Name: 渗透泵的植入和压力的诱导，以建立一个症状，药理学小鼠模型DYT/PARK-ATP1A3肌张 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解如何通过渗透泵植入脑导管并施加运动压力，建立DYT/PARK-ATP1A3肌张力障碍小鼠模型。该方法支持慢性药物递送与行为表型分析，适用于研究运动障碍的基因环境相互作用机制。

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本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF DysTract 项目资助 C.W.I.）和维尔茨堡大学跨学科临床研究中⼼（IZKF）（Z2-CSP3 项目资助 L.R.）提供支持。作者感谢 Louisa Frieß、Keali Röhm、Veronika Senger 和 Heike Menzel 提供的技术协助，以及 Helga Brünner 在动物护理方面的支持。

所有操作均按照适用的国际、国家和/或机构关于动物护理和使用的指南进行。德国维尔茨堡下弗兰肯行政区地方政府已批准所有动物实验。
1. 渗透泵的预处理
注意：此步骤必须在手术前至少48小时进行。ALZET渗透泵需要预先灌注，以确保在植入前泵速达到稳定状态。
<ol>
	<li>提前准备好用于慢性灌注的所需溶液。确保溶剂和试剂与渗透泵及导管兼容。对于本项目，将储存于 -20 °C 的 10 倍浓度哇巴因储备液在室温下解冻，并涡旋振荡 10 秒。 
	警告：哇巴因具有毒性，操作时必须佩戴手套，并仅在无菌操作台内打开，以避免吸入。</li>
	<li>开启无菌操作台；在将所有所需器械和材料放入操作台前，对其表面以及操作台内部进行消毒。</li>
	<li>在操作渗透泵前戴上外科手套。分别准备用于纹状体和小脑渗透泵的哇巴因溶液。 
	注意：由于纹状体所用渗透泵连接的是双导管，而小脑所用渗透泵连接的是单导管，尽管两者的流速相同，但纹状体泵内溶液的浓度需为小脑泵内溶液浓度的两倍。</li>
	<li>使用以下公式计算所需溶液的用量： 
	药物释放速率 (ko) = 溶液体积释放速率 (Q) × 载体中试剂浓度 (Cd) 
	在本项目中，渗透泵被预充并装填了浓度为 11.2&#8239;ng/h 的哇巴因溶液，或对照组使用的 0.9% 生理盐水。</li>
	<li>将两种哇巴因溶液分别涡旋振荡 10 秒，并使用不同的滤器（如 0.22 µm 注射式滤器）无菌过滤至各自新的微量离心管中。</li>
	<li>连同流速调节器一起称量空的渗透泵（总重约为 0.4 g）。</li>
	<li>使用 1 mL 注射器配 27 G 灌注导管（建议使用钝头导管），吸取经无菌过滤的哇巴因溶液或载体溶液。</li>
	<li>排除注射器中的所有气泡，将渗透泵垂直持握，将导管完全插入泵体内，缓慢注入溶液直至顶部有液体溢出（避免快速填充，以防泵内产生气泡）。随后，将流速调节器插入泵体（此时应有少量溶液从顶部溢出）。</li>
	<li>将流速调节器向外拉出约 5 mm，小心用剪刀取下白色法兰，然后将一段乙烯基管连接到流速调节器上。确保导管长度约为 2 cm，以便动物活动自如。</li>
	<li>再次称量已填充的渗透泵，以确认填充后与空泵之间的重量差与所加载溶液的预期重量一致。 
	注意：对于大多数水溶液而言，其重量（以微克计）等于体积（以微升计）。如果实测重量与预期体积不符，则可能有气泡滞留在泵内，此时需将泵排空后重新填充。</li>
	<li>为进行泵的预启动，准备两个 2 mL 微量离心管，分别用于纹状体和小脑的渗透泵。</li>
	<li>将渗透泵浸入装有一半 0.9% 生理盐水溶液的微量离心管中，注意不要让导管开口端浸入液体。将微量离心管置于热循环仪中，在 37 °C 下孵育 48 小时，以确保在植入前泵已达到稳定的输注速率，同时完成导管的预填充。</li>
</ol>
2. 套管和渗透泵植入
<ol>
	<li>将小鼠（雄性，C57Bl/6N，11-12周龄）放入专为吸入麻醉设计的麻醉舱内；设定异氟烷气流速率为2-3%，氧气流速率为2 L/min。</li>
	<li>根据批准的实验方案，待小鼠深度麻醉后，剃除其头部顶部、背侧颈部及背部近端三分之一区域的毛发。</li>
	<li>将动物置于立体定位仪中，并通过专为立体定位仪设计的小鼠麻醉面罩继续使用异氟烷维持麻醉（异氟烷气流速率为1.5-2%，氧气流速为2 L/min）。</li>
	<li>使用橡胶尖端或非穿刺式耳杆将动物头部固定在立体定位仪上，注意保持头部水平。</li>
	<li>为防止低体温，将加热垫置于动物身下，插入直肠温度探头并将温度设定为37 °C。使用眼用软膏滴入每只眼睛，防止角膜干燥。</li>
	<li>在手术开始前，皮下注射镇痛剂（如卡洛芬，5 mg/kg体重）。</li>
	<li>使用注射器在皮下注射最多0.2&#160;mL的0.25%布比卡因，并等待30秒，使局部麻醉起效。</li>
	<li>使用消毒剂（如双氯苯双胍己烷二盐酸盐）彻底消毒已剃毛的区域。</li>
