Name: 使用有机体片 3D 模型、机器学习和共声断层扫描量化脑转移肿瘤微环境 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解如何利用微流控芯片、共聚焦断层扫描和机器学习量化脑转移肿瘤微环境。该方法结合人工智能分析癌细胞与血脑屏障的相互作用，为预测脑转移提供诊断工具。

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我们感谢美国国家癌症研究所Steeg实验室慷慨提供MDA-MB-231-BR-GFP细胞。共聚焦显微镜实验在密歇根大学生物界面研究所（BI）完成。流式细胞术在密歇根大学流式细胞术核心实验室完成。病毒载体由密歇根大学载体核心实验室构建。我们还感谢Kelley Kidwell在本数据统计分析方面提供的指导。
资助：
C.R.O. 部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）T-32 培训基金（T32CA009676）和 1R21CA245597-01 项目的支持。T.M.W. 部分得到了 1R21CA245597-01 项目以及美国国立卫生研究院转化科学促进中心（Award Number UL1TR002240）的支持。材料与表征工作的经费由美国国立卫生研究院国家癌症研究所（Award Number 1R21CA245597-01、P30CA046592、5T32CA009676-23、CA196018）、AI116482、METAvivor 基金会和乳腺癌研究基金会提供。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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无任何需要声明的披露事项。

我们开发并提出了一种新方法，该方法借鉴了临床影像分析中常用的工具，用于测量癌细胞穿过内皮屏障进入脑组织的外渗和迁移过程。我们认为该方法既可用于体内也可用于体外测量；我们已在一种模拟脑血管系统的三维微流控系统上验证了其应用。该技术可定量分析癌细胞的多项指标，包括外渗距离、按体积计算的外渗百分比、球形度以及细胞体积。外渗距离和按体积计算的外渗百分比可帮助用户重建癌细胞在芯片内的位置，以评估其跨屏障外渗及在组织内的迁移情况。细胞形态参数如球形度和体积，则反映了细胞在各个时间点的动态运动或功能状态。迁移性 MDA-MB-231-BR-GFP 细胞在初次引入 µmBBN 装置时表现出较高的球形度，随着其运动减弱并开始定植于微环境，细胞形态逐渐变得不那么规则。MDA-MB-231-GFP 与 MDA-MB-231-BR-GFP 细胞的总体积存在差异，这是由于两种细胞系的形态不同所致。穿过内皮屏障的癌细胞比未穿越屏障的细胞更接近圆形，因此较小且更圆的细胞可能更高效地穿过内皮层实现外渗。
该方案中有两个关键步骤可确保实验成功。第一步是在组装由多孔膜分隔的 µmBBN 装置上部和下部时进行的。上下两...

