Name: 结合表观遗传修饰和生物力学线索的两步策略，以产生哺乳动物多能细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解如何通过化学表观遗传擦除与生物力学线索相结合的两步策略，在液体大理石微生物反应器中从成纤维细胞诱导哺乳动物多能性。该方法无需病毒载体，可稳定维持细胞特性超过28天。

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本工作由Carraresi基金会和MiND FoodS枢纽（ID：1176436）资助。所有作者均为COST行动CA16119体外三维全细胞引导与功能（CellFit）的成员&#160;。

所有研究均经米兰大学伦理委员会审查并批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》进行。健康成年个体人源细胞的分离经米兰马焦雷综合医院伦理委员会批准。本研究中的所有方法均按照批准的指南实施。
1. 皮肤成纤维细胞的分离
注意：以下所述所有步骤均可应用于从小鼠、猪和人类等不同哺乳动物物种分离的成纤维细胞。小鼠细胞取自7周龄雄性小鼠，猪皮肤组织取自当地屠宰场。人源细胞取自成年患者，采集前已获得书面知情同意。
<ol>
	<li>配制 0.1% 猪源明胶溶液。
	<ol>
		<li>称取 0.1 g 猪源明胶，溶于 100 mL 水中。使用前通过高压灭菌对明胶溶液进行灭菌处理。</li>
		<li>向 35 mm 培养皿中加入 1.5 mL 上述配制的溶液，以 0.1% 猪源明胶包被。室温孵育 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取哺乳动物（小鼠、猪和人）皮肤活检组织，长度约为 2–5 cm，并将其置于含 2% 抗生素-抗真菌溶液的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）中。于 +4 °C 保存至使用。
	 
	注意：活检组织的采集必须在获得伦理委员会批准并符合既定指南的前提下进行。</li>
	<li>用新鲜无菌 PBS（含 2% 抗生素-抗真菌溶液）对采集的活检组织进行充分清洗，共清洗三次。</li>
	<li>收集最后一次清洗后的活检组织，放入无菌 100 mm 培养皿中。使用无菌手术刀片将其切成约 2 mm3 大小的组织块。</li>
	<li>在 2 小时孵育结束后，移除 35 mm 培养皿（见步骤 1.1.2）中多余的明胶溶液，并使用无菌手术镊子立即将 5–6 块皮肤组织碎片转移至每个预先包被的培养皿中。</li>
	<li>在每块组织碎片上滴加 100 µL 成纤维细胞分离培养基（表 1），以润湿组织碎片。于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。
	 
	注意：为防止培养基蒸发，将 35 mm 培养皿置于含有无菌水的 100 mm 或更大的培养皿中。确保两个培养皿均加盖密封。</li>
	<li>培养 24 小时后，检查 35 mm 培养皿中的培养基量。如需要，可添加 500 µL 成纤维细胞分离培养基，以保持组织碎片湿润。</li>
	<li>使用移液器小心吸除旧培养基，并至少每隔 2 天更换一次新鲜培养基。</li>
	<li>当置于 35 mm 培养皿中的皮肤组织碎片（见步骤 1.5）开始有成纤维细胞迁出并逐渐形成单层细胞（通常约 6 天）时，使用无菌手术镊子移除皮肤组织块，并继续在 2 mL 成纤维细胞分离培养基中培养。</li>
	<li>继续在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养单层细胞，直至细胞融合度达到 80%，并每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 成纤维细胞原代细胞系培养
<ol>
	<li>当成纤维细胞达到80%融合度时，小心移除成纤维细胞分离培养基，并用含有1%抗生素-抗真菌溶液的3 mL PBS洗涤细胞三次。</li>
	<li>为使细胞脱离，向培养皿中加入600 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育3-5分钟。</li>
	<li>当细胞开始从培养皿脱离时，加入5.4 mL成纤维细胞培养基以中和胰蛋白酶（表1）。</li>
	<li>通过反复轻柔吹打使细胞脱落。将细胞接种至新的培养皿（无需明胶包被），传代比例保持在1:2至1:4之间（根据生长速率而定）。 