	<li>在手术区域充分消毒后，使用手术刀在头部顶部做一切口，并用剪刀将切口向下延伸至前肢。使用止血钳暴露颅骨，并用无菌棉签擦拭骨膜。</li>
	<li>将笔尖或涂有黑色墨水的套管尖端与前囟对齐，根据相应坐标在颅骨上标记三个脑部套管的植入位点（用于灌注基底神经节的双侧孔坐标：前后方向：+0.74&#8239;mm，内外侧方向：±1.50&#8239;mm（+表示右侧，-表示相对于前囟的左侧）；小脑中线孔坐标：前后方向：-6.90 mm）。随后，小心钻出用于基底神经节的双套管孔和用于小脑的单套管孔（图1A）。</li>
	<li>在纹状体与小脑之间钻第四个小孔，用于植入固定螺钉。该螺钉最终将嵌入牙科水泥中，为套管提供额外固定。使用精细镊子和螺丝刀，小心将螺钉旋入小孔，直至其牢固固定于颅骨。注意不要将螺钉植入过深，以免损伤脑组织。 
	注意：建议在插入渗透泵套管前先完成渗透泵的植入，以避免在植入泵时意外损伤套管。</li>
	<li>为在动物背部两侧创建用于放置渗透泵的小囊腔，使用组织镊分离皮下组织层。将镊子朝向一侧后肢推进，并轻微张开镊子以扩大皮下囊腔。重复相同操作处理另一侧，先将镊子从切口取出，再轻柔地朝向另一后肢推进。 
	注意：囊腔应允许泵顺利滑入，但不应留有过大空间，以防泵在皮下移动。</li>
	<li>借助组织镊，将第一个泵连同连接的导管一起滑入一个皮下囊腔中。对第二个泵重复相同操作。</li>
	<li>使用微型泵固定器，将一根定制长度为3.0 mm的单通道渗透套管插入小脑中线处钻出的孔中。小心取下套管头，并用牙科水泥固定套管及小螺钉，注意不要覆盖渗透泵导管的连接部位。确保套管周围的牙科水泥完全干燥后，再继续后续手术步骤。</li>
	<li>在将中心间距为3.0&#8239;mm、定制长度为4.0&#8239;mm的双通道套管插入基底神经节上方的双侧钻孔前，先将两段短乙烯基导管（0.5 cm）连接至双通道套管的两个接口。将乙烯基导管与分叉接头连接，并使用1 mL注射器和27 G填充套管（插入分叉接头的单个后端）预先用哇巴因溶液或溶剂（室温，预先无菌过滤）充满整个导管系统（包括接头和套管）（图1B）。</li>
	<li>使用微型泵固定器，小心将双通道套管插入双侧孔中。使用夹具取下套管头，并用牙科水泥固定双通道套管。</li>
	<li>将渗透泵的导管分别连接至分叉接头和单通道套管。确保导管牢固连接至套管接口。 
	注意：两个泵的流速相同，因此务必注意将含有双倍浓度溶液的渗透泵连接至分叉接头，以确保基底神经节和小脑接收到相同浓度的溶液。</li>
	<li>用缝线将动物背部的切口尽可能朝向颅骨方向缝合，注意不要过度拉伸皮肤（图1C）。</li>
	<li>为防止小鼠脱水，用皮下注射方式在动物背部两侧的皮肤皱褶处各注射0.5 mL体温的0.9%生理盐水，注意避开泵体。</li>
</ol>
3. 运动挑战
<ol>
	<li>术后4小时开始，对哇巴因或溶剂灌注小鼠进行挑战性运动任务，作为一种轻度应激暴露，并在此后每24小时重复一次，以诱导类肌张力障碍样运动。该步骤不包含行为学表征；其目的在于诱导比常规笼内饲养更高的应激水平。</li>
	<li>将小鼠置于一根表面粗糙、直径为1 cm、长50 cm的木杆上，使其头部朝下。确保木杆放置在一个较大的笼子内，并铺有足够垫料以防跌落受伤。无需测量小鼠下降所需时间，但需观察哇巴因灌注小鼠在下降过程中是否出现前肢和后肢的不自主强直性伸展。让小鼠重复下降三次，每次下降之间给予2分钟恢复时间。 
	注意：哇巴因灌注小鼠通常在术后4小时出现运动迟缓等初期症状；然而，在术后24小时，小鼠在下降过程中应开始表现出前肢和后肢的不自主强直性伸展，提示出现类肌张力障碍样运动。</li>
	<li>第二项运动任务采用转棒实验装置，操作方式同转棒性能测试。此处转棒装置并非用于测量跌落潜伏期，而是使小鼠经历强制性活动。将小鼠放置于旋转棒上三次，每次测试之间给予2分钟恢复时间。 
	注意：为增强应激暴露，建议使用加速型转棒装置。在本研究描述的实验中，转棒转速在300秒内从5 rpm匀加速至50 rpm。</li>
	<li>在木杆测试与转棒测试之间，让动物恢复30分钟；在完成重复性应激暴露后，再次给予30分钟恢复时间，随后按照方案第4步所述进行肌张力障碍样运动的评分。在每次重复应激暴露之间，允许小鼠恢复24小时。</li>
</ol>
4. 评估肌张力障碍样运动的评分系统
注意：为避免偏倚，实验人员应对分组情况设盲。用于表征小鼠表型的行为学检测包含两种评分系统：一种为肌张力障碍评分量表，用于评估异常的、类似肌张力障碍的运动行为；另一种为基于悬尾实验的行为学评分。在小鼠经历轻度应激后，经过30分钟的恢复时间，再评估其类似肌张力障碍的运动表现。
<ol>
	<li>肌张力障碍评定量表 
	注意：由于缺乏预定义的行为学任务，肌张力障碍评分量表被建立为一种基于观察者的评分系统，类似于人类肌张力障碍的临床评分量表。该量表是 Calderon 等人所用肌张力障碍评分量表的改良版本。13.
	<ol>
		<li>将动物放入塑料或木制箱中后，记录其4分钟内的姿势与步态。</li>
