利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

共聚焦断层扫描技术的开发旨在全面获取癌细胞在与细胞屏障和微环境相互作用时的各种行为特征。该方法为研究转移过程的发生提供了基础。此方法适用于对活细胞行为进行定量分析。

共聚焦断层扫描技术若与机器学习相结合，可广泛应用于多种器官芯片平台。分析原发性或复发性肿瘤以及循环肿瘤细胞，可能成为预测脑转移并区分脑转移性与非脑转移性细胞的重要诊断工具。为组装微流控BBN装置，需将装置从真空干燥器转移至适当表面，使入口朝下，并将整个装置放入等离子体腔室中。

将整个装置放入等离子腔室中，先抽真空，然后在80瓦功率下进行30秒的等离子处理。处理结束后，使用导向工具迅速将装置（进样口朝上）放置于实验台上的载玻片表面，使装置的PDMS部分与载玻片之间形成永久性键合。接下来，将200微升移液枪头从尖端截去2毫米后插入所有进样口和出样口，并将装置放入等离子腔室，进行8分钟、200瓦的等离子处理。

待设备冷却后，将该设备放入无菌的次级容器中，并在质粒处理后的15分钟内，通过底部腔室的移液枪头向设备中加入120微升胶原星形胶质细胞溶液。使溶液通过毛细作用扩散至对侧移液枪头，并填充设备的下一个通道。当设备的全部四个通道均被填满后，将芯片置于细胞培养孵育箱中孵育一小时。

当胶原凝固后，使用适当的完全细胞培养基填充底部室的所有移液管尖端，并在上室中加入2%生长因子减少型Matrigel（用完全内皮细胞培养基稀释）。当两个腔室均完成包被后，将装置放入培养箱中孵育1小时，然后用适当的培养基冲洗上室。交替使用各尖端，每隔15分钟向上室每根尖端加入30微升含一乘以十的六次方个内皮细胞/毫升的适当培养基，每根尖端共加入四份细胞悬液。

在接种间隔期间将装置置于培养环境中孵育。当所有内皮细胞接种完成后，用培养基填充所有尖端，并将装置放回细胞培养孵箱中孵育48小时。当内皮层成熟后，更换芯片中的培养基以补充新鲜细胞培养液，并向每个上层腔室通道中接种30 µL含一乘以十的六次方个癌细胞每毫升相应培养基的细胞悬液。

每次接种 30 微升细胞悬液后，将装置放回培养箱中孵育 15 分钟，然后用适当的培养基填充所有加样尖端，并将装置放回细胞培养孵箱中继续培养 24 至 48 小时。在装置完成培养并成像后，为测量癌细胞的表型，打开提供的软件并将共聚焦图像读入内存。该软件会将三维共聚焦图像中的每个颜色通道分别保存为独立的 TIFF 文件。

选择“更改每个显微镜通道的不透明度值”，并调整图像中各颜色通道的通道 alpha 值，以去除背景，仅保留细胞内的荧光信号。为观察调整效果，选择“查看三维渲染”以确认阈值设置是否正确；若图像显示正常，将不透明度值保存至实验记录电子表格中。随后，使用移动立方体算法（marching cubes）将体图像转换为独立的三维三角网格对象，并以 VTK 数据格式保存。

为了拟合内皮屏障的平面，首先需要确定细胞的质心。使用多数据连通性滤波器遍历 VTK 文件中的网格列表，提取不相连的区域。计算每个网格的质心，并将测量结果添加到质心列表中，同时过滤掉过大或过小的网格。

为了对内皮细胞的中心点列表进行平面拟合，请使用误差最小化方法，运行“可视化RFP中心点及平面拟合”以生成并绘制拟合平面，并检查平面的拟合情况，必要时手动调整拟合。当平面正确拟合后，将该平面的法向量保存至实验记录文件中。在利用平面表征内皮层后，为测量每个癌细胞的表型，请加载细胞分析功能，并运行“读取实验记录信息并分析现有通道”，以遍历并分析VTK文件中的每个区域。

对于每个区域，该函数将裁剪每个细胞，以计算细胞膜下方的网格。为了测量细胞表型，需计算每个癌细胞的形态、体积和位置。然后测量每个被裁剪癌细胞的体积和位置，以计算通过内皮屏障外渗的细胞所占的百分比。

在完成多个实验的上述步骤后，将数据导出为单个 xlsx 文件，以便将数据保存在电子表格中。具有融合内皮屏障的微流控 BBN 芯片可用于实验，而内皮覆盖特别差的微流控 BBN 芯片则不可用于实验。在此代表性分析中，靶向脑组织的癌细胞系表现出一个亚群，该亚群可穿过内皮屏障并迁移至微流控 BBN 芯片的脑微环境空间深处。暴露后两天和九天，亲代癌细胞仍有相当比例的细胞停留在屏障上方，远离脑微环境空间；而脑转移性癌细胞群体中，有超过 100% 的细胞发生了跨内皮迁移。

对癌细胞形态的定量分析表明，亲代细胞在接种后第一天呈球形的细胞较少，而在与环境相互作用两天和九天后，两种癌细胞系均呈现出球形度下降的趋势。此外，渗入星形胶质细胞微环境的癌细胞亚群相较于仍与血管内皮屏障相互作用但未渗入脑组织的癌细胞体积更小。具有脑趋向性的癌细胞系及患者来源的异种移植模型在微流控BBN芯片中表现出一种表型模式，该模式可被机器学习方法用于区分脑转移性与非脑转移性癌细胞。

自我筛选非常重要。高内皮细胞在较低传代次数时表现出不同的屏障特性。此外，癌细胞及其荧光表达可能随时间发生变化。

经过该操作后，研究人员可对装置内细胞或其分泌物来源的细胞进行分子谱型分析，以研究转移的分子机制。该技术通过结合人工构建的微环境与随时间变化的生态位组分定量成像，能够探索癌细胞与其微环境之间的复杂相互作用。