澳大利亚同步辐射光源上用于序列晶体学测量的脂质注射方案

本方案为科学家提供了表征嵌入高黏性材料及其他现有装置难以表征的软质材料中蛋白质晶体的机会。使用该方法时，样品在玻璃注射器中制备，然后直接安装到喷射器上，使喷射系统易于操作并最大限度减少样品损耗。在高黏性介质中制备晶体时，首先将晶体溶液以低速离心，形成柔软的晶体沉淀。

吸除多余培养基后，将一个连接器固定在一支100微升玻璃注射器的末端，并向注射器筒内加入28微升结晶溶液。缓慢将推杆插入注射器顶部，轻柔推动溶液至连接器尖端。为去除气泡，用戴手套的手指轻轻按压钝化连接器针尖顶部以形成密封，然后回拉推杆，使溶液远离针尖，在注射器内产生压力积聚；随后移开手指，迅速释放压力，从而击破注射器内的任何气泡。

或者，用一只手握住注射器，使针头朝上，活塞卡在两根手指之间，快速将持注射器的手臂朝一个方向旋转两到三次。由此产生的离心力会将注射器中的所有气泡排出。待所有气泡完全排出后，使用细小的刮刀将42 µL高真空硅脂直接加至第二个100 µL注射器的顶部，然后将活塞完全推到底端，以排除任何残留气泡，并确保注射器末端无空气间隙。

当两个注射器中的所有气泡均被完全排出后，用手握住两个注射器的末端，用连接器将它们连接起来。为混合样品，轻柔地依次推动晶体溶液和硅脂注射器的活塞 50 至 100 次，直至材料充分混合并呈现均匀状态。随后在光学显微镜下观察晶体。

为了确定硅脂中晶体的浓度，使用光学显微镜图像在特定区域内计数晶体数量。若需降低晶体浓度，可使用更大体积的硅脂重复晶体制备过程，或在注射器组装前将晶体沉淀用结晶缓冲液稀释。若需提高晶体浓度，可使用较小体积的硅脂重复晶体制备过程，但需注意避免将黏度降至10帕斯卡·秒以下。

当获得适当的晶体浓度后，将整个样品转移至单个注射器中，并将连接器更换为内径为108微米的注射针头，将其牢固地拧入注射器底部。设置注射器时，选择工具和归位模式以及负向限位开关，启动归位程序，让软件运行直至螺杆回缩至足以容纳100微升注射器的位置。将空注射器的针头穿过注射器支架上的狭缝，将注射器安装到注射装置上，并使注射器紧贴支架。

将一个O形圈缠绕在注射器的中段，将该圈固定在注射器两侧的挂钩上，再用第二个O形圈绕在注射器上段的挂钩上。确保第二个O形圈的一部分位于玻璃注射器的顶部。准备样品注射器时，先对注射器进行预润，将进样器帽安装在样品注射器的推杆头部，然后将注射器装入进样器中。

将驱动丝杠移至帽顶。在注射器控制软件中，选择速度模式并激活该模式。将设定值设为 3,000 转每分钟，然后点击应用设定值。

当螺杆接近注射器推杆头的端盖时，将设定值更改为零。接触到位后，单击应用设定值以激活预设值，使螺杆立即停止。然后轻轻晃动端盖，确保其牢固固定。

运行注射器时，将设置值调整为每分钟100转，并目视检查针尖，观察样品开始挤出的情况。关闭防护罩后，以每次10转的幅度逐步降低设置值，直至观察到材料流出缓慢但稳定。如果样品流不顺畅，以每分钟10转的幅度逐步提高设置值，直到液流变得更平直。

如果液流无法稳定，可在样品液流下方插入一个聚苯乙烯样品收集器，以帮助引导样品。或者，可将文丘里抽滤漏斗插入样品收集器中，并将其连接至澳大利亚同步辐射装置隔间内的空气出口管。为确定液流的流速，请使用Lipidico装置流速计算器。

确定注射器的最佳样品运行速度对于流体稳定性至关重要。流速过慢会导致注射器中挤出的硅脂扩张，而流速较快则会产生更细的液流。黏性介质液流出现卷曲现象的情况经常被观察到。

为解决高电荷样品中的这一问题，可使用聚苯乙烯捕集器引入微弱的静电力。在本分析中，采用一支玻璃注射器，其中含有26微升悬浮在硅脂中的溶菌酶晶体。在38分钟内收集到了足够量的数据，从而能够生成溶菌酶结构中二硫键周围区域的电子密度图。

请记住，在载玻片上使用少量样品来评估样品的晶体浓度，以确定是否需要校正黏度。该注射器的多功能性使其可用于对其他高黏度材料进行X射线表征。例如，可用于电池研究中的离子液体结构或乳制品中的胶体材料。