		<li>震颤样运动频率和分布评分（0–4分）：（0）正常运动行为；（1）运动行为异常，无震颤样运动；（2）轻度运动障碍，伴轻度局灶性震颤样运动；（3）中度运动障碍，伴重度局灶性震颤样运动；（4）重度运动障碍，伴持续性、全身性震颤样运动图2）。将以下动作或姿势视为类似肌张力障碍的表现：前肢过伸、后肢站立过宽或后肢过伸，以及脊柱后凸。若仅单一身体部位受累，则视为局灶性肌张力障碍；若躯干及至少两个其他身体部位均受累，则视为全身性肌张力障碍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>悬尾实验 
	注意：尾悬吊试验常用于观察和评分后肢抓握现象。然而，这是一种高度非特异性的表型，仅提示存在运动功能障碍。以下方案提出了一种专门针对类似肌张力障碍运动的评分系统。鉴于DYT/PARK-ATP1A3患者中肌张力障碍具有全身性特点，应评估前肢、躯干和后肢的类似肌张力障碍运动。已开发出一种新的0至8分的评分系统，总分 &#60; 2 表示未出现类似肌张力障碍的运动（图3).
	<ol>
		<li>用手指捏住小鼠尾巴根部，将其提起。录制2分钟的悬尾实验视频，并在后续对录像进行仔细分析后评分。</li>
		<li>将前肢评分定为0至4分，其中单侧或双侧前肢重复性或持续性强直性回缩，以及前肢出现过伸并交叉的表现，均归类为类肌张力障碍表现：（0）无异常运动；（1）前肢活动减少，且在记录时间内≥50%的时间可见足部过伸；（2）轻度类肌张力障碍样前肢运动 &#60; 记录时间的50%及以上出现前肢轻度肌张力障碍样运动，或重度肌张力障碍样运动 &#60; 记录时间内前肢出现类似严重肌张力障碍的动作≥50%的时间。 
		注意：后肢抓握是一种异常运动，不应被记为类似肌张力障碍的表现。</li>
		<li>根据后肢的异常表现进行评分，评分范围为0至3分，评估指标包括后肢回缩、紧握以及持续性过度伸展等类似肌张力障碍的表现：（0）无异常运动；（1）后肢活动减少，且在记录时间中≥50%的时间出现足部过度伸展；（2）单侧后肢出现类似肌张力障碍的运动；（3）双侧后肢均出现类似肌张力障碍的运动。</li>
		<li>若出现躯干变形 &#62; 在记录时间的80%情况下，分数上加一个点。</li>
		<li>将动物放回其笼中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该 DYT/PARK-ATP1A3 药理学小鼠模型可用于详细分析仅由基底节和小脑中钠钾离子泵抑制所诱导的脑内结构和神经化学变化，以及与应激暴露相关的改变。对于小鼠而言，最多可皮下植入两个渗透压泵。本文介绍了一种通过使用连接至分叉适配器的双套管并结合单套管实现向多个脑区持续给药的方法。该方法适用于任何需要同时且长期灌注多个脑区的研究应用。
我们介绍了一种罕见运动障碍的小鼠模型，患者在应激暴露后出现持续性症状。这种假定的基因-环境相互作用目前仍不明确，但可能代表了DYT/PARK-ATP1A3疾病发展中的关键致病机制之一。过去已发表多种对小鼠施加应激的方法，包括足部电击、束缚、冷或热环境以及暴露于各种气味11,12,13。为了采用具有转化价值的轻度应激因素处理小鼠，本文描述了重复施加具有挑战性的运动任务的方法。在杆下测试中，灌注哇巴因的小鼠表现出前肢和后肢的不自主过度伸展。这些动作与动物在4分钟视频记录期间观察到的类肌张力障碍样运动以及悬尾试验中的表现非常相似。以具有挑战性的运动任务作为轻度应激的应用，可能在其他表现出运动症状或神经退行性变的小鼠模型中也具有实用价值，特别是在基因-环境相互作用显著影响疾病进展程度的情况下。
目前普遍缺乏用于分类小鼠异常运动和姿势的预定义行为任务及评分量表。大多数现有的运动任务仅能揭示非特异性的异常表现，例如后肢抓握（hindlimb clasping），这是许多伴神经退行性变的运动障碍小鼠模型中广为人知的现象18,19。然而，为了对表型进行准确表征，有必要分析小鼠模型是否重现了该疾病的核心特征。本文中，我们介绍了一种改良版的肌张力障碍评分量表，此前该量表已被用于评估肌张力障碍小鼠模型的运动功能障碍15,16。此外，我们还开发了一种基于观察者的尾悬吊实验评分系统，其建立方式类似于人类肌张力障碍的临床评分量表。这两种评分量表在经哇巴因灌注并施加应激的小鼠中得分显著高于经哇巴因灌注但无应激的小鼠以及经载体灌注的小鼠。任何基于观察者的评分系统的局限性在于：评分者需要经过培训以确保评分的一致性，减少观察者间的变异性；同时，若评分者未能完全对分组信息设盲，则存在产生偏倚的风险。然而，基于观察者的评分系统仍是一种易于实施的表型表征方法，并可根据所研究的小鼠模型进行调整，正如本项目中对类肌张力障碍样运动的评估所做的改进。为确保不同评分者之间评分的一致性，应提供培训用视频资料。为降低潜在偏倚，建议由多位评分者独立对相同的视频片段进行评分，并将个体评分取平均值。本研究所提及的两种评分系统均可记录动物中类肌张力障碍样运动的存在情况。这些评分量表可根据项目中的具体需求进行调整，例如Ip等人此前的研究中，在肌张力障碍1型（DYT-TOR1A）小鼠模型中仅对后肢的类肌张力障碍样运动进行评分20。此外，这些评分量表还可与其他已发表的评分系统结合使用，例如Calderon等人提出的运动障碍评分（locomotion disability score），用于评估啮齿类动物运动迟缓的程度13。

