Name: 用于分析依赖帽的翻译动力学的 体外 单分子成像测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解体外单分子成像测定技术，用于分析真核生物依赖帽的翻译动力学。该方法利用无细胞翻译系统，保留整体翻译特性并提供单分子分辨率，为研究蛋白质合成机制提供高分辨率见解。

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本工作由美国国立卫生研究院 [R01GM121847]、纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）支持基金/核心基金（P30 CA008748）以及 MSKCC 功能基因组学计划资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

与典型的相比 体外 TIRF单分子实验，此处所述检测方法因使用细胞提取物和高浓度荧光标记抗体而更加复杂。与通常仅进行一轮表面聚乙二醇化（PEGylation）的做法相比，第二轮PEGylation（步骤2）可显著降低抗体对检测表面的非特异性结合15荧光抗体的高浓度扩散会导致极强的荧光背景，从而掩盖抗体结合的单分子检测信号。为降低该荧光背景，需将激光入射角调至远高于临界角（步骤3.4）。抗体检测还可能因荧光染料的过度不稳定而受限，这会限制对结合停留时间的定量分析能力。当遇到此问题时，应将荧光染料替换为光稳定性更高的荧光染料，例如与三重态猝灭剂偶联的荧光染料。47，或降低激光照射强度。尽管氧气清除系统通常用于 体外 单分子实验中抑制荧光团光漂白的方法48,49该检测方法无需使用任何氧气清除系统，即可提供非常宽泛的检测窗口15此外，除氧系统会显著降低...

真核系统中的翻译主要通过7-甲基鸟苷（m7G）帽依赖性途径1研究表明，真核生物翻译的起始步骤是限速步骤，也是调控的常见靶点2,3,4. 基于帽结构的翻译机制已通过遗传学方法被广泛研究5，生化6,7,8，结构的9，以及基因组学10 整体方法。尽管这些方法已鉴定出多种调控帽依赖性起始的机制，但由于分辨率的限制，它们只能对异质且不同步的起始事件产生的信号进行集合平均。最近，单个 体内 通过检测荧光抗体与新生多肽上表位的结合，可对翻译事件进行可视化观察11,12,13,14然而，这些新方法在解析单个起始事件方面也存在局限性，因为必须有多个荧光标记的抗体结合到新生肽链上，才能从较高的细胞内荧光背景中分辨出单个翻译事件。在许多生物学相互作用中，解析单个动力学事件为理解复杂的多步骤且重复的生物学过程提供了关键见解，而这些过程在分子水平上难以实现同步。为了更深入地理解帽依赖性起始及其调控机制，亟需能够追踪单个翻译事件动态变化的新方法。
我们最近开发了一种 体外 一种以单分子分辨率测量帽依赖性起始动力学的检测方法15考虑到该起始途径中涉及的大量已知和未知蛋白质因子3,16单分子检测技术被开发为可与现有技术兼容 体外 无细胞翻译系统，可保留细胞因子并维持高效的翻译活性17,18,19,20,21,22,23,24,25此外，无细胞翻译系统的使用使得单分子观测结果与以往的群体实验结果之间能够进行更为兼容的比较。该方法可将新的单分子动力学信息直接整合到现有的帽依赖性起始机制框架中。为建立单分子检测体系，对传统的无细胞翻译系统进行了三方面的改造：在报告mRNA开放阅读框（ORF）的起始位置插入一段编码表位的序列；对报告mRNA的3′端进行生物素标记，以实现mRNA末端与单分子检测表面的固定；并在翻译提取物中添加荧光标记的抗体。这些改造仅需常规的分子生物学技术及普遍可得的试剂即可完成。此外，这些修饰以及单分子成像条件均能保持群体无细胞翻译反应的翻译动力学特性15.
在此实验中（图1），5′端加帽且3′端生物素标记的报告mRNA被固定于流式室内的链霉亲和素包被检测表面。随后将流式室填充含有荧光标记抗体的无细胞翻译混合物。当mRNA翻译进行至表位序列下游约30–40个密码子时26,27，表位从核糖体出口通道暴露出来，可与荧光标记的抗体发生相互作用。该相互作用迅速，通过单分子荧光成像技术可检测到这一过程，从而在无细胞翻译活跃进行时以单分子分辨率追踪翻译动力学。该检测方法应具有广泛的应用价值 体外 帽依赖性翻译动力学及其调控机制的研究，特别是针对具有功能性整体组分的系统 体外 检测
建立该单分子检测方法的前提是具备一个可正常工作的无细胞体外翻译体系，该体系可使用 commercially available 的翻译提取物，或按照先前描述的方法制备的提取物来实现。28真核生物翻译提取物可从多种细胞中获得，包括真菌、哺乳动物和植物细胞28成像需要配备可调激光强度和入射角的全内反射荧光显微镜（TIRF）、电动样品台、自动化流体系统以及样品温度控制装置。此类要求在现代 体外 单分子TIRF实验可采用不同方式实现。本文所述实验使用一种基于物镜的TIRF系统，该系统由 commercially available 显微镜、软件及附件组成，具体清单见下文 材料表.

