过15分钟。
<ol>
	<li>分化第6天，用DPBS洗涤细胞两次。加入1 mL酶解EDTA，在37 °C孵育至少15分钟，直至获得单细胞悬液。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5分钟收集细胞。用新鲜的hESFM重悬细胞沉淀，其中添加稀释（1:200）的B27补充剂、20 ng/mL bFGF和10 μM RA。</li>
	<li>将细胞接种至涂有400 μg/mL COL4和100 μg/mL FN混合物的培养板上。接种比例为1个6孔板孔对应3个12孔板孔、3个12孔Transwell滤膜板孔或6个24孔板孔。</li>
	<li>将同一细胞系的未分化iPSC接种至COL4/FN包被的12孔Transwell滤膜板上，作为TEER分析的阴性对照。</li>
	<li>传代培养24小时后，更换为仅含B27补充剂的hESFM。此后无需再更换培养基。</li>
</ol>
6. 出芽实验
<ol>
	<li>收集第8天的iPSC来源的BMECs，并以每孔100,000个细胞的密度接种至新包被了基底膜基质（200 μL/cm2）的24孔平底板中。</li>
	<li>用含稀释后（1:200）B27和40 ng/mL血管内皮生长因子A（VEGFA165）的人胚胎干细胞培养基（hESFM）处理这些细胞。</li>
	<li>每24小时观察一次细胞，并每隔两天更换一次培养基。</li>
</ol>
7. 免疫细胞化学（ICC）
注意：免疫细胞化学实验在24孔平底板上进行。
<ol>
	<li>传代培养 48 小时后（第 8 天），用 DPBS 洗涤细胞两次，随后用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 20 分钟。</li>
	<li>用 DPBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。在含 5% 驴血清和 0.3% Triton X-100（v/v）的 DPBS 中，室温封闭细胞 1 小时。</li>
	<li>加入一抗孵育：小鼠抗人 PECAM1（1:100，储存液 0.5 mg/mL）、兔抗人 TJP1（1:200，储存液 0.53 mg/mL）、小鼠抗人 CLDN5（1:200，储存液 0.5 mg/mL）、小鼠抗人 OCLN（1:200，储存液 0.5 mg/mL）以及兔抗人 SLC2A1（1:100，储存液 0.2 mg/mL），溶于含 5% 驴血清的 DPBS 中，4°C 过夜孵育。
	<ol>
		<li>用 DPBS 冲洗细胞一次，随后用 DPBS 洗涤五次，每次 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入二抗孵育：驴抗兔 Alexa Fluor 555（1:200）和驴抗鼠 488（1:200），溶于含 5% 驴血清的 DPBS 中，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育结束后，加入用 DPBS 稀释（1:1000）的 Hoechst 33342 三盐酸三水合物，孵育 10 分钟。
	<ol>
		<li>移除 Hoechst 33342 溶液，用 DPBS 冲洗一次，随后用 DPBS 洗涤四次，每次 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在荧光显微镜下观察细胞，检测细胞标志物的表达与定位情况。</li>
</ol>
8. 跨内皮电阻（TEER）测量与分析
注：Corning 12-Transwell 嵌套板配备的滤膜由 1.12 cm2 的聚对苯二甲酸乙二醇酯材料制成，孔径为 0.4 微米。跨内皮电阻（TEER）测量设置技术重复（每孔 3 次）和生物重复（每细胞系和/或条件 3 个孔）。
<ol>
	<li>传代后 24 小时（第 7 天），使用套管式电极和伏欧表每隔 24 小时测量一次跨内皮电阻（TEER）。具体测量操作请参考伏欧表用户手册中的说明。
	<ol>
		<li>测量 TEER 前一晚为伏欧表仪器充电。测量前用 70% 乙醇轻轻擦拭仪器和套管式电极，然后将其放入生物安全柜中。</li>
		<li>打开电源，按照制造商建议校准欧姆表。</li>
		<li>插入套管式电极，先用 70% 乙醇冲洗电极，再用 DPBS 冲洗。</li>
		<li>将较短的一端电极插入跨孔小室（顶端室），较长的一端插入基底外侧室。</li>
		<li>首先测量仅包被 COL4/FN 的空白孔，然后测量其他孔。</li>
		<li>在测量不同条件（例如不同细胞系）时，需快速用 70% 乙醇冲洗套管式电极，再用 DPBS 冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录完所有测量值（单位为 Ω）后，用 70% 乙醇冲洗套管式电极，再用无菌水冲洗。轻轻擦拭电极，并在生物安全柜中静置晾干。</li>
	<li>计算空白孔的三个重复 TEER 值（单位为 Ω）的平均值，并从各实验组的原始 TEER 值中减去该平均值。
	<ol>
		<li>将上述相减后的数值取平均值，再乘以 1.12 cm2（12 孔 Transwell 小室的表面积）。</li>
		<li>使用第 6 步转换后的数值绘制图表，显示每日 TEER 测量值及其标准误差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 外排转运蛋白活性与分析
注意：外排转运蛋白活性检测在24孔平底板中进行。所关注的外排转运蛋白包括ABCB1和ABCC1。建议每种条件均设三个复孔，并设置对照孔（即不含相应抑制剂的空白孔）。
<ol>