脑转移是致死性最高的癌症病灶；所有癌症中有10-30%会发生脑转移，中位生存期仅为约5-20个月，具体取决于癌症类型1,2。在研究癌症转移时，一个关键的科学问题是：亚克隆细胞如何从血液的体液环境中迁移至脑等器官3,4。这一问题催生了多种迁移、侵袭和血管外渗实验方法。这些方法均包含一个关键步骤，即计数或测量在刺激因素作用下从一个位置移动到另一个位置的细胞的特性。目前大多数可获取的迁移实验主要用于研究癌细胞的二维（2D）迁移，虽已揭示大量科学知识，但无法模拟体内系统真实的三维环境，而其他方法则可提供此类三维信息5。因此，有必要在三维（3D）体系中研究肿瘤微环境（TME），但目前可用于3D结构的分析方法仍有限且常缺乏一致性。
最常用的三维工具之一是Boyden小室，其结构为在孔底部悬挂一张膜，将两个不同区域分隔开。Boyden最初提出该检测方法用于研究白细胞趋化作用4。可通过改变下层区域的化学成分或其他方式6,7，诱导上层区域的细胞向下层迁移。目前最常用的定量迁移细胞数量的方法是：使用缓冲液将膜底部的细胞释放，裂解细胞后，根据溶液中DNA含量来计数7。这种间接方法由于操作技术的差异容易引入人为误差，且该过程会破坏有关肿瘤表型及微环境的信息。Boyden小室检测的其他改进方法包括对仍附着在膜上的迁移细胞进行固定，但这些方法仅能提供细胞数量，而细胞已失去活性，无法用于后续研究6,8,9。
由于Transwell小室存在局限性，同时微流控技术领域不断创新，研究人员已开发出细胞迁移检测芯片，可观察细胞在单一方向刺激下的运动行为，而非三维方向10,11,12。这类迁移检测方法能够更好地控制流动条件或实现单细胞分离13,14等影响因素，从而更准确地解读实验结果；然而，其二维结构不可避免地会丢失部分动态信息。近期研究聚焦于在三维环境中模拟细胞外渗过程（即细胞从循环系统进入组织的过程，例如穿越血脑屏障）14,15。相较于使用Transwell小室或二维微流控迁移装置所获得的测量数据，细胞在组织中的外渗距离及其在细胞屏障/膜处的探测行为能够被更精细地解析16。因此，能够支持对三维外渗过程进行适当成像与分析的实验装置对于获取这些复杂数据至关重要，但目前相关技术在文献中仍显不足。
除了迁移实验外，人们已开发出适用于磁共振成像（MRI）和断层扫描的稳健成像技术，能够识别并精确重建三维空间中的组织17,18。这些技术通过获取z轴堆叠图像，根据组织特性对图像部分进行分割，再将分割后的图像转换为三维网格模型19,20,21。这使得临床医生能够以三维形式观察单个器官、骨骼和血管，从而辅助手术规划，或助力癌症与心脏病的诊断22,23。本文将展示这些方法可被改进并应用于显微样本及三维外渗装置。
为此，我们开发了一种创新的共聚焦断层成像技术，通过改进现有的断层成像工具，灵活研究肿瘤细胞跨膜外渗过程。该方法能够全面研究癌细胞与细胞屏障（如内皮细胞层）相互作用时的各种行为表现。癌细胞表现出探索性行为：部分细胞可能侵入并停留在膜附近，而另一些则可迅速穿越屏障。该技术能够在所有维度上提供细胞表型的详细信息24。与更复杂的体内小鼠模型相比，利用该方法研究肿瘤微环境具有成本较低、易于解读和可重复性强的优点。通过调整间质区域，本研究所提出的方法可为多种肿瘤类型及微环境的研究提供坚实基础。
我们介绍并演示了一种三维微流控血脑微环境（µmBBN）平台的使用方法（图1），该平台可长期培养血脑屏障及微环境的关键组分（脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞，培养时间最长可达约9天），并通过共聚焦显微镜进行荧光成像，再利用我们的共聚焦层析技术对图像进行重建（图2）；所有这些步骤均旨在以可重复且定量的方式理解微转移灶的形成过程以及肿瘤微环境的变化。血脑屏障与脑微环境的界面由脑微血管内皮细胞构成，并由基底膜、星形胶质细胞足突和周细胞共同加强其结构25。鉴于星形胶质细胞和内皮细胞在血脑屏障形成与调控中的重要作用，我们重点研究了这两个组分。我们展示了如何利用该平台制备、接种、成像并分析癌细胞及肿瘤微环境中细胞和体液组分。最后，我们展示了如何应用机器学习方法识别能够穿过模拟µmBBN模型的癌细胞所具有的内在表型差异，并为其赋予一个客观的脑转移潜能指数24。该方法生成的数据集可用于回答有关转移机制、治疗策略以及肿瘤微环境在其中所起作用的基础研究和转化医学问题。