将药物直接持续递送至大脑具有诸多优势。可避免重复且频繁的注射，从而消除对动物造成的不必要应激因素，并实现更稳定的脑内药物浓度。当全身给药的药物难以穿透血脑屏障时，这一优势尤为显著。此外，通过渗透泵进行慢性给药，可实现对底物的局部递送，避免其产生全身性副作用。药物可被精准递送至目标脑区，从而直接追踪其产生的效应。该技术可应用于多种研究场景，例如治疗效果研究以及病理机制研究。本项目即采用后一种应用方式，构建了一种肌张力障碍的药理学小鼠模型。
肌张力障碍综合征是第三大常见的运动障碍疾病，但其分析与理解长期受到限制，主要原因在于现有的遗传性动物模型难以重现患者体内所表现出的疾病表型及其病理生理机制。这一问题不仅局限于肌张力障碍综合征，实际上在运动障碍疾病领域的许多转基因啮齿类动物模型中均普遍存在1,2。转基因啮齿类模型缺乏明确表型的原因，可能在于其体内存在高度有效的代偿机制3。以肌张力障碍为例，该病的特征是出现不自主的肌肉收缩，导致肢体扭曲运动和异常姿势4。对继发性病因（即脑损伤）所致肌张力障碍症状的研究，有助于识别参与这些运动异常表现的脑区结构，例如基底神经节5。对遗传性肌张力障碍的脑成像研究显示，在几乎所有负责运动控制和感觉运动整合的脑区中均存在功能异常6,7。然而，仍需依赖啮齿类动物模型来深入理解分子层面及大规模神经网络层面的神经功能障碍，并推动治疗策略的开发。在这一背景下，药理学小鼠模型为更精确地模拟疾病的临床特征和病理特征提供了可能。
快速起病的肌张力障碍-帕金森综合征（DYT/PARK-ATP1A3；RDP；DYT12）是遗传性肌张力障碍的一种形式。该病由ATP1α3基因的功能缺失性突变引起，该基因编码Na+/K+-ATP酶的α3亚基8。此外，已知携带该基因突变的个体可能在多年内无症状，但在经历应激事件后会急性出现持续性全身性肌张力障碍和帕金森综合征。事实上，DYT/PARK-ATP1A3的外显率不完全，可作为触发因素的应激事件包括体力过度消耗、极端温度、过量饮酒以及感染等9,10。为了研究DYT/PARK-ATP1A3并寻找潜在的治疗干预手段，研究人员已多次尝试在啮齿类动物模型中模拟这种依赖应激的疾病发展过程。然而，除了一种现有的遗传性DYT/PARK-ATP1A3小鼠模型（该模型中低温可诱导短暂的异常运动和类似惊厥的动作）之外，所有已发表的遗传性小鼠模型均未能产生肌张力障碍症状1,11,12。 Calderon等人先前证明，在野生型小鼠中通过强心苷哇巴因双侧阻断基底节和小脑中的α3亚基，会导致轻度步态异常13。若在温暖环境中 дополнительно施加足部电击，则会引发肌张力障碍和运动迟缓表型，从而表明：长期且靶向性地灌注哇巴因，随后施加应激，可成功模拟DYT/PARK-ATP1A3的表型。
然而，在38–40 °C的温暖环境中对动物施加持续两小时的足部电击，会引发动物的疼痛和焦虑，这些因素构成混杂变量，尤其影响对与肌张力障碍发展相关的儿茶酚胺系统变化的评估。因此，本文描述了一种具有较高转化价值的不同类型应激范式，其依据在于已有研究报道轻度至中度运动可诱发DYT/PARK-ATP1A3患者症状9。此外，重复性运动是局灶性肌张力障碍的明确诱因之一14。实验中，小鼠被反复施加具有挑战性的运动任务，包括三次从木杆上向下爬行（“木杆实验”）和三次在转棒仪上的奔跑（“转棒性能测试”）。将动物置于一根50 cm长的木杆顶端以迫使它们向下爬行，转棒仪则通过将小鼠放置于旋转的杆上使其进行强制性活动。
由于缺乏预定义的测试方法和评分标准，对肌张力障碍小鼠模型的运动表型进行表征尤为困难。然而，近年来有一种运动功能障碍评估方法被反复使用，以评估啮齿类动物中类似肌张力障碍运动的严重程度和分布情况13,15,16。本文介绍了一种改良版的肌张力障碍评分量表，该量表在持续观察动物四分钟的过程中被证明可有效评估其类似肌张力障碍的表型。作为评估类似肌张力障碍运动的第二种方法，我们提出了一种新开发的评分系统，用于在尾悬吊实验中对异常运动进行评分。该系统可用于评估前肢、后肢以及躯干出现类似肌张力障碍运动的频率和持续时间。