	<li>传代培养48小时后（第8天），在37 °C条件下用10 μM Valspodar（ABCB1抑制剂）或10 μM MK571（ABCC1抑制剂）孵育细胞1小时。
	<ol>
		<li>通过将5 mg粉末（分子量1214.64 g/mol）溶解于412 μL DMSO中配制10 mM Valspodar储备液，并稀释至工作浓度10 μM。例如，配制含10 μM Valspodar的10 mL hESFM，可将10 μL 10 mM Valspodar储备液与10 mL hESFM混合。</li>
		<li>通过将5 mg粉末（分子量537.07 g/mol）溶解于931 μL DMSO中配制10 mM MK571储备液，并稀释至工作浓度10 μM。例如，配制含10 μM MK571的10 mL hESFM，可将10 μL 10 mM MK571储备液与10 mL hESFM混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1小时后，在37 °C条件下用10 μM罗丹明123（ABCB1底物）或10 μM 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA，ABCC1底物）孵育细胞1小时，可选择性加入或不加入相应抑制剂。
	<ol>
		<li>通过将10 mg粉末（分子量380.82 g/mol）溶解于875 μL DMSO中配制10 mM罗丹明123储备液，并稀释至工作浓度10 μM。例如，配制含10 μM罗丹明123的10 mL hESFM，可将10 μL 10 mM罗丹明123储备液与10 mL hESFM混合。</li>
		<li>通过将50 mg粉末（分子量487.29 g/mol）溶解于10.26 mL DMSO中配制10 mM H2DCFDA储备液，并稀释至工作浓度10 μM。例如，配制含10 μM罗丹明123的10 mL hESFM，可将10 μL 10 mM罗丹明123储备液与10 mL hESFM混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用0.5 mL DPBS洗涤细胞两次，并使用含5% Triton-X（v/v）的DPBS裂解细胞。</li>
	<li>使用多孔板或微孔板读板仪（见材料清单）测定裂解细胞的荧光强度。
	<ol>
		<li>将荧光读板仪设置为激发波长485纳米、发射波长530纳米，并在该波长下测定荧光强度。</li>
		<li>对于未用于转运体活性检测的孔，先用DPBS洗涤两次，再用4% PFA固定以进行细胞核定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将Hoechst 33342三盐酸盐三水合物按1:1000比例稀释于DPBS中，孵育细胞10分钟。使用荧光显微镜拍摄每孔多个视野图像，以计算平均细胞核数量。</li>
	<li>使用Fiji软件计数细胞核，并根据细胞核数量对荧光值进行单细胞归一化处理。
	<ol>
		<li>通过从每种条件下的原始荧光积累值中减去相应的空白值，计算平均荧光积累量。</li>
		<li>对每种条件的差值取平均。</li>
		<li>将步骤9.6.1得到的平均值除以平均细胞计数，利用该结果对荧光值进行单细胞归一化。</li>
		<li>使用归一化后的数据绘制各抑制剂条件下的图表，并进行必要的统计学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. BMEC的传代、扩增与冷冻保存
<ol>
	<li>向第8天的BMEC培养物中加入新鲜的hESFM，并添加稀释（1:200）的B27，使细胞在COL4/FN基质上再扩增两天。</li>
	<li>用400 μg/mL的COL4和100 μg/mL的FN包被新的12孔Transwell滤膜板和24孔平底板，孵育4小时。</li>
	<li>在第10天，用DPBS洗涤细胞，并加入1 mL酶解EDTA，在37°C孵育至少15分钟，直至获得单细胞悬液。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5分钟收集细胞。
	<ol>
		<li>如需冻存这些细胞，将细胞沉淀重悬于含30%胎牛血清（FBS）和10% DMSO的新鲜hESFM中。</li>
		<li>将iPSC来源的BMEC置于含异丙醇的冻存容器中，于-80 °C保存24小时后，转移至液氮中长期保存（-160 °C）。</li>
		<li>如需传代这些细胞，将细胞沉淀重悬于添加稀释（1:200）B27的新鲜hESFM中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞接种至第10.2步中准备好的包被板上。接种比例为：1个6孔板的细胞接种至3个12孔Transwell滤膜板的孔和6个24孔板的孔。让细胞生长并扩增24小时。</li>
	<li>在第11天，按照第8步中列出的步骤测量TEER。</li>
	<li>在第12天，按照第9步中列出的步骤进行免疫细胞化学（ICC）检测。</li>
	<li>复苏冻存的BMEC时，将冻存管置于37oC的温水或金属浴中解冻，然后将解冻后的BMEC转移至5 mL含稀释（1:200）B27的hESFM中。
	<ol>
		<li>在室温下以300 × g离心5分钟收集细胞，将细胞重悬于含稀释（1:200）B27、10 μM RA和10 μM Y-27632的hESFM中。</li>
		<li>24小时后，更换为含稀释（1:200）B27和10 μM Y-27632但不含RA的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