<table><tbody><tr><td>100倍油镜，数值孔径 1.49</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺（40%，19:1）</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>碱性液体洗涤剂</td><td>Decon</td><td>5332</td><td></td></tr><tr><td>氨基硅烷（N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷）</td><td>UCT Specialties, LLC</td><td>A0700</td><td></td></tr><tr><td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis 软件</td><td>Andor</td><td></td><td>用于控制 Andor EMCCD</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma</td><td>532/640/25</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma</td><td>NF03-405/488/532/635E-25</td><td></td></tr><tr><td>生物素-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Biotin-PEG-SVA</td><td></td></tr><tr><td>辅酶A游离酸</td><td>Prolume</td><td>309-250</td><td></td></tr><tr><td>Coolterm 软件</td><td></td><td></td><td>用于控制注射泵</td></tr><tr><td>台式计算机</td><td>Dell</td><td></td><td>用于控制显微镜、相机、载物台和泵</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>R405/488/532/635</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA 微量提取试剂盒 50RNX</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1139450</td><td></td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测系统</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>萤火虫荧光素 D-荧光素游离酸</td><td>Prolume</td><td>306-250</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185500</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-500ML</td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Olympus</td><td>Z-81226A</td><td>低自发荧光</td></tr><tr><td>荧光素酶检测系统</td><td>Promega</td><td>E1500</td><td></td></tr><tr><td>MEGASCRIPT T7 转录试剂盒</td><td>Thermo fisher</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>MMX04751</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗FLAG M2-Cy3抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9594</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>MS(PEG)4</td><td>Thermo Scientific</td><td>22341</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1.5号显微镜盖玻片</td><td>Fisherband</td><td>12-544-C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 激光器，532 nm，100 mW</td><td>Olympus 数字激光系统</td><td>CMR-LAS 532nm 100mW</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TirfCtrl 软件</td><td>Olympus</td><td></td><td>用于控制激光强度和入射角度</td></tr><tr><td>光学平台</td><td>TMC 振动控制</td><td>63-563</td><td>带振动隔离功能</td></tr><tr><td>苯酚-氯仿-异戊醇混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RNA 3'端生物素标记试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>20160</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾颗粒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prior 电动XY平移载物台</td><td>Prior</td><td>PS3J100</td><td></td></tr><tr><td>Prior PriorTest 软件</td><td>Prior</td><td></td><td>用于控制 Prior 电动载物台</td></tr><tr><td>重组RNasin核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>载物台培养箱</td><td>In vivo scientific (World Precision Instruments)</td><td>98710-1</td><td>配有定制亚克力笼</td></tr><tr><td>染色缸</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Thermo Scientific</td><td>43-4301</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300212</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7564</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>1725RN</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard apparatus</td><td>55-3333</td><td></td></tr><tr><td>Tris (1M)，pH = 7.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson</td><td>CPX1800H</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>痘苗病毒加帽系统</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-Spin IC 柱</td><td>Zymo Research</td><td>C1004</td><td></td></tr></tbody></table>

一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

帽依赖性蛋白质合成是真核细胞中主要的翻译途径。尽管已有多种生物化学与遗传学方法被用于深入研究帽依赖性翻译及其调控机制，但对该翻译途径的高分辨率动力学表征仍然缺乏。最近，我们开发了一种体外（in vitro）检测方法，可实现以单分子分辨率测量帽依赖性翻译动力学。该检测基于荧光标记抗体与新生表位标签多肽的结合。通过成像抗体与新生肽–核糖体–mRNA复合物的结合与解离过程，可追踪单个mRNA上的翻译进程。本文中，我们提供建立该检测方法的详细方案，包括mRNA与聚乙二醇化载玻片的制备、翻译的实时成像以及单分子轨迹的分析。该方法能够追踪单个帽依赖性翻译事件，并解析关键的翻译动力学参数，如起始速率与延伸速率。该检测方法可广泛应用于不同的翻译系统，将为帽依赖性翻译动力学及翻译调控机制的体外（in vitro）研究提供广泛支持。

