结合表观遗传修饰和生物力学线索的两步策略，以产生哺乳动物多能细胞
2020年8月29日
我们在这里提出了一种将化学表观遗传擦除与机械检测相关线索相结合的方法，以有效地产生哺乳动物多能细胞，而无需基因转染或逆转录病毒载体。因此，这种策略对转化医学很有希望，并且代表了干细胞类器官技术的显着进步。
本视频中首次展示了该方案，将化学表观遗传擦除与生物力学线索相结合，以诱导和维持成人终末分化细胞的多能性。该方案的主要优点是它不需要转基因或病毒载体。此外，它稳健、高度可重现且灵活。
该技术不需要使用基因转染，因此代表了转化医学和细胞治疗的显着技术进步，同时支持高可塑性细胞的长期培养。演示该程序的是助理教授 Georgia Pennarossa 和我实验室的博士生 Teresina De Iorio。首先制备新鲜的 1 毫摩尔 5-氮杂-CR 储备液。
称取 2.44 毫克 5-氮杂-CR 并将其溶解在 10 毫升高葡萄糖的 DMEM 中。通过涡旋重新悬浮粉末，并用 0.22 微米过滤器对溶液进行消毒。通过在 1 毫升成纤维细胞培养基中稀释 1 微升储备溶液来制备 5-aza-CR 工作溶液。
按照文本手稿中的描述对细胞进行胰蛋白酶消化，然后用轻轻的移液将它们移出。然后收集细胞悬液并将其转移到锥形管中。在光学显微镜下使用计数室对细胞进行计数。
将细胞悬液以 150 倍 G 离心 5 分钟。然后，去除上清液并重悬沉淀，在 30 微升补充有 1 微摩尔 5-氮杂-CR 的成纤维细胞培养基中获得 40， 000 个细胞。用 PTFE 粉末填充 35 毫米培养皿以制备床，然后将 30 μL 细胞分配到粉末床上。
以圆周运动轻轻旋转培养皿，确保 PTFE 粉末完全覆盖液滴表面，形成液态大理石微生物反应器。使用 1000 微升移液器吸头吸取液态大理石微生物反应器，该吸头已被切割以适应弹珠的直径。将微生物反应器接种到干净的细菌培养皿上以使其稳定。
然后，将微量生物反应器从培养皿转移到 96 孔板中。从孔边缘缓慢加入 100 μL 培养基。微型生物反应器应漂浮在培养基的顶部。
将液态大理石微型生物反应器在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育 18 小时。孵育后，使用 1000 微升移液器吸头收集液体大理石微生物反应器，并将其放入新的 35 毫米细菌培养皿中。用针刺穿液体弹珠并将其折断。
用在立体显微镜下在边缘切割的 200 微升移液器吸头恢复形成的球体。为了洗去 5-aza-CR 残留物，将类器官转移到含有 ESC 培养基的培养皿中。准备一个含有 PTFE 粉末床的新 35 毫米培养皿，并使用 200 微升切割移液器吸头将 30 微升 ESC 培养基液滴中的单个类器官分配到粉末上。
以圆周运动轻轻旋转培养皿，形成新的液体大理石微型生物反应器，并将其转移到 96 孔板的孔中。从孔边缘加入 100 微升培养基，慢慢沐浴大理石。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养液态大理石微生物反应器。
形态学分析表明，与去甲基化剂 5-aza-CR 孵育 18 小时后，封装在 PTFE 微生物反应器中的三种哺乳动物物种的成纤维细胞聚集并形成具有均匀尺寸几何形状的 3D 球形结构。在 3D 条件下，86.31% 的包膜细胞显著改变了其表型。相比之下，在 2D 标准条件下培养的 5-aza-CR 后细胞的尺寸要小得多，细胞核呈颗粒状，并保留了单层分布。
形态学变化伴随着多能性相关基因表达的开始，在 3D 和 2D 后 5-aza-CR 细胞中。观察到 POU 5 类同源框 1 、 NANOG 同源框 、 ZFP42 锌指蛋白和性别决定区 Ybox2 的转录，这些在未经处理的成纤维细胞中不存在。与在 2D 标准塑料培养皿中培养的细胞相比，在 3D 后 5-aza-CR 细胞中也观察到 10-11 易位 2 上皮细胞粘附分子和钙粘蛋白 1 基因的显着上调。
同时，在 3D 和 2D 后 5-aza-CR 细胞中检测到成纤维细胞特异性标志物 Thy1 细胞表面抗原的下调。ELISA 证实 5-aza-CR 后 3D 和 2D 细胞甲基化水平显着降低。与在 2D 条件下培养的细胞相比，3D 后 5-aza-CR 细胞中的 DNA 甲基化水平显著降低。
此外，3D 后 5-aza-CR 细胞保留了获得性的 3D 球形结构、多能性相关基因的高表达水平和低 DNA 甲基化水平 28 天，此时培养被停滞。微生物反应器还可用于维持祖细胞培养的最佳条件，以及提高终末分化效率。
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概述
本研究介绍了一种新颖的方法，该方法结合化学表观遗传擦除和生物力学信号来在成年终末分化细胞中诱导多能性。该方法消除了基因转染或病毒载体的需求，使其成为转化医学和干细胞治疗的重大进展。
关键研究组成部分
研究领域
- 干细胞生物学
- 多能性诱导
- 转化医学
背景
- 当前诱导多能性的方法通常依赖于病毒载体，这可能会有局限性。
- 能够在不进行基因修饰的情况下生成多能细胞是一个突破。
- 理解细胞重编程对于再生医学的进步至关重要。
使用的方法
- 化学表观遗传擦除和生物力学刺激的结合
- 使用成纤维细胞作为起始生物系统
- 开发液态大理石微型生物反应器用于细胞培养
主要结果
- 在三维条件下，从分化的成纤维细胞中成功生成了多能细胞。
- 观察到显著的形态变化和多能性相关基因的表达。
- 该方法在时间上显示出稳健和可重复的结果，在超过28天的时间内保持了细胞特性。
结论
- 这项工作展示了一种有效的、无病毒的多能细胞生成方法。
- 研究结果增强了对干细胞技术及其在细胞治疗中的潜在应用的认识。
常见问题
Executive Industry Relevance
This two-step strategy integrates chemical epigenetic erasing with biomechanical cues to induce and maintain pluripotency in adult mammalian cells, eliminating the need for gene transfection or viral vectors. The approach enhances predictive confidence in cell reprogramming and supports robust, reproducible generation of high-plasticity cells for early discovery and translational research. Its flexibility and reproducibility position it as a reusable capability for stem cell and organoid technology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell fate mechanisms through controlled epigenetic modification.