修改与故障排除
在本实验方案中，我们在诱导多能干细胞（iPSC）培养以分化为脑微血管内皮细胞（BMEC）的过程中，对常用的细胞外基质和细胞培养基进行了若干修改（图1）。这些修改并未影响从人iPSC分化获得BMEC的能力，结果仍符合Lippmann实验方案所述1。为验证该改良方案的普适性，本研究采用来自另一健康供体的iPSC细胞系，证明其结果与其他细胞系在既往研究中获得的结果具有可比性1。在细胞冻存过程中，使用B27添加剂替代1%血小板贫浆来源血清（PDS）40，但该替代会影响后续培养中BMEC的特性维持。关于问题排查，跨内皮电阻（TEER）值在稳定前可能出现快速波动，这种波动可能是由于将培养板从37 °C转移至室温时温度变化所致37。为克服此问题，应快速、高效且一致地完成测量。如有必要，可采用Blum...

血脑屏障功能 
血脑屏障（BBB）形成了一道边界，限制物质从血液进入大脑。BBB由脑微血管内皮细胞（BMECs）构成，这些细胞形成单层结构，衬于血管内壁。BMECs与星形胶质细胞、神经元、周细胞、小胶质细胞以及细胞外基质共同组成神经血管单元。BMECs具有高度调控的细胞旁结构，使BBB能够维持较高的跨内皮电阻（TEER），从而限制被动扩散，并作为屏障完整性的指标1,2。BMECs还表达多种蛋白，协助物质通过胞吞作用、转胞吞作用和跨细胞迁移等方式进行跨细胞运输，也在免疫反应过程中介导白细胞的渗出3。BMECs依赖于摄入和外排转运蛋白来获取营养并清除代谢废物，以维持大脑内的稳态平衡3。例如，溶质载体家族2成员1（SLC2A1）是一种摄入转运蛋白，负责葡萄糖通过BBB的转运4，而外排转运蛋白如ATP结合盒亚家族B成员1（ABCB1）和ATP结合盒亚家族C成员1（ABCC1）则负责将底物重新转运回血液中3,5,6,7。ABCB1的底物包括吗啡、维拉帕米4以及奥氮平和利培酮等抗精神病药物8，而ABCC1转运蛋白具有多种底物，包括硫酸结合物、长春新碱和葡萄糖醛酸结合物4。
血脑屏障模型在精神疾病中的应用 
血脑屏障功能障碍已牵涉到多种神经及精神疾病，包括精神分裂症和双相情感障碍9,10. 近年来，由iPSC分化而来的 离体 细胞模型正被用于探究精神疾病在细胞和分子层面的基础机制，但这些模型目前尚未考虑神经血管系统可能发挥的作用11,12,13据推测，循环于血液中的外周炎症性细胞因子可能对血脑屏障（BBB）产生不利影响14,15,16,17，但也存在细胞旁途径的证据18,19,20,21,22跨细胞23,24,25,26,27,28,29,&#160;和细胞外基质20,29,30,31,32&#160;导致血脑屏障功能障碍的异常。血脑屏障的破坏可导致血液成分进入脑实质，激活星形胶质细胞和/或小胶质细胞释放促炎性细胞因子，进而引发炎症反应33&#160;可能对大脑产生有害影响34脑微血管内皮细胞（BMECs）是血脑屏障（BBB）的主要组成部分，研究这些细胞的结构与功能有助于加深对神经及精神疾病中BBB功能障碍的理解。
替代性BMEC模型 
在建立从诱导性多能干细胞高效诱导脑微血管内皮细胞的方案之前1,6,35,36，研究人员已采用永生化BMECs37&#160;以研究血脑屏障功能。然而，许多这些模型未能获得理想的血脑屏障表型，例如&#160;生理范围内的TEER值38,39利用iPSC具有保留细胞来源个体遗传背景的优势。科研人员正在积极致力于建立iPSC来源的 离体 重现人类大脑结构与功能的微环境模型。研究人员已开发出方法，可衍生出在结构和生理特性上均类似于人体内脑微血管内皮细胞（BMECs）的细胞 体内获得纯化的iPSC来源的BMECs群体的方法需要多个不同步骤，近年来相关方案已得到优化1,6,35,36通常，iPSC来源的BMECs在Essential 6（E6）培养基中培养4天，随后在添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、视黄酸（RA）和B27添加剂的人内皮细胞无血清培养基（hESFM）中培养2天。然后将细胞培养于IV型胶原蛋白（COL4）和纤连蛋白（FN）基质上以获得 &#62;90% 纯度的BMECs1.
通过免疫荧光检测确认BMECs的身份，结果显示BMECs共表达血小板-内皮细胞黏附分子-1（PECAM1）、SLC2A1以及紧密连接蛋白，包括紧密连接蛋白1（TJP1）、occludin（OCLN）和claudin-5（CLDN5）。6出芽实验已被用于验证由诱导多能干细胞分化而来的脑微血管内皮细胞的血管生成潜能。6 BMECs的血脑屏障完整性通过生理条件下是否存在相关特征来评估 体外 TEER 值（约 2000 Ω × cm）2)37&#160;ABCB1 和 ABCC1 等外排转运蛋白的可测量活性1,6,36Lippmann 团队近期的方法学进展已推动诱导多能干细胞衍生的脑微血管内皮细胞（BMEC）培养方案实现了更低的实验变异性与更高的可重复性1。然而，它&#160;尚不清楚这些细胞能否在传代培养阶段之后进一步扩增和传代。我们改进的方案旨在通过将诱导多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞（iPSC-derived BMECs）在第8天之后进行传代，探讨其在冻存复苏后是否仍可进一步扩增并维持血脑屏障（BBB）特性。尽管目前尚无研究报道iPSC来源的BMECs的传代方法，但已有文献描述了一种BMEC冻存方案，可在经历冻融循环后仍保持生理性的BBB特性。40。然而，它&#160;尚不清楚冻存后的BMECs是否可以传代并保持血脑屏障（BBB）特性。
采用Lippmann方案由iPSCs衍生的BMECs已被用于模拟亨廷顿病等神经系统疾病中的血脑屏障破坏7由iPSC衍生的BMEC也已被用于研究细菌感染的影响，例如 脑膜炎奈瑟菌 或 B族链球菌 分别在血-脑脊液屏障和血脑屏障破坏时41,42此外，研究人员利用来自患有精神分裂症的22q缺失综合征患者的iPSC分化而来的BMEC，观察到细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达升高，ICAM-1是BMEC中一种主要的黏附分子，可协助白细胞向脑组织的募集和外渗43综上所述，这些研究证明了利用iPSC衍生的BMEC研究复杂神经精神疾病中血脑屏障破坏的实用性。