<table><tbody><tr><td>0.9% 生理盐水</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>PZN06178437</td></tr><tr><td>Alzet 渗透压泵</td><td>Durect</td><td>4317</td><td>型号 1002，流速 0.25 &amp;mu;L/h</td></tr><tr><td>固定螺钉</td><td>AgnTho's</td><td>MCS1x2</td><td>长 2 mm，螺纹外径 1 mm</td></tr><tr><td>微型动脉夹</td><td>AgnTho's</td><td>13-320-035</td><td>直型，3.5 cm</td></tr><tr><td>布比卡因 0.25% Jenapharm</td><td>mibe GmbH Arzneimittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管与微型泵固定架</td><td>Stoelting Co.</td><td>51636</td><td>设计用于固定 3.4 mm 导管头</td></tr><tr><td>导管分叉接头</td><td>Plastics One</td><td>21Y</td><td>定制</td></tr><tr><td>导管管路</td><td>Plastics One</td><td>C312VT/PKG</td><td>乙烯基材质，0.69 mm × 1.14 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5SF 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>精细镊子</td></tr><tr><td>眼用乳膏 Bepanthen</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠立体定位用气体麻醉面罩</td><td>Stoelting Co.</td><td>56109M</td><td></td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>高速旋转微型电机套件</td><td>Foredom</td><td>K.1070-2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 CP 1 mL/mL，250 mL</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>需处方</td></tr><tr><td>异氟烷系统 Dr&amp;auml;ger Vapor 19.3</td><td>Dr. Wilfried M&amp;uuml;ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>牙科水泥，液体</td></tr><tr><td>Kallocryl CPGM 红色</td><td>Speiko</td><td>1692</td><td>牙科水泥，红色粉末</td></tr><tr><td>小鼠及新生动物适配器</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>用于传统 U 型架的小鼠适配器</td></tr><tr><td>持针器</td><td>KLS Martin Group</td><td>20-526-14</td><td></td></tr><tr><td>非穿刺式耳杆及小鼠立体定位用橡胶尖头</td><td>Stoelting Co.</td><td>51649</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&amp;uuml;lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>小鼠用渗透压泵连接导管，双联</td><td>Plastics One</td><td>3280PD-3.0/SPC</td><td>28 规格，长度 4.0 mm，中心距 3.0 mm</td></tr><tr><td>小鼠用渗透压泵连接导管，单联</td><td>Plastics One</td><td>3280PM/SPC</td><td>28 规格，定制长度 3.0 mm</td></tr><tr><td>乌本苷八水合物 250 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03125-250MG</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Kern &amp;amp; Sohn</td><td>PFB 6000-1</td><td></td></tr><tr><td>直肠温度探针</td><td>Stoelting Co.</td><td>50304</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 50 mg/mL，注射用</td><td>Zoetis</td><td></td><td>卡洛芬，需处方</td></tr><tr><td>啮齿类动物加热系统 X1 配小鼠加热垫</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>RotaRod Advanced</td><td>TSE Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺丝刀套装</td><td>AgnTho's</td><td>30090-6</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢钻头</td><td>AgnTho's</td><td>HM71009</td><td>0.9 mm &amp;Oslash; 钻头</td></tr><tr><td>不锈钢钻头</td><td>AgnTho's</td><td>HM71014</td><td>1.4 mm &amp;Oslash; 钻头</td></tr><tr><td>StereoDrive</td><td>Neurostar</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td>由 Neurostar 定制</td></tr><tr><td>立体定位机器人</td><td>Neurostar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>缝合线：涂层薇乔线，聚乳酸-乙醇酸共聚物 910</td><td>Ethicon</td><td>V797D</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf AG</td><td>5382000015</td><td></td></tr></tbody></table>