- Supports functional validation of pluripotency induction without genetic manipulation.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating chemical and biomechanical contributions to cell plasticity.
- Improves predictive confidence in reprogramming outcomes across mammalian species.
Screening & Assay Development
- Prepares validated high-plasticity cell systems for downstream screening workflows.
- Standardizes 3D culture conditions using PTFE micro-bioreactors for reproducible outputs.
- Enables quantitative assessment of pluripotency markers and DNA methylation status.
- Supports scalable and robust assay development for compound evaluation in reprogrammed cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by maintaining pluripotency-related gene expression over extended culture periods.
- Provides continuity from discovery-stage reprogramming to preclinical validation of cell therapies.
- Reduces biological risk by avoiding viral vectors and gene transfection in cell manufacturing.
- Enables long-term maintenance and differentiation studies in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery to preclinical continuum, supporting both hypothesis-driven reprogramming and scalable cell system preparation for advanced research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on epigenetic and biomechanical determinants of cell fate.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for pluripotency and methylation status.
- Analytics: Enables comparative analysis of gene expression and morphological changes across conditions.
- Translational Research: Maintains high-plasticity cells for extended periods, supporting preclinical modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, non-genetic platform adaptable to multiple mammalian systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell reprogramming.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for pluripotent cell generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in cell therapy pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of reprogramming strategies and cell-based models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetic modulation and 3D cell culture techniques.
- Needs access to PTFE micro-bioreactor materials and quantitative gene expression analysis tools.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in pluripotency assessment.
- Adaptable across mammalian species but may require optimization for specific cell types.
- Limitations include the need for careful handling of micro-bioreactors and monitoring of long-term culture stability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Fibroblast Exposure to 5-aza-CR
2:28
Fibroblast Encapsulation in PTFE Micro-Bioreactors
4:05
Culture in PTFE Micro-Bioreactors of Epigenetically Erased Cells
5:00
Results: Epigenetically Erased Cells Encapsulated in PTFE Micro-Bioreactors Show High Level and Long-term Maintenance of Pluripotency-Related Gene Expression
7:33
Conclusion