<table><tbody><tr><td>2&amp;prime;,7&amp;prime;-二氯二氢荧光素二乙酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6964-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 驴抗兔 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2) 小鼠单克隆抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>3528S</td><td></td></tr><tr><td>CLDN5 (Claudin-5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>人胎盘来源的 IV 型胶原蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL 内螺纹聚丙烯冷冻管&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>&amp;nbsp;8670</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Costar 平底细胞培养板（6 孔）</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Falcon 平底细胞培养板（24 孔）</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 多孔板，带可渗透聚酯膜插件（12 孔）</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Countess 载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12（不含酚红）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A1413202</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2438-50mL</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特/欧姆（TEER）测量仪（EVOM2）STX2</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 培养基（Thermo Fisher）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-2mg</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-无、生长因子减少型基底膜基质</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>含钙和镁的 Hank's 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>人内皮细胞无血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 6000</td><td>General Electric</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&amp;nbsp;Countess 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MK-571</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7571-5MG</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Occludin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Envision 2103 多孔板读数仪</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>重组人 VEGF 165</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性 FGF（154 个氨基酸）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 (GLUT-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA1-21041</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Cell Signaling</td><td>81778S</td><td></td></tr><tr><td>TJP-1 (ZO-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA5-28869</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色液（0.4%），用于 Countess 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Valspodar (Sigma) (环孢素 A)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0572-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Versene 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）</td><td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