	注意：无需离心。</li>
	<li>在培养过程中每2天更换一次培养基，直至细胞达到80%融合度后进行传代。 
	注意：为维持成纤维细胞旺盛生长，建议每周传代两次。</li>
</ol>
3. 成纤维细胞暴露于5-aza-CR
<ol>
	<li>配制新鲜的 1 mM 5-aza-CR 储存液。
	<ol>
		<li>称取 2.44 mg 的 5-aza-CR，溶于 10 mL 高糖 DMEM 培养基中。通过涡旋振荡使粉末充分重悬。使用 0.22 µm 滤器对溶液进行除菌处理。 
		注意：5-aza-CR 储存液必须在使用前立即配制。</li>
		<li>将 1 µL 的 5-aza-CR 储存液（步骤 3.1.1）稀释至 1 mL 成纤维细胞培养基中，制备 5-aza-CR 工作液。 
		注意：5-aza-CR 工作液的终浓度为 1 μM1,2,3,8,9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前描述的方法进行胰酶消化细胞（步骤 2.1–2.3），并通过反复轻柔吹打使细胞脱落。</li>
	<li>收集细胞悬液，并转移至锥形离心管中。</li>
	<li>在室温下，使用血细胞计数板在光学显微镜下对细胞进行计数。根据计数结果计算所需培养基体积，以将细胞重悬于含 1 μM 5-aza-CR 的成纤维细胞培养基中，使每 30 μL 悬液含有 4 × 104 个细胞（参见步骤 3.1.2）。 
	注意：所用计算公式取决于具体的计数板类型。 
	<img alt="细胞计数公式：每微升细胞数 = 平均每格细胞数 × 计数板系数 × 稀释倍数；计算方法。" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>将细胞悬液在室温下以 150 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，并用含 1 μM 5-aza-CR 的成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀（参见步骤 3.1.2）。成纤维细胞培养基的具体使用体积请参见步骤 3.4。 
	注意：作为阴性对照，将细胞以相同浓度重悬于不含 5-aza-CR 的成纤维细胞培养基中，并继续进行细胞在 PTFE 粉末中的包埋操作（步骤 4.1–4.13）。</li>
</ol>
4. 成纤维细胞在聚四氟乙烯微型生物反应器中的包封
<ol>
	<li>用聚四氟乙烯（PTFE）粉末填充一个35 mm的培养皿以形成床层（图1A). 
	注意：使用35 mm细菌学培养皿以避免液滴滚动粘附。为获得薄而疏水且多孔的壳层，应使用平均粒径为的聚四氟乙烯（PTFE）粉末 1 μm 最大研磨度为2.0 NPIRI，从而可制备出具有透气性的液体弹珠。此外，半透明涂层有利于实时观察细胞聚集过程。较大的颗粒尺寸会导致较高的多分散性，进而引起蒸发加剧、形变、球形结构丧失以及微型生物反应器的过早溶解。</li>
	<li>分配 30 μL 单个液滴含有 4 x 104 细胞（见步骤 3.4.– 3.5.）至粉末床（图1B).</li>
	<li>轻轻旋转35 mm培养皿，使其做圆周运动，确保聚四氟乙烯（PTFE）粉末完全覆盖液滴表面，形成液态弹珠微型生物反应器（liquid marble micro-bioreactor）图1C).</li>
	<li>使用镊子夹取液态弹珠微型生物反应器 1,000 μL 移液器吸头，边缘剪开，以适配弹珠的直径（图1D，E）。将液体弹珠微型生物反应器接种于洁净的细菌培养用培养皿中以稳定之（图1F). 
	注意：为产生夹持液态弹珠所需的摩擦力，应使用剪刀将移液器吸头剪裁至其直径略小于液态弹珠直径。</li>
	<li>将液滴弹珠微型生物反应器从培养皿转移至96孔板中（每孔一个弹珠）图1G).</li>
	<li>缓慢加入 100 μL 从孔边缘移除培养基。微型生物反应器开始漂浮在培养基表面。图1H). 
	注意：由于聚四氟乙烯（PTFE）疏水性被破坏，微型生物反应器在直接液体接触情况下会发生破裂。作为替代方案，可将液滴弹珠型微型生物反应器单独置于35 mm细菌培养皿中。在此情况下，为防止液滴弹珠蒸发，必须将含有微型生物反应器的35 mm培养皿放入已预先加入无菌水的100 mm培养皿中。</li>
	<li>将液滴弹珠微型生物反应器在37 °C下孵育18 h 37 °C 在5% CO₂中2 培养箱1,2,3,8,9. 
