使用高分辨率熔解分析检测 CALR 基因中的遗传变异

该方法可准确检测疑似血液系统疾病患者中的钙网蛋白突变，尤其适用于其他诊断手段受限或与非血液系统疾病存在重叠的情况。高分辨率熔解技术的主要优势在于，能够在可接受的检测限范围内以较低成本检测钙网蛋白基因热点区域常见的体细胞遗传变异。该技术可实现骨髓增殖性肿瘤的快速、无创诊断，尤其适用于原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化。

目前，这在这些患者中对治疗方案的选择没有影响。然而，未来这种情况可能会改变。首先，按照文稿中的描述配制qPCR HRM预混液，为每个DNA样本和对照各准备三份复孔所需的量。

轻轻敲击并倒置离心管，再涡旋2到3秒，混匀反应液，然后短暂离心以收集管壁上的液滴。将19微升qPCR HRM预混液转移至96孔光学反应板的每个孔中。用移液器将1微升阴性对照、阳性对照和样品分别加入板中相应的孔内；对于无模板对照（NTC），加入1微升用于配制qPCR HRM预混液的无菌无RNA和DNA的水代替DNA。

用光学粘性封膜将反应板牢固密封，以防止运行过程中液体蒸发。然后在室温下以780 ×g离心1分钟。检查反应板各孔中的液体是否均位于孔底，随后开始检测。

在仪器系统软件中为对照和样本分配相应的孔位，并更改默认的仪器扩增程序。按照文本稿件中的描述对仪器进行编程，以便在qPCR结束后立即进行解离分析。运行结束后，查看并验证扩增曲线。

在仪器系统软件的实验菜单中选择扩增曲线选项。若未显示数据，请点击绿色的“分析”按钮。在“扩增曲线”选项卡中，从“曲线类型”下拉菜单中选择以循环数为函数、将扩增数据表示为相对于被动参比荧光归一化的荧光读数的曲线图；在“曲线颜色”下拉菜单中选择“样本”。

从图表类型下拉菜单中选择线性扩增图表类型，确认基线起始和结束循环数设置正确。结束循环数应设置在荧光信号显著增加之前的几个循环。然后从图表类型下拉菜单中选择以10为底的对数扩增图表类型，通过选择阈值选项在图表上显示阈值线，并调整阈值。

阈值线应穿过qPCR曲线的指数扩增阶段。请确认所有样本和阳性对照孔均具有正常的扩增曲线，且无模板对照（NTC）孔中无扩增信号。正常的扩增曲线表现为荧光信号在第15至35个循环之间出现指数增长，并超过阈值线。

在衍生熔解曲线中，检查熔解前和熔解后的区域或温度线。熔解前和熔解后区域应位于荧光信号平稳的范围内，不应存在明显的峰或斜率变化。如有需要，设定熔解前和熔解后温度线的起始与终止位置，两者之间间隔约 0.5 摄氏度。

如果调整了参数，请单击“分析”按钮以重新启动分析。在“差异电位”选项卡的“绘图设置”选项中，选择一个野生型对照重复样本作为参考 DNA，并单击“分析”按钮重新启动分析。在“比对后的熔解曲线”选项卡中，确认所有阳性对照均具有正确的基因型，且阴性对照（NTC）未发生扩增。

从孔板表中选择一个对照孔，以在分析图中高亮显示相应的熔解曲线，并确认曲线线条的颜色与正确的基因型相对应。在“比对熔解曲线”标签页中，仔细查看未知样本的曲线图，并将其与对照样本的曲线图进行比较。选择包含未知样本重复孔的孔位，并依次逐个选择包含对照样本的孔位，将未知样本的熔解曲线与对照样本按有序序列进行比对。

在“差异图”选项卡中分析未知样品的结果，以确认所获得的结果具有一致性。选择包含未知样品重复孔的孔位，并将熔解曲线按顺序与对照进行比对，逐一选择含有对照的孔。将qPCR HRM产物在含有荧光核酸染料的4%琼脂糖预制胶上进行电泳。

仅运行一个阳性、阴性、NTC 和样品的 qPCR HRM 重复实验。从包装中取出预制胶和胶盒，移除梳子，并根据制造商说明将凝胶插入电泳装置中。用无菌且无 RNA 和 DNA 的水将 10 微升样品稀释至 20 微升，然后每孔加入 20 微升稀释后的样品。

取3微升DNA大小标准溶液，稀释至20微升，加入标记孔中。将任何空孔用20微升无RNA和DNA酶的无菌水填充。立即根据所用凝胶的浓度选择程序，并将仪器运行时间设置为20分钟。

在上样后一分钟内开始电泳。电泳完成后，使用蓝光或紫外透射成像系统观察DNA和凝胶。在高分辨率熔解分析中，可靠鉴定遗传变异的前提是：目标DNA区域成功扩增，荧光信号在15至35个循环之间呈指数增长并超过阈值，且所有重复样本和对照组的定量循环值（Cq值）非常接近。

在qPCR结束后立即进行HRM分析，利用样本、对照和NTC的活性熔解区域生成其比对的熔解曲线图。正确设置熔解前和熔解后区域对于准确可视化和识别样本中的遗传变异至关重要。此处展示了比对的熔解曲线和不同的曲线图。

未知样本与其中一个阳性对照高度一致。若熔解前和熔解后区域或温度线设置不当，则会导致熔解曲线对齐，图谱出现差异，从而增加遗传变异正确鉴定的难度。通过将样本的条带模式与对照进行比较，可确定样本中的遗传变异类型。

通过结合高分辨率熔解曲线分析（HRM）和琼脂糖凝胶电泳，仅当样本所含的遗传变异与HRM检测中使用的某一种对照相同的情况下，才能实现正确的遗传变异鉴定。含有罕见钙网蛋白遗传变异的样本，其HRM结果和电泳条带模式均会有所不同。

在尝试本方案时，重要的是要仔细比较已知样本与对照样本的熔解曲线图谱的对齐显示。