植入渗透压泵并诱导应激以建立症状性药理学小鼠模型用于 dyt/park-atp1a3 肌张力障碍研究

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

转基因小鼠模型存在局限性，尤其是在研究运动障碍时，大多数现有的转基因啮齿类动物模型并不表现出与人类疾病临床特征相似的运动表型。药理学小鼠模型则能够更直接地研究致病机制及其对行为表型的影响。通过将渗透压泵与脑部套管连接，可实现局部且持续的药物递送，从而建立药理学小鼠模型。对于遗传性运动障碍——快速发作性肌张力障碍-帕金森综合征，可通过强心苷哇巴因（ouabain）高度特异性地阻断Na+/K+-ATP酶α3亚基，模拟该病中α3亚基功能缺失突变。为了在基底神经节和小脑这两个被认为在快速发作性肌张力障碍-帕金森综合征发病机制中起关键作用的脑区局部阻断α3亚基，采用立体定位法将双侧套管植入纹状体，并将另一单侧套管植入小脑。套管通过乙烯基导管连接至两个皮下植入动物背部的渗透压泵，从而实现哇巴因的长期精确给药。该快速发作性肌张力障碍-帕金森综合征的药理学小鼠模型具有额外优势，能够重现无症状和有症状突变携带者的临床及病理特征。与快速发作性肌张力障碍-帕金森综合征突变携带者类似，接受哇巴因灌注的小鼠仅在额外施加应激后才出现类似肌张力障碍的运动异常。本文展示了一种轻度应激范式，并介绍了两种经改进的评分系统，用于评估运动表型。

图4 改编自 Rauschenberger 等人17。对于肌张力障碍评分量表（A）和尾悬吊实验（B）的数据分析，需计算每只动物在每个时间点的总分。应将每组在每个时间点的均值绘制成适当的图表。应检验数值的分布情况，并选用合适的统计学方法以确定显著性差异。在动物数量充足的情况下，可通过肌张力障碍评分量表以及尾悬吊实验中的异常运动评估检测出运动表型。与灌注哇巴因但无应激的小鼠及对照组小鼠相比，灌注哇巴因且经历应激的小鼠在上述两项评估中表现出显著更高的运动评分，从而显示出类肌张力障碍表型。
<img alt="用于神经科学研究的啮齿类动物立体定位手术，采用精确定位设备进行脑区靶向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：套管与渗透泵植入的主要手术步骤。（A）根据指定坐标，需在双侧钻孔，用于植入至基底神经节的双套管，以及植入至小脑中线位置的单套管。图中动物两侧各放置一个已组装完成的渗透泵。（B）图示为已植入小脑的单套管，用牙科水泥固定。用于基底神经节的双套管应在植入前连接至分叉接头，并预先充满哇巴因（ouabain）。（C）手术完成后的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠运动行为严重程度示意图；阶段 0-4；运动障碍评分。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用肌张力障碍评分量表评估类肌张力障碍样运动。在4分钟的视频中，根据异常运动的身体分布范围和持续时间进行评分。前肢不自主过度伸展、后肢宽距站立或过度伸展以及脊柱后凸均被评定为类肌张力障碍样表现。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="运动评估量表示意图；前肢、后肢、躯干肌张力障碍严重程度评价。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：悬尾实验期间类肌张力障碍样运动的评估。新开发的2分钟悬尾实验异常运动评分系统，用于评估前肢、后肢和躯干的类肌张力障碍样运动，总评分为0–8分。前肢出现过度伸展、前肢交叉以及向躯干方向的强直性屈曲被视为类肌张力障碍表现。后肢出现不自主的过度伸展，以及越过身体中线的伸展性回缩，亦被记为类肌张力障碍。在记录时间内，躯干变形持续超过80%时记1分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="行为学评分图：肌张力障碍评分量表（A）和悬尾试验（B），术后分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：肌张力障碍评分量表与悬尾试验的代表性图表。（A）该图显示了经NaCl灌注并施加应激的小鼠（黑色虚线）、经ouabain灌注但无应激的小鼠（橙色虚线）以及经ouabain灌注并施加应激的小鼠（深蓝色实线）在肌张力障碍评分量表上的表现。每个时间点的数据以均值±标准误（SEM）表示。（B）该图展示了在2分钟悬尾试验中对异常运动行为的评估结果，所涉及小鼠分组同上。对肌张力障碍评分量表和悬尾试验评分采用双尾Mann-Whitney检验进行统计分析。经Bonferroni-Holm法对p值进行校正（§）后，发现在72小时观察期内存在显著差异。深蓝色*表示经ouabain灌注并施加应激的小鼠与经ouabain灌注但无应激的小鼠之间的显著差异；黑色*表示经NaCl灌注并施加应激的小鼠与经ouabain灌注并施加应激的小鼠之间，以及经NaCl灌注并施加应激的小鼠与经ouabain灌注但无应激的小鼠之间的显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提供了一种通过将导管植入基底神经节和小脑并连接至渗透压泵，以建立药理学DYT/PARK-ATP1A3肌张力障碍小鼠模型的实验方案。本文描述了通过施加运动刺激诱导类肌张力障碍样运动，并利用行为评分系统对表型进行特征分析的方法。

