用于分析依赖帽的翻译动力学的 体外 单分子成像测定

该协议很重要，因为它能够利用现有的无细胞翻译系统进行活性真核翻译的单分子分析。该技术的主要优点是它保留了大量翻译特性，提供单分子分辨率，并且相对容易适应其他大量翻译分析。该方法可应用于任何经验证可在批量条件下实现高效帽依赖性翻译的无细胞翻译系统。

演示该程序的是研究助理 Hongyun Wang 和瞿晓辉实验室的高级研究科学家 Anthony Gaba。在进行单分子实验前至少三个小时，打开显微镜培养箱并将气流降低到低速率，以避免对实验造成过度的声学干扰。然后将培养箱温度设置为无细胞翻译系统特有的最佳温度。

至少在实验前一小时，按下激光箱后面的激光电源按钮，转动激光安全钥匙，按下开始按钮打开激光器。打开显微镜并选择成像模式、物镜和滤光片组。打开 EMCCD 摄像头、载物台控制器、注射泵和计算机，然后打开摄像头、激光器、电动载物台和注射泵软件。

在激光控制软件中，单击连接设置激光强度，取消勾选快门框，然后单击控制在激光控制弹出窗口中拖动强度滑动条。输入穿透深度以将激光器设置为所需角度，并确认快门框已关闭，以便在不成像时将激光器保持在关闭模式。当相机冷却并稳定到其指定的工作温度后，在相机软件中，为采集模式选择 kinetic 并输入曝光时间、kinetic series length 和 electron multipling gain 值参数。

选择目录并分配文件名以保存数据图像文件。将注射泵设置为中等到快速的流速，并向微量离心管中加入 500 微升 70% 乙醇。将注射泵管路末端插入乙醇溶液中，并使用注射泵软件在抽取和分配模式之间切换注射泵，以用乙醇清洗管子 3 次，用不含 RNase 的水清洗 3 次。

最后一次水洗后，用干净的纸巾擦拭管端，以去除管子内部残留的水，然后将管子末端放入干净的微量离心管中。对于三个主要末端生物素化 mRNA 固定，将流动室放入显微镜样品架中，盖玻片面朝下，并用胶带固定腔室。使用胶带覆盖未使用的流道入口和出口，并向流道中加入 200 μg/mL 链霉亲和素溶液体积的 1.5 倍。

在室温下放置 10 分钟后，用每次洗涤体积为 3 倍的 T50 洗涤缓冲液和折叠的实验室组织洗涤并擦拭通道 3 次。最后一次洗涤后，将一滴浸油滴在显微镜物镜上，然后将支架和腔室放在显微镜载物台上。然后将物镜靠近盖玻片，直到物镜上的浸油接触盖玻片并移动样品台，使流道的位置位于物镜的正上方。

在显微镜控制触摸屏上，选择聚焦选项卡，然后单击聚焦搜索并开始。成功获得对焦平面后，将听到蜂鸣音。在相机软件中，选择实时模式。

在激光控制软件中，打开激光快门并调整激光强度级别。在实时模式下观察实时荧光图像，并在显微镜控制触摸屏中使用精细步进控制来调整物镜位置。在相机软件中，移动载物台以评估流道检测表面各个区域的荧光背景水平。

如果荧光低，请停止实时模式并关闭激光控制软件中的激光快门，并用两倍体积的生物素化 mRNA 溶液替换来自流道的洗涤缓冲液。15 分钟后，用每次洗涤体积为 3 倍体积的翻译兼容缓冲液洗涤通道 3 次。对于单分子检测，在冰上的微量离心管中组装三倍体积的新鲜解冻的不含 mRNA 的翻译混合物，并补充优化浓度的荧光标记抗体，然后短暂旋转试管以收集管底部的混合物。

将翻译混合物转移到 700 μL 微量离心管盖的内部，并将注射泵设置为抽取模式。将泵管末端插入转化混合物中，然后开始注射器抽出。当转化混合物完全进入泵管时，停止抽取，将注射泵设置反转为分配模式，并将流速设置为翻译混合液输送的最佳速率。

根据需要启动和停止注射器，让转化混合物到达管道末端，并将泵管道末端插入流道的入口，注意避免气泡。将定制的金属支架拧到显微镜样品支架板上，以稳定连接并评估显微镜焦点和成像区域的荧光。确认影片采集参数正确无误，并且已输入适当的文件名和目录以保存文件。

移动载物台，以便对流道检测表面中心的区域进行成像。然后在 continuous AF 选项卡下，单击 Start 开始 按钮。成功获得对焦平面后，将听到蜂鸣音。

减少环境光后，打开激光快门并单击 take signal 按钮开始录制。五秒钟后，输入 run 命令以将翻译混合传送到流通道中。然后，以每帧时间 0.5 到 2 秒的分辨率记录数据，最长 2 小时。

为了分析 Cy3 ANTI-FLAG 结合事件，对整个电影的选定 Cy3 alpha 标志点的荧光强度逐帧计算并连接以形成强度轨迹。原始轨迹可能看起来有噪点，可能需要使用非线性向前/向后滤波器进行优化，以减少背景噪声。使用步数检测算法对轨迹进行数字化，可以实现进一步的细化。

抗体与新生多肽结合导致荧光瞬时增加，而抗体多肽解离导致荧光瞬时降低。荧光素酶标志 mRNA 的停留时间直方图拟合对数正态分布，产生的肽合成速率为每秒 2.5 个氨基酸或负 0.1 个氨基酸。第一次到达时间直方图拟合移位对数正态函数，说明单个 mRNA 翻译活性的高度异质性。

如直方图所示，单个荧光素酶标记 mRNA 分子上的第一个肽合成事件最早可在翻译混合物递送后 2 分钟开始，最晚可在翻译混合物递送后 20 分钟开始。与使用荧光素酶标记 mRNA 的翻译相比，带有发夹荧光素酶标记 mRNA 翻译的首次到达时间直方图显示抗体结合速度较慢。然而，使用这些相同的 mRNA 进行无细胞翻译反应的体发光测量并不能解决翻译动力学的差异。

该测定的单分子分辨率提供了更多关于帽依赖性翻译的动力学见解，这是其他方法不容易获得的。真核生物的无细胞翻译对微小的变化和实验条件敏感。因此，在使用该检测准确检测翻译中的微小差异时，注重细节和一致性至关重要。