按照所述方案，可在3'端固定化的报告mRNA进行活跃的无细胞翻译过程中，以单分子分辨率对单个抗体与新生N端标记多肽的相互作用进行成像（图1）。本研究使用三种合成mRNA进行了一项最小化的示范实验：LUC（编码无标签的荧光素酶）、LUCFLAG（编码3xFLAG标签荧光素酶）以及hp-LUCFLAG（在5'前导区含有稳定茎环结构的LUCFLAG）（图2C）。使用编码荧光素酶的mRNA可实现单分子观测结果与整体发光测量数据之间的比较。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和RNA染色评估3'端生物素化mRNA的完整性。高质量的mRNA应呈现单一清晰条带，不应出现额外的快速迁移信号（图3A）。本实验采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae...

追踪单个翻译事件可实现对帽依赖性翻译机制的高分辨率动力学研究。本文中我们展示了一种 体外 基于荧光标记抗体与表位标记新生肽段之间相互作用成像的单分子检测方法。该方法可实现对活性翻译过程中起始及肽链延伸动力学的单分子表征 体外 帽依赖性翻译

依赖于帽子结构的蛋白质合成是真核细胞中主要的翻译途径。尽管已有多种生物化学和遗传学方法使得……

本方案具有重要意义，因为它能够利用现有的无细胞翻译系统，实现对活性真核翻译的单分子分析。该技术的主要优势在于，它可保留整体翻译特性，提供单分子分辨率，并且相对容易从其他整体翻译检测方法中进行改造和应用。该方法可适用于任何已在整体条件下被证实能够有效支持帽依赖性翻译的无细胞翻译系统。演示该实验步骤的是来自曲晓慧实验室的研究助理王洪云和高级研究员Anthony Gaba。在进行单分子实验前至少三小时，打开显微镜培养箱并将气流调至低速，以避免对实验造成过度的声学干扰。然后将培养箱温度设定为无细胞翻译系统所需的最适温度。实验开始前至少一小时，按下激光器盒子后方的激光电源按钮，转动激光安全钥匙，并按下启动按钮以开启激光器。打开显微镜，选择成像模式、物镜和滤光片组。开启EMCCD相机、载物台控制器、注射泵和计算机，并启动相机、激光器、电动载物台和注射泵的软件。在激光控制软件中，单击“连接”以设置激光强度，取消勾选快门框，然后单击“控制”以在弹出的激光控制窗口中拖动强度滑动条。输入穿透深度以将激光设置为所需角度，并确认快门框已关闭，以便在不进行成像时使激光保持关闭状态。当相机冷却并稳定至其指定工作温度后，在相机软件中选择“动力学”作为采集模式，并输入曝光时间、动力学序列长度以及电子倍增增益值参数。选择保存数据图像文件的目录并指定文件名。将注射泵设置为中等至较快的流速，向微量离心管中加入 500 µL 70% 乙醇。将注射泵管路末端插入乙醇溶液中，使用注射泵软件在抽取和排出模式之间切换，用乙醇冲洗管路三次，再用无 RNase 水冲洗三次。最后一次水洗后，将管路末端轻触干净的擦拭纸，以去除管内残留的水分，并将管路末端插入干净的微量离心管中。对于3'端生物素标记的mRNA固定，将流动池放入显微镜样品架中，使盖玻片一侧朝下，并用胶带固定流动池。用胶带封住未使用的流道入口和出口，并向流道中加入1.5倍体积的200微克/毫升链霉亲和素溶液。室温孵育10分钟后，用T50洗涤缓冲液以每次洗涤三倍于通道体积的用量，用折叠的实验室擦拭纸洗涤并擦干通道三次。最后一次洗涤后，在显微镜物镜上滴加一滴浸油，将样品 holder 和样品室放置在显微镜载物台上。然后将物镜缓慢靠近盖玻片，直至物镜上的浸油与盖玻片接触，并移动样品载物台，使流动通道的位置正对物镜镜头下方。在显微镜控制触摸屏上，选择“对焦”选项卡，然后点击“对焦搜索”并开始。当成功达到对焦平面时，会听到一声蜂鸣声。在相机软件中，选择实时模式。在激光控制软件中，打开激光快门并调节激光强度。在显微镜控制触摸屏上，以实时模式观察荧光图像，并使用微调步进控制调节物镜位置。在相机软件中，移动载物台以评估流道检测表面不同区域的荧光背景水平。如果荧光信号较弱，停止活体成像模式，在激光控制软件中关闭激光快门，并用两倍于流道体积的生物素化 mRNA 溶液替换流道中的洗涤缓冲液。15 分钟后，每次使用三倍于流道体积的翻译兼容缓冲液，洗涤流道三次。对于单分子检测，取三倍体积的新鲜解冻翻译反应混合物（不含 mRNA），加入优化浓度的荧光标记抗体，在冰上的微量离心管中混匀，短暂离心以使混合液沉降至管底。