植入渗透压泵并诱导应激以建立症状性药理学小鼠模型用于 DYT/PARK-ATP1A3 肌张力障碍研究

转基因小鼠模型在研究运动障碍时存在局限性，尤其是目前大多数可用的转基因啮齿类动物模型都……

本实验方案的总体目标是描述建立DYT/PARK-ATP1A3肌张力障碍症状性药理学小鼠模型的相关操作步骤，该模型通过在渗透压泵中使用脑部套管并结合具有挑战性的运动任务诱导应激来实现。本方法详细说明了如何利用渗透压泵通过多个脑部套管进行慢性药物递送，以建立药理学小鼠模型，并通过具有挑战性的运动任务诱导表型表达。这种轻度运动应激范式还可为基因-环境相互作用在运动障碍疾病中的作用提供研究线索，并可应用于其他啮齿类动物模型。动物实验均按照适用的国家和机构关于动物护理与使用的指南进行。首先在无菌环境中准备渗透泵。先用一支1毫升注射器连接27号填充套管，吸入经无菌过滤的哇巴因溶液或对照溶剂溶液。将渗透泵保持直立位置，将套管完全插入泵中，缓慢填充储液腔，直至顶部出现多余液体。接着，将流量调节器插入泵中。用剪刀小心取下流量调节器上的白色法兰，并将一段乙烯基管连接到流量调节器上。将每台泵浸入装有半管生理盐水的Eppendorf管中，并置于37摄氏度的PCR仪内，以确保在开始手术前泵速达到稳定状态。根据批准的方案将动物深度麻醉后，将其固定于立体定位仪中，并使用橡胶头或未穿破的耳杆固定头部。彻底消毒手术区域后，使用手术刀在头顶做切口，并用剪刀将切口延伸至前肢。使用动脉夹暴露颅骨，并用无菌棉签擦拭骨膜。将记号笔或用黑色墨水染色的套管尖端与前囟对齐，根据相应坐标在颅骨上标记脑部套管的三个穿刺点。接着，小心钻出用于基底神经节的双套管和用于小脑的单套管的孔洞。在纹状体与小脑之间钻第四个孔，用于植入一个小螺钉。该螺钉最终将被包埋于牙科水泥中，为套管提供额外固定。为在动物背部两侧创建用于植入渗透压泵的小型皮下囊腔，使用组织镊分离皮下组织层。将镊子朝向一条后肢推进，并略微张开镊子，以扩大皮下囊袋。对另一侧重复相同操作，首先将镊子从切口取出，然后轻柔地将其推向另一条后肢。借助镊子，小心地将泵体及其连接的导管分别插入每个皮下囊袋中。口袋应能让泵轻松滑入。使用微型泵固定器，将一根定制长度为 3.0 毫米的渗透压给药导管插入在小脑中线钻出的孔中。小心取下导管头部，并用牙科水泥固定导管以及小螺钉，注意不要覆盖渗透压泵管路的连接部件。继续手术前，确保套管周围的牙科水泥已完全干燥。在将双侧套管插入基底神经节上方的钻孔之前，将两段长度为0.5厘米的乙烯基管分别连接到双侧套管的两个连接部件上。使用分叉连接器将两段乙烯基管连接，并小心地用无菌哇巴因溶液或溶剂预先充满整个管路系统。接下来，重复之前单根导管所示的相同步骤，最后用牙科水泥固定双导管。将渗透泵的导管分别连接至分叉连接器和单根导管。两个泵的流速相等，因此需小心将装有双倍浓度溶液的渗透泵连接至分叉连接器，以确保基底神经节和小脑所接收的药物浓度相同。尽可能在不拉伸皮肤的情况下缝合动物背部的切口。皮下注射无菌生理盐水，生理盐水应达到体温，以避免脱水。将动物从立体定位仪上取下，并放入恢复笼中。为了诱导类似肌张力障碍的运动，应在手术后4小时开始，并在此后每24小时重复一次，使灌注哇巴因的小鼠接受具有挑战性的运动任务，作为一种轻度应激范式。此过程不包含对动物的行为学表征。此处我们展示一个灌注溶剂的小鼠示例：将小鼠置于一根50厘米长、表面粗糙的木杆上，头部朝下。在杆的底部提供足够的垫料，以防动物跌落。对于灌注哇巴因的小鼠，术后4小时应开始出现运动迟缓等初期症状。然而，术后24小时，应观察到前肢或后肢不自主的过度伸展，作为下降过程中肌张力障碍样运动的征象。小鼠应顺杆向下移动三次，每次下降之间至少留出两分钟的恢复时间。无需测量下降所需的时间。杆试验之后应进行第二项运动任务，使用旋转杆。与转棒性能测试相同，将应激组中灌注哇巴因和载体的小鼠放置在旋转棒上。无需测量跌落潜伏期。与之前测试相同，每只小鼠应在旋转棒上放置三次，每次运行之间给予两分钟恢复时间。改良型肌张力障碍评分量表可用于评估小鼠类肌张力障碍运动的频率、严重程度及身体分布情况。应将动物置于塑料或木质箱中，并记录四分钟时长的运动情况。评估者应对分组情况设盲。被视为类似肌张力障碍的运动或姿势包括前肢不自主地过度伸展、步幅增宽、后肢过度伸展以及脊柱后凸。若仅一个身体部位受累，应视为局灶性肌张力障碍；若躯干及至少两个其他身体部位均受累，则应视为全身性肌张力障碍。另一种新开发的评分系统，评分范围为0到8分，用于评估在尾部悬吊实验中肌张力障碍样运动的存在及其严重程度。进行该实验时，用手指捏住小鼠尾部靠近基部的位置，将其悬吊两分钟。建议在实验过程中录像，并在后续对录像资料进行分析以确定评分。前肢评分范围为0至4分。单侧或双侧前肢出现重复性或持续性强直性回缩，以及前肢过度伸展并交叉的表现，均记为类肌张力障碍。后肢的类肌张力障碍运动，即后肢回缩、紧握及持续性过度伸展，评分范围为0至3分。在记录时间中超过80%存在躯干扭曲的情况，额外加1分。后肢抓握是一种非特异性的运动功能障碍体征，不应评分。本图显示了肌张力障碍评分量表的结果。在72小时的观察期内，经哇巴因灌注并施加应激的小鼠表现出的类肌张力障碍运动显著多于未施加应激的哇巴因灌注组以及溶剂对照组动物。该图像展示了悬尾实验的结果，其结果与肌张力障碍评分量表相似。请注意，各时间点的数据为每只动物总评分的平均值结果。观看本视频后，您应能够充分理解如何立体定向植入多根脑部套管，以及如何皮下植入渗透压泵。该方法的主要优势在于可避免反复且具有应激性的注射操作，并可将诸如乌本苷等原本可能引起全身性副作用的物质直接递送至特定脑区结构。