<table><tbody><tr><td>含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>带推杆的1.5 mm活检打孔器</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>10倍浓缩MEM培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>150 mm培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的1倍DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>200 μL移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>4英寸硅片</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>48 mm宽包装胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-072-097</td><td></td></tr><tr><td>50 × 75 mm玻璃载片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>A1共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9-20</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂（青霉素/链霉素/两性霉素）</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>美工刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1721575</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>含4.5 g/L葡萄糖的DMEM培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活</td><td>Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Fiji软件</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3细胞系</td><td>EMD Millipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>Anaconda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的生长因子减低型Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231-BR-GFP细胞系</td><td>美国国立卫生研究院Dr. Patricia Steeg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2生长添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>正常人星形胶质细胞（NHA）</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td></td></tr><tr><td>Orange软件</td><td>卢布尔雅那大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>Photosciences Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7-dsRed质粒</td><td>密歇根大学载体核心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EV-GFP质粒</td><td>密歇根大学载体核心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLOX-TERT-iresTK质粒</td><td>Addgene</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G质粒</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜，5 μm孔径</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2质粒</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>PureCol，3 mg/mL</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005</td><td>Ⅰ型牛胶原蛋白</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Solo杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1416545</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2075光刻胶</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8显影液</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184硅胶</td><td>Ellsworth Adhesive Company</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179965-1L</td><td></td></tr><tr><td>三氯全氟辛基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

脑转移是致死性最高的癌症病灶；所有癌症中有10-30%会发生脑转移，中位生存期仅为约5-20个月，具体取决于癌症类型。为了减轻脑转移性肿瘤负担，必须弥补基础与转化研究知识方面的空白。主要挑战包括缺乏可重复的临床前模型及相关工具。将三维脑转移模型与专用分析工具相结合，可获得用于满足这些需求的相关分子和表型数据。此外，与小鼠模型相比，利用器官芯片模型模拟患者肿瘤细胞穿越血脑屏障进入脑微环境的过程，能够更快地获得结果，并且更易于通过定量方法进行解读，因而适用于高通量检测。本文中，我们描述并演示了一种新型三维微流控血脑微环境（µmBBN）平台的使用方法，该平台可长期（数天）培养微环境中的多个组分，通过共聚焦显微镜进行荧光成像，并采用创新的共聚焦层析技术对图像进行重建；所有这些均旨在以可重复且定量的方式理解微转移的发展过程以及肿瘤微环境（TME）的变化。我们展示了如何利用该平台进行癌细胞及TME中细胞和体液组分的制备、接种、成像与分析。此外，我们还展示了如何利用人工智能（AI）识别能够穿过模型µmBBN的癌细胞所具有的内在表型差异，并为其分配一个客观的脑转移潜能指数。该方法生成的数据集可用于回答有关转移机制、治疗策略有效性以及TME在其中作用的基础与转化科学问题。

利用该技术，我们分析了用不同荧光蛋白或染料标记的细胞类型。我们以含有 hCMEC/D3-DsRed 和非荧光星形胶质细胞的 µmBBN 芯片为例，展示该方法的应用。将脑微血管内皮细胞接种于多孔膜（5 µm 聚碳酸酯径迹蚀刻膜）上，并置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中培养34。三天后，通过显微镜确认内皮层达到完全汇合，随后将癌细胞接种至内皮层上方。将两种乳腺癌细胞系——一种具有脑趋向性的克隆 MDA-MB-231-BR-GFP 和亲本细胞 MDA-MB-231-GFP——接种到含有星形胶质细胞脑微环境的 µmBBN 芯片中35,36,37,38,39,40,...