将翻译反应混合物转移至700微升微量离心管管盖内表面，将注射泵设置为吸取模式。将泵管末端插入翻译反应混合物中，启动注射器吸取。当翻译反应混合物完全进入泵管后，停止吸取操作，将注射泵设置反转至 dispensing 模式，并将流速调节至适合输送翻译反应混合物的最佳速率。根据需要启动和停止注射器，使翻译混合物到达管路末端，并将泵管末端插入流动通道的入口，注意避免产生气泡。将定制的金属支架拧紧到显微镜样品 holder 板上以稳定连接，并调整显微镜焦距和成像区域的荧光。确认影片采集参数设置正确，并已输入适当的文件名和保存路径用于存储文件。移动载物台，使成像区域位于流动通道检测面的中心位置。在连续 AF 选项卡下，点击开始按钮。当成功达到焦平面时，会听到一声蜂鸣声。降低环境光后，打开激光快门，点击“采集信号”按钮开始记录。五秒后，输入运行命令，将翻译混合物注入流动通道。随后以每帧0.5至2秒的时间分辨率记录数据，持续时间最长可达两小时。为了分析Cy3 ANTI-FLAG结合事件，对整个视频中选定的Cy3抗FLAG斑点的荧光强度逐帧进行计算，并连接形成强度轨迹。原始轨迹可能显得嘈杂，可能需要使用非线性前向/后向滤波器来降低背景噪声。可通过步进检测算法对轨迹进一步优化，实现轨迹的数字化。抗体与新生多肽结合会导致荧光瞬时增强，而抗体与多肽解离则会引起荧光瞬时减弱。荧光素酶 flag mRNA 的停留时间直方图符合对数正态分布，得出的肽链合成速率为每秒 2.5 ± 0.1 个氨基酸。首次到达时间直方图符合偏移的对数正态函数，表明单个 mRNA 翻译活性具有高度异质性。如直方图所示，在单个荧光素酶flag mRNA分子上，首次肽链合成事件最早可在翻译混合物加入后两分钟开始，最晚可达20分钟。与使用荧光素酶flag mRNA的翻译相比，发夹结构荧光素酶flag mRNA翻译的首次到达时间直方图显示出抗体结合速度较慢。然而，利用这些相同mRNA在无细胞翻译反应中进行的整体发光测量，并不能分辨翻译动力学的差异。该检测方法的单分子分辨率可提供有关帽依赖性翻译的更多动力学信息，而这些信息通过其他方法难以获得。真核细胞无细胞翻译体系对微小的实验条件变化非常敏感，因此在使用该方法准确检测翻译过程中的细微差异时，细节把握和操作一致性至关重要。

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用于分析依赖帽的翻译动力学的 体外 单分子成像测定

我们介绍一种荧光显微镜方法——翻译偶联切割激活法（Co-Translational Activation by Cleavage, CoTrAC），可在不干扰蛋白质功能的前提下，以单分子精度对活细胞中蛋白质分子的生成进行成像。该方法已被用于追踪转录因子λ阻遏蛋白CI 1...

基因调控的单分子成像 在体 利用共翻译切割激活（CoTrAC）

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活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化RNA转录本进行实时成像

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定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

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基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测法研究痘病毒感染细胞中的翻译调控

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快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

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单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

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