从人诱导性多能干细胞中衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

人诱导多能干细胞（iPSCs）可分化为脑微血管内皮细胞（BMECs），用于建立 离体 用于研究血脑屏障（BBB）功能的细胞模型。该改进方案提供了从人诱导性多能干细胞（iPSCs）中诱导、扩增和冻存脑微血管内皮细胞（BMECs）的详细步骤，所使用的供体和试剂与先前报道的方案不同。iPSCs首先在Essential 6培养基中培养4天，随后在添加碱性成纤维细胞生长因子、视黄酸和B27补充剂的人内皮无血清培养基中继续培养2天。第6天时，将细胞传代至胶原蛋白/纤连蛋白基质上培养2天。第8天进行免疫细胞化学染色，利用CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1和SLC2A1检测BMEC标志物的表达。通过Western blot验证BMEC标志物的表达以及内胚层标志物SOX17的缺失。通过出芽实验评估细胞的血管生成潜能。从第7天开始，使用筷子状电极和伏欧姆计测量跨内皮电阻（TEER）。第8天利用多孔板读数仪检测ATP结合盒亚家族B成员1和ATP结合盒亚家族C成员1外排转运体的活性。BMECs成功诱导的判定标准包括：相关细胞标志物的表达、SOX17表达水平低、具备血管生成潜能、具有转运体活性，且TEER值约为2000 Ω × cm。2BMECs 扩增至第10天后，可传代至新包被的胶原蛋白/纤连蛋白培养板或进行冻存。本方案表明，由iPSC衍生的BMECs至少可扩增并传代一次。然而，冻存后BMECs的TEER值降低，且BMEC标志物的定位能力变差。BMECs可用于与其他细胞类型（神经元、胶质细胞、周细胞）的共培养实验。, 在三维脑模型（器官芯片和水凝胶）中用于脑类器官的血管化，以及研究神经精神疾病中的血脑屏障功能障碍。

BMEC 分化 
本方案中有几个关键步骤必须严格遵循（图1）。第1天使用E6培养基非常重要，因为该培养基常用于在较短时间内从iPSC诱导生成神经外胚层谱系，并在多种细胞系中获得可重复的结果36。另一个关键步骤是在分化的第4天，将E6培养基更换为含稀释（1:200）B27、20 ng/mL bFGF和10 μM RA的hESFM，以扩增iPSC来源的BMEC。添加B27补充剂可作为牛血清的替代物，支持无血清细胞培养1；bFGF的加入有助于促进iPSC来源BMEC的生长6；而RA则用于促进血脑屏障（BBB）表型的发育35。最后一个关键步骤是纯化阶段，即将第6天的iPSC来源BMEC传代至COL4/FN包被的培养板上，以筛选iPSC来源的BMEC1,6...