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科研

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Neuroscience

神经科学

渗透泵的植入和压力的诱导，以建立一个症状，药理学小鼠模型DYT/PARK-ATP1A3肌张

来源：Wang, X. et. al.，基于渗透泵的药物递送用于中枢神经系统体内再髓鞘化研究。J. Vis. Exp.

基于渗透泵的神经治疗药物递送在脱髓鞘小鼠模型中的应用

我们描述了对新生小鼠进行标记和基因分型以及从中建立原代神经元培养物的实验步骤。该基因分型方法快速、高效且可靠，可实现核酸的自动化提取。这对于新生期致死的小鼠及其培养物尤其重要，因为这些实验要求在培养前完成基因分型。...

动物快速基因分型及脑神经元原代培养的建立

为了研究病理条件下大脑的重组，我们使用微型渗透泵将蛋白质直接递送至大脑，从而绕过血脑屏障。随后注射示踪剂，以研究在该蛋白质影响下大脑连接性的改变。...

在病理生理条件下研究大脑重组的微型渗透泵植入与示踪剂递送

由束缚应激后的足迹分析和悬挂箱实验组成的低成本方案，可用于评估小鼠模型的运动障碍。...

低成本小鼠足迹分析与悬挂箱实验方案在慢性束缚应激中的应用

通过植入渗透泵长期给予异丙肾上腺素已被广泛用于模拟小鼠的晚期心力衰竭。本文中，我们详细描述了微型泵植入手术的方法，以实现连续3周的异丙肾上腺素给药，以及通过超声心动图评估模型成功建立的方法。...

植入异丙肾上腺素微型泵以诱导小鼠心力衰竭

脱髓鞘现象发生在多种中枢神经系统疾病中。体内药物递送技术的可靠性对于促进髓鞘再生药物的测试至关重要。本方案描述了一种基于渗透泵的方法，可实现药物直接向脑实质的长期递送，提高药物的生物利用度，在髓鞘再生研究中具有广泛的应用前景。...

基于渗透泵的药物递送 在体实验 中枢神经系统髓鞘再生研究

本方案介绍了一种通过微型泵控释来曲唑在小鼠中诱导多囊卵巢综合征（PCOS）模型的技术。在充分麻醉条件下，将微型泵皮下植入小鼠体内，经过微型泵一定时间的释放后，成功诱导出小鼠PCOS模型。...

一种改良的小鼠多囊卵巢综合征诱导技术

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。...

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

在此，我们描述了一种实验方案 离体 从接受治疗的肌张力障碍仓鼠模型的急性小脑脑片中进行高密度微电极阵列记录 体内...

利用高密度微电极阵列研究苍白球深部脑刺激的全网络作用机制

磁共振成像（MRI）已成为研究基因改造小鼠表型的日益流行的工具。本文阐述了利用多只小鼠同时进行MRI扫描，以实现对基因改造小鼠高通量表型分析所必需的方法。...

多只小鼠神经解剖磁共振成像

了解如何通过渗透泵植入脑导管并施加运动压力，建立DYT/PARK-ATP1A3肌张力障碍小鼠模型。该方法支持慢性药物递送与行为表型分析，适用于研究运动障碍的基因环境相互作用机制。

植入渗透压泵并诱导应激以建立症状性药理学小鼠模型用于 DYT/PARK-ATP1A3 肌张力障碍研究

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