	注意：PTFE 的粒径 1 μm 可确保内部液体与周围环境之间实现最佳气体交换。</li>
	<li>在5-aza-CR孵育18小时后，使用 1,000 μL 移液器吸头在边缘处剪开（见步骤 4.5）。</li>
	<li>将微型生物反应器置于新的35 mm细菌培养皿中（图1D-F).</li>
	<li>使用针头刺破液态弹珠并使其破裂。</li>
	<li>回收已形成的球状体 200 μL 移液器吸头，在体视显微镜下于边缘处剪断图1I, J). 
	注意：表观遗传重编程的细胞被封装在聚四氟乙烯中，形成三维球形结构（每个液滴弹珠中包含一个细胞聚集体）。</li>
	<li>为评估细胞对5-aza-CR处理后多能状态的获得情况，通过定性PCR检测多能性相关基因OCT4、NANOG、REX1和SOX2的表达启动情况表 2).</li>
	<li>按照下述说明进行方案的第二步操作。</li>
</ol>
5. 表观遗传重编程细胞在聚四氟乙烯微型生物反应器中的培养
<ol>
	<li>配制新鲜的 ESC 培养基（表 1）。</li>
	<li>将类器官转移至含有 ESC 培养基的培养皿中，以洗涤残留的 5-aza-CR（参见步骤 5.1.–5.2.）。</li>
	<li>准备一个新的含有聚四氟乙烯（PTFE）粉末床的 35 mm 细菌培养皿（另见步骤 4.1.）。</li>
	<li>使用经边缘切割的 200 μL 移液枪头，将单个类器官以 30 μL ESC 培养基液滴的形式 dispense 到粉末床上（参见步骤 4.9.；5.3.）。</li>
	<li>轻轻以圆周运动旋转 35 mm 培养皿，形成新的液态弹珠微型生物反应器，然后使用经边缘切割的 1,000 μL 移液枪头将其拾取，并放入 96 孔板的一个孔中（每孔一个弹珠）（参见步骤 4.3.–4.6.）。</li>
	<li>为使微型生物反应器漂浮，从孔的边缘缓慢加入 100 μL 培养基，使液态弹珠逐渐被浸润（参见注释 4.7.）。</li>
	<li>将液态弹珠微型生物反应器置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养至所需时间。每隔一天更换一次培养基，操作步骤见 5.3.–5.7。 
	注：本研究中提供的结果基于类器官培养 28 天的数据。但如有需要，可进行更长时间的培养。</li>
</ol>

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<li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+signaling-directed+YAP%2FTAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在过去的几十年中，多项研究致力于开发策略，将终末分化的细胞逆转至更低分化程度且更具可塑性的状态。本文所述方案能够从成体成熟的终末分化细胞出发，生成并长期维持多能性细胞。该方法结合了两个独立步骤：首先通过化学表观遗传重置诱导出高度可塑的状态，随后利用三维培养系统维持该状态。
在聚四氟乙烯（PTFE）封装的细胞中观察到的三维球状结构形成（图2）与其他研究结果一致，这些研究证明了PTFE能够有效促进细胞聚集，从而有助于嗅鞘细胞（OEC）球状结构的建立25或三维环状聚集体的形成26。这些形态学变化伴随着多能性相关基因表达的启动（图3、图4、图5），在3D Post 5-aza-CR细胞中，其表达水平显著高于2D Post 5-aza-CR细胞（<strong ...