本方案详细描述了一种改进的方法，用于诱导人诱导性多能干细胞分化，从而获取、扩增并冻存脑微血管内皮细胞，并用于研究血脑屏障特性的体外模型 离体 模型

人诱导多能干细胞（iPSCs）可分化为脑微血管内皮细胞（BMECs），以构建体外细胞模型……

由iPSC生成的脑微血管内皮细胞（BMECs）为研究血脑屏障的功能与功能障碍提供了新的实验模型。我们已采用此方案检测BMECs在扩增和冻存后是否仍保持其屏障特性。该技术能够从患有与血脑屏障破坏相关的疾病的患者中生成疾病特异性的BMECs，从而有助于阐明这些疾病病理生理机制中的关键环节。为了诱导人iPSC分化为BMEC，先用DPBS洗涤汇合的iPSC培养物一次，然后将细胞与适量的含EDTA酶溶液在37摄氏度下孵育约五分钟。当获得单细胞悬液后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适量添加了10 µM ROCK抑制剂的干细胞培养基中进行计数。将细胞稀释至1.56 × 10⁴ 个细胞/立方厘米的浓度，并将2毫升细胞接种至6孔平底板的各个孔中。在细胞培养箱中培养24小时后，将每孔中的上清液更换为E6培养基，并将培养板放回培养箱中继续培养四天。为了纯化诱导多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞（BMECs），用新鲜配制的IV型胶原蛋白和纤连蛋白溶液按每孔适当体积包被传代培养板，于37摄氏度孵育至少两小时。在分化第六天，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适量新鲜的人源内皮细胞无血清培养基中，该培养基需添加B27、碱性成纤维细胞生长因子和视黄酸。进行TEER分析时，将已分化的细胞接种至经胶原蛋白和纤连蛋白包被的12孔Transwell小室培养板的每个孔中。进行外排转运体活性分析时，将细胞接种至经胶原蛋白和纤连蛋白包被的24孔平底培养板的每个孔中。传代培养24小时后，将每孔中的上清液更换为仅添加B27补充剂的新鲜人内皮细胞无血清培养基。为了使用TEER测量BMECs的血脑屏障特性，需提前一晚对TEER仪器进行充电，并在将其放入生物安全柜前，用70%乙醇轻轻擦拭仪器和筷子状电极。打开电源，根据制造商的说明校准欧姆表。插入电极后，先用70%乙醇冲洗一次，再用DPBS冲洗一次。将电极的短端插入嵌入式装置的非典型腔室中，长端插入空白孔的基底外侧腔室。测量完阴性对照反应后，按演示方法迅速冲洗电极，随后测量第一个实验孔。所有测量记录完成后，再次冲洗筷子状电极，轻轻擦拭电极表面，并将其置于安全通风橱中自然晾干。为了评估细胞的外排转运蛋白活性，在培养的第8天，用10 µM的外排转运蛋白抑制剂溶液处理适量的孔板，并在37°C孵育箱中孵育1小时。孵育结束后，在孵育箱中用10 µM的外排转运蛋白底物溶液处理细胞，持续1小时。孵育结束后，每孔用500 µL DPBS洗涤两次，然后用500 µL含5% Triton-X的DPBS裂解细胞。五分钟后，使用微孔板读数仪在485纳米激发波长和530纳米发射波长下测定裂解细胞的荧光。对于未用于转运体实验的孔，先用DPBS洗涤细胞两次，然后用4%多聚甲醛固定，以进行细胞核定量。在E6培养基中培养一天后，细胞形态与iPSCs相似。到第四天，细胞在形态上已明显区别于诱导多能干细胞（iPSCs），并覆盖了大部分孔壁。在人内皮细胞无血清培养基中培养两天后，细胞呈现伸长状和鹅卵石样形态。到第八天，单个细胞形成以大片鹅卵石样排列为主的结构。可以通过出芽实验来验证由iPSC衍生的BMEC的血管生成潜能。经过三天的生长因子处理后，会形成管状结构。采用本方案生成的iPSC衍生BMEC共同表达了脑、肺、肝和肾中内皮细胞所表达的紧密连接蛋白，以及血脑屏障处表达的血管内皮标志物。如观察所示，在传代和更换培养基48小时后，由iPSC分化而来的BMECs的TEER值达到与和大鼠原代星形胶质细胞共培养的iPSC来源BMECs所描述范围相当的水平。在此阶段也观察到外排转运蛋白的活性。经过冻存后，TEER测量值较新鲜制备的BMECs为低。Western blot 分析显示紧密连接标志物（如 occludin）水平降低，而免疫细胞化学结果显示紧密连接蛋白呈现斑点状或松散状分布模式。诱导多能干细胞（iPSC）密度过高或过低均会影响分化效率，并影响血脑屏障特性的正常发育。该方法可利用个体化的脑微血管内皮细胞（BMECs）来研究屏障特性、细胞信号传导及转运体活性，从而模拟血脑屏障功能的生理与病理生理状态。

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人类诱导多能干细胞脑微血管内皮细胞的衍生、扩张、冷冻保存和特征化

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从胚胎前脑中分离和培养内皮细胞

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。...

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

本文所述方案重点介绍了诱导多能干细胞分化为类脑内皮细胞的主要步骤、用于感染的脑膜炎奈瑟菌（Neisseria...

Neisseria meningitidis 感染诱导性多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞

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人诱导性多能干细胞向具有成熟免疫表型的脑微血管内皮样细胞的分化

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体外胎儿人源血管芯片模型用于研究发育性机械生物学

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衍生含小胶质细胞发育的人脑类器官

学习从人类诱导多能干细胞分化、扩增和冷冻保存脑微血管内皮细胞的方法，用于研究血脑屏障功能。该技术可生成疾病特异性细胞模型，助力神经科学研究。

从人诱导性多能干细胞中衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞

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