一种结合表观遗传修饰与生物力学信号的两步法策略以生成哺乳动物多能细胞

本视频展示的方案首次将化学表观遗传擦除与生物力学信号相结合，用于诱导并维持成年终末分化细胞的多能性。该方案的主要优势在于无需使用转基因或病毒载体。此外，该方法具有稳健性强、高度可重复且灵活的特点。

该技术无需使用基因转染，因此在转化医学和细胞治疗领域代表了一项显著的技术进步，同时支持高可塑性细胞的长期培养。本实验操作将由本实验室的助理教授 Georgia Pennarossa 和博士生 Teresina De Iorio 演示。首先，配制新鲜的 1 毫摩尔 5-aza-CR 储存液。

称取2.44毫克5-aza-CR，溶于10毫升高糖DMEM中。通过涡旋振荡重新悬浮粉末，并使用0.22微米滤器对溶液进行除菌。取1微升储备液加入1毫升成纤维细胞培养基中稀释，制备5-aza-CR工作液。

按照文稿中的描述用胰蛋白酶处理细胞，并通过轻柔吹打使细胞脱落。随后收集细胞悬液并转移至锥形管中。使用计数板在光学显微镜下对细胞进行计数。

将细胞悬液在150 × g条件下离心5分钟。随后，弃去上清液，并将沉淀重悬，以获得含有40,000个细胞的30 µL成纤维细胞培养基，该培养基中添加有1 µM的5-aza-CR。用聚四氟乙烯（PTFE）粉末填充一个35 mm的培养皿以形成粉末床，然后将30 µL细胞悬液滴加到粉末床上。

轻轻旋转培养皿，使其呈圆周运动，确保聚四氟乙烯（PTFE）粉末完全覆盖液滴表面，形成液态弹珠微反应器。使用已剪裁至适合液态弹珠直径的1000微升移液枪头，拾取该液态弹珠微反应器。将其接种至洁净的细菌学培养皿中，以保持稳定。

然后，将微型生物反应器从培养皿转移至96孔板中。从孔的边缘缓慢加入100 µL培养基。微型生物反应器应漂浮在培养基表面。

将液体弹珠微反应器置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育18小时。孵育结束后，使用1000微升移液器吸头收集液体弹珠微反应器，并将其转移至新的35毫米细菌培养皿中。用针头刺破液体弹珠并使其破裂。

在体视显微镜下，使用剪去尖端的200微升移液枪头回收形成的类球体。为洗去5-aza-CR残留物，将类器官转移至含有ESC培养基的培养皿中。准备一个新的含有聚四氟乙烯（PTFE）粉末床的35毫米培养皿，用剪去尖端的200微升移液枪头将单个类器官以30微升ESC培养基液滴的形式 dispense 到粉末上。

轻轻旋转培养皿，使其呈圆形运动，形成新的液态弹珠微反应器，并将其转移至96孔板的孔中。从孔的边缘加入100 µL培养基，缓慢浸润液态弹珠。将液态弹珠微反应器置于37 °C、5% CO₂条件下培养。

形态学分析显示，在与去甲基化试剂5-aza-CR共孵育18小时后，三种哺乳动物物种的成纤维细胞在PTFE微型生物反应器中聚集并形成了具有均匀尺寸几何形状的三维球形结构。在三维条件下，86.31%的包封细胞显著改变了其表型。相比之下，在二维标准条件下培养的经5-aza-CR处理后的细胞体积明显更小，细胞核呈颗粒状，并保持单层分布。

形态学变化伴随着多能性相关基因表达的启动，这在3D和2D条件下经5-aza-CR处理后的细胞中均有观察到。在未经处理的成纤维细胞中不存在的POU家族五类同源框基因1（POU class five homeobox one）、NANOG同源框基因（NANOG homeobox）、ZFP42锌指蛋白（ZFP42 zinc finger protein）以及性别决定区Y框蛋白2（sex-determining region Y box 2）均出现了转录活性。与培养在2D标准塑料培养皿中的细胞相比，3D条件下经5-aza-CR处理的细胞中还观察到10-11易位2（10-11 translocation 2）、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule）以及钙黏蛋白1（cadherin 1）基因的显著上调。

同时，在三维（3D）和二维（2D）条件下经5-aza-CR处理后的细胞中均检测到成纤维细胞特异性标志物Thy1细胞表面抗原的表达下调。ELISA检测证实，三维和二维条件下经5-aza-CR处理的细胞中甲基化水平均显著降低。与二维培养的细胞相比，三维培养的5-aza-CR处理细胞中DNA甲基化水平显著更低。

此外，经5-aza-CR处理后的三维培养细胞在28天内保持了获得的三维球形结构、多能性相关基因的高表达水平以及低DNA甲基化水平，此后培养终止。微型生物反应器还可用于维持前体细胞培养的最佳条件，并提高终末分化效率。