本文介绍了一种制备和培养血脑屏障转移性肿瘤微环境的实验方案，并利用共聚焦成像和人工智能（机器学习）对其状态进行定量分析。

脑转移瘤是最致命的癌症病灶；所有癌症中有10%-30%会发生脑转移，中位生存期仅为约5-20个月，……

共聚焦断层扫描技术的开发旨在全面获取癌细胞在与细胞屏障和微环境相互作用时的各种行为特征。该方法为研究转移过程的发生提供了基础。此方法适用于对活细胞行为进行定量分析。共聚焦断层扫描技术若与机器学习相结合，可广泛应用于多种器官芯片平台。分析原发性或复发性肿瘤以及循环肿瘤细胞，可能成为预测脑转移并区分脑转移性与非脑转移性细胞的重要诊断工具。为组装微流控BBN装置，需将装置从真空干燥器转移至适当表面，使入口朝下，并将整个装置放入等离子体腔室中。将整个装置放入等离子腔室中，先抽真空，然后在80瓦功率下进行30秒的等离子处理。处理结束后，使用导向工具迅速将装置（进样口朝上）放置于实验台上的载玻片表面，使装置的PDMS部分与载玻片之间形成永久性键合。接下来，将200微升移液枪头从尖端截去2毫米后插入所有进样口和出样口，并将装置放入等离子腔室，进行8分钟、200瓦的等离子处理。待设备冷却后，将该设备放入无菌的次级容器中，并在质粒处理后的15分钟内，通过底部腔室的移液枪头向设备中加入120微升胶原星形胶质细胞溶液。使溶液通过毛细作用扩散至对侧移液枪头，并填充设备的下一个通道。当设备的全部四个通道均被填满后，将芯片置于细胞培养孵育箱中孵育一小时。当胶原凝固后，使用适当的完全细胞培养基填充底部室的所有移液管尖端，并在上室中加入2%生长因子减少型Matrigel（用完全内皮细胞培养基稀释）。当两个腔室均完成包被后，将装置放入培养箱中孵育1小时，然后用适当的培养基冲洗上室。交替使用各尖端，每隔15分钟向上室每根尖端加入30微升含一乘以十的六次方个内皮细胞/毫升的适当培养基，每根尖端共加入四份细胞悬液。在接种间隔期间将装置置于培养环境中孵育。当所有内皮细胞接种完成后，用培养基填充所有尖端，并将装置放回细胞培养孵箱中孵育48小时。当内皮层成熟后，更换芯片中的培养基以补充新鲜细胞培养液，并向每个上层腔室通道中接种30 µL含一乘以十的六次方个癌细胞每毫升相应培养基的细胞悬液。每次接种 30 微升细胞悬液后，将装置放回培养箱中孵育 15 分钟，然后用适当的培养基填充所有加样尖端，并将装置放回细胞培养孵箱中继续培养 24 至 48 小时。在装置完成培养并成像后，为测量癌细胞的表型，打开提供的软件并将共聚焦图像读入内存。该软件会将三维共聚焦图像中的每个颜色通道分别保存为独立的 TIFF 文件。选择“更改每个显微镜通道的不透明度值”，并调整图像中各颜色通道的通道 alpha 值，以去除背景，仅保留细胞内的荧光信号。为观察调整效果，选择“查看三维渲染”以确认阈值设置是否正确；若图像显示正常，将不透明度值保存至实验记录电子表格中。随后，使用移动立方体算法（marching cubes）将体图像转换为独立的三维三角网格对象，并以 VTK 数据格式保存。为了拟合内皮屏障的平面，首先需要确定细胞的质心。使用多数据连通性滤波器遍历 VTK 文件中的网格列表，提取不相连的区域。计算每个网格的质心，并将测量结果添加到质心列表中，同时过滤掉过大或过小的网格。为了对内皮细胞的中心点列表进行平面拟合，请使用误差最小化方法，运行“可视化RFP中心点及平面拟合”以生成并绘制拟合平面，并检查平面的拟合情况，必要时手动调整拟合。当平面正确拟合后，将该平面的法向量保存至实验记录文件中。在利用平面表征内皮层后，为测量每个癌细胞的表型，请加载细胞分析功能，并运行“读取实验记录信息并分析现有通道”，以遍历并分析VTK文件中的每个区域。对于每个区域，该函数将裁剪每个细胞，以计算细胞膜下方的网格。为了测量细胞表型，需计算每个癌细胞的形态、体积和位置。然后测量每个被裁剪癌细胞的体积和位置，以计算通过内皮屏障外渗的细胞所占的百分比。在完成多个实验的上述步骤后，将数据导出为单个 xlsx 文件，以便将数据保存在电子表格中。具有融合内皮屏障的微流控 BBN 芯片可用于实验，而内皮覆盖特别差的微流控 BBN 芯片则不可用于实验。在此代表性分析中，靶向脑组织的癌细胞系表现出一个亚群，该亚群可穿过内皮屏障并迁移至微流控 BBN 芯片的脑微环境空间深处。暴露后两天和九天，亲代癌细胞仍有相当比例的细胞停留在屏障上方，远离脑微环境空间；而脑转移性癌细胞群体中，有超过 100% 的细胞发生了跨内皮迁移。对癌细胞形态的定量分析表明，亲代细胞在接种后第一天呈球形的细胞较少，而在与环境相互作用两天和九天后，两种癌细胞系均呈现出球形度下降的趋势。此外，渗入星形胶质细胞微环境的癌细胞亚群相较于仍与血管内皮屏障相互作用但未渗入脑组织的癌细胞体积更小。具有脑趋向性的癌细胞系及患者来源的异种移植模型在微流控BBN芯片中表现出一种表型模式，该模式可被机器学习方法用于区分脑转移性与非脑转移性癌细胞。自我筛选非常重要。高内皮细胞在较低传代次数时表现出不同的屏障特性。此外，癌细胞及其荧光表达可能随时间发生变化。经过该操作后，研究人员可对装置内细胞或其分泌物来源的细胞进行分子谱型分析，以研究转移的分子机制。该技术通过结合人工构建的微环境与随时间变化的生态位组分定量成像，能够探索癌细胞与其微环境之间的复杂相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

