无转基因生成血液衍生神经元细胞

该协议的意义依赖于膜到核信号，并不直接影响基因组，就像诱导多能干细胞的情况一样。造血多能干细胞的非致畸性质是该技术的主要优势，适合在再生医学的各个领域进行安全的临床应用。项目负责人安妮-凯瑟琳·肖特博士和实验室实验室助理奥克萨娜·格林阿克演示了该程序。

要分离 PBMNCs，将用 PBS 稀释的 25 毫升一对一血液添加到 10 毫升密度梯度介质中，并以 300 倍 G 离心 30 分钟。通过管道隔离等离子体和密度梯度介质之间的接口层。用5毫升无菌PBS和离心机用300倍G清洗分离的细胞10分钟。

重复程序两次后，使用计数室计算细胞数。将6~10加入到15毫升管中的第6个单核细胞中，然后通过在PBS细胞中加入1%BSA的人类GPI连结膜蛋白特异性抗体，在37摄氏度下孵育30分钟，实现抗体交叉连接。交叉连接后，用伊斯科夫的改良杜尔贝科介质替换孵化介质，辅以 10% FBS。

将细胞置于37摄氏度和5%的二氧化碳孵化器中，在8至10天内不摇晃，在15毫升聚苯乙烯管中生长。第五天，在每15毫升管中再加一到两毫升的Iscove介质，并补充10%的FBS。用计数室计算培养细胞。

然后以300倍G为离心将大约5乘10的细胞悬浮到第6个细胞，10分钟，然后用无菌巴斯德移液器吸气产生的超高分子。将细胞颗粒重新沉浸在pH 7.2预冷却PBS的90微升中，使用0.5%BSA和2毫摩尔EDTA。然后在细胞悬浮物中加入80微升CD-45正纳米大小的磁珠，在冰上孵育15分钟。

要清洗细胞，在 10 分钟内以 300 倍 G 的速度加入两毫升 PBS 缓冲器和离心机。将细胞重新悬浮在 PBS 缓冲器的 500 微升中。用500微升预冷却PBS缓冲器清洗柱子，并将其置于磁场中。

将电池悬架放在柱子上，用 500 微升 PBS 缓冲器清洗两次。收集以 1%BSA 补充的 Iscove 中等单元中的细胞，并计算计数室中的细胞。将玻璃盖片放在四井板中，涂上一至五个稀释的多L-兽人及双蒸馏水。

在37摄氏度下孵育盖片一小时后，用双蒸馏水清洗。每毫升层压素缓慢解冻0.5至2毫克，并将其添加到覆盖唇顶部。在37摄氏度下孵育它们两个小时，然后通过管道去除多余的层压素，并在培养皿中加入神经元介质N2。

培养BD衍生的CD-45负细胞在N2介质层氨酸膜涂层玻璃盖片上两天，在37摄氏度的培养器中产生5%的二氧化碳，以启动新BD生成细胞的神经元分化。接下来，在神经元分化介质中培养细胞，并将板块放置在37摄氏度和5%二氧化碳的孵化器中16天。准备一个固定剂与75毫升的无菌水和4克副甲醛。

根据需要加入10个正常的氢氧化钠搅拌，直到溶液清除。将蔗糖混合物加入溶液中，用六种普通盐酸将其酸分到pH 7.4。将体积达到 100 毫升，并配以无菌水。

将介质从细胞培养物中去除后，用预热固定剂孵育15分钟，然后丢弃固定剂，每次洗3次细胞5分钟。立即添加新鲜制作的 0.3%Triton-X 溶液，使细胞渗透五分钟。用 PBS 洗三次，并添加 PBS 和 5%BSA 的阻塞解决方案。

在室温下将细胞在摇摇盘上阻挡一小时。在 1%BSA PBS 中准备适当的抗体稀释，并在室温下用摇板上的抗体孵育细胞 1.5 小时。每次洗涤时用 PBS 清洗细胞三次，每次洗涤五分钟。

用 DAPI 孵育细胞，并安装覆盖唇，在显微镜中安装安装介质进行可视化。BD分化细胞的形态方面在第一天、第五天和第十天进行了研究，显示出非活化细胞逐渐消失的趋势，活化培养中细胞的新种群稳步增长。BD分化细胞较小，显示出细胞细胞较少的不成熟原子核和与ESC相似的凝结色质大核的特征。

细胞在层压涂层培养皿中培养30天后，被研究为神经再分化。早在四天之前，就可以检测到第一个具有长分支结构的神经元状细胞。大多数小球形细胞发育成具有较大拉长形状的分支细胞，这意味着一个向神经元血统分化的活跃过程。

细胞体和细胞过程表现出比未分化的细胞更高的复杂性，呈现高密度的粗糙内质视网膜和成束的作用素丝。在分化介质中生长的细胞经常建立涉及细胞体的细胞对细胞接触，而其他细胞则以类似神经质的方式参与细胞过程。使用特定抗体进行的免疫化学分析证实，BD分化细胞能够重新分化各种神经元谱系，包括GFAP星形细胞。

该技术使能够重新分化为所有三个生殖层细胞的自体非致病细胞成为可能，为再生医学研究开辟了新的机遇。