使用有机体片 3D 模型、机器学习和共声断层扫描量化脑转移肿瘤微环境

我们开发了三维共培养模型，可用于实时活细胞成像，以观察乳腺肿瘤细胞与其微环境中其他细胞之间的相互作用，这些相互作用影响着向侵袭性表型的进展。这些模型可作为临床前筛选工具，用于靶向筛选影响侵袭性的旁分泌诱导的蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物。...

用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

本视频展示了三维共培养系统的建立过程。将小鼠脑切片置于膜上，接种荧光标记的人脑肿瘤细胞并使其在其上生长。待系统准备就绪后，对其进行染色以进行成像。...

在器官型脑片共培养模型中建立脑肿瘤

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具有类器官脑切片与癌细胞三维球体的共培养系统

关键词：共培养系统，类器官脑切片，癌细胞，三维球体，肿瘤微环境，脑转移，体外模型

采用超声成像引导下将MDA-MB231/Br-GFP细胞经心内注射，建立乳腺癌脑转移小鼠模型。通过高分辨率9.4...

超声成像引导下心内注射建立小鼠乳腺癌脑转移模型及后续纵向磁共振成像

本研究提出了一种先进的方案，通过检测绿色荧光蛋白和生物发光信号，并结合定量分子检测技术，精确评估肿瘤负荷。...

利用原位乳腺癌模型研究三阴性乳腺癌

颅内脑转移瘤建模因缺乏精确且及时监测肿瘤大小及治疗反应的方法而变得复杂。本研究所展示的方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，从而实现精确且一致的注射操作、增强的动物监测以及准确的肿瘤体积测量。...

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在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。...

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我们描述了一种通过尾静脉注射内源性HER2扩增的炎性乳腺癌细胞系建立的乳腺癌脑转移异种移植小鼠模型。...

通过尾静脉注射炎症性乳腺癌细胞建立脑转移模型

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。目前大多数脑转移小鼠模型因伴随全身性转移，干扰了对死亡率和治疗干预效果的分析。本文介绍了一种颈内动脉注射癌细胞的方案，可稳定产生颅内肿瘤，同时全身性肿瘤极少。...

通过颈内动脉注射癌细胞建立脑转移模型

立体定向颅内注射技术可实现将肿瘤细胞精确且局部地植入小鼠大脑皮层，是研究脑转移定植的有力模型。...

建立脑转移模型：通过立体定向皮层内注射对转移性定植及组织学生长模式进行标准化分析

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可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

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利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

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