在过去的几十年中，关于细胞命运单向走向承诺和分化的广泛接受概念已被彻底修正。已有研究表明，细胞特化过程可以被逆转，通过不同方法可将终末分化的细胞重新诱导至更低分化程度且更具可塑性的状态。
在已提出的多种方法中，最有前景的方法之一是利用化学化合物诱导细胞进入所谓的化学诱导多能性状态。该方法所用的小分子能够相互作用并修饰成体成熟细胞的表观遗传特征，从而避免了使用任何转基因和/或病毒载体的需要1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。最近的大量研究表明，通过提供特定的生化和生物学刺激，可诱导超甲基化基因的再激活，从而实现细胞从一种表型向另一种表型的转换11,12,13,14,15。这些去甲基化事件使得终末分化的细胞能够转化为原始祖细胞、多能细胞或具有高可塑性/多能性的细胞1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
与此同时，许多研究近期聚焦于机械感应相关信号的理解，更具体地说，是利用机械力直接调控细胞可塑性和/或分化的能力16,17,18,19。事实上，已有明确证据表明，细胞外基质（ECM）在调控细胞命运中发挥着关键作用。特别是，ECM产生的生物力学和生物物理信号可直接调控分子机制和信号通路，从而影响细胞的行为与功能20,21。这些最新研究结果为开发新型三维培养系统奠定了基础，这类系统能更真实地模拟体内细胞微环境，重现驱动细胞行为的机械和物理刺激。
本文介绍一种两步法方案，结合化学表观遗传擦除与力学感应相关信号，以生成哺乳动物多能性细胞。第一步中，细胞与去甲基化分子5-氮杂胞苷（5-aza-CR）共同孵育。该试剂可通过直接的TET2（ten-eleven translocation 2）介导作用8,10 和间接抑制DNA甲基转移酶（DNMT）22,23 的协同效应，诱导显著的全基因组DNA去甲基化。此步骤可去除表观遗传阻断，继而重新激活与多能性相关的基因表达，从而产生高可塑性细胞1,2,3,8,10，下文将此类细胞称为“表观遗传擦除细胞”。第二步中，细胞被封装于三维培养系统中。为此，采用非反应性疏水性合成化合物聚四氟乙烯（PTFE；粒径为1 μm）作为微型生物反应器，可构建传统二维培养系统无法实现的细胞微环境10。PTFE粉末颗粒附着于悬浮细胞的液滴表面，将液滴核心与支撑表面隔离，同时允许液滴内部与周围环境之间的气体交换24。由此获得的“PTFE微型生物反应器”，亦称为“液态弹珠”（Liquid Marble），可促进细胞间的自由相互作用，推动细胞三维重排25,26,27，并通过生物力学感应相关信号，延长并稳定维持细胞获得的高可塑性状态10。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>5-氮杂胞苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR，用于成纤维细胞表观遗传重置</td></tr><tr><td>腺苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>ESC 培养基核苷混合物组分</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100&amp;times;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>成纤维细胞和 ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>CFX96 实时 PCR 仪</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>NA</td><td>用于定量 PCR 的热循环仪</td></tr><tr><td>胞苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4654</td><td>ESC 培养基核苷混合物组分</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966052</td><td>用于成纤维细胞分离和培养</td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31885023</td><td>用于 ESC 培养基</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>PBS；用于活检、细胞洗涤及溶液配制</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT 微量纯化试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61021</td><td>mRNA 提取</td></tr><tr><td>ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ESG1106</td><td>ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>成纤维细胞和 ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>FGF-Basic（AA10-155）重组人蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>用于培养皿包被</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td>NA</td><td>用于定性 PCR 的热循环仪</td></tr><tr><td>Global DNA 甲基化 ELISA 试剂盒</td><td>CELL BIOLABS</td><td>STA-380</td><td>甲基化研究</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M7801</td><td>定性 PCR</td></tr><tr><td>鸟苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6264</td><td>ESC 培养基核苷混合物组分</td></tr><tr><td>Ham's F-10 营养混合物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td>用于 ESC 培养基</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>KOVA glasstic 计数板（带网格，10 孔）</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>Leica MZ APO 体视显微镜</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>用于类器官观察</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>成纤维细胞和 ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>ESC 培养基组分</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &amp;micro;m 孔径滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>用于溶液灭菌</td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶，RNase H 缺陷型，定点突变体</td><td>Promega</td><td>M3681</td><td>mRNA 逆转录</td></tr><tr><td>Multiskan FC 微孔板光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51119000</td><td>用于 ELISA 板读数</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 倒置相差显微镜</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>用于细胞观察</td></tr><tr><td>Perkin Elmer Thermal Cycler 480</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>用于逆转录的热循环仪</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯微粒，粒径 1 &amp;mu;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>430935</td><td>用于构建微型生物反应器</td></tr><tr><td>PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K182001</td><td>基因组 DNA 提取</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1728</td><td>定量 PCR</td></tr><tr><td>胸苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>ESC 培养基核苷混合物组分</td></tr><tr><td>组织培养皿，100×20 mm，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>833902</td><td>用于成纤维细胞分离</td></tr><tr><td>组织培养皿，35×10 mm，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>833900</td><td>用于成纤维细胞分离</td></tr><tr><td>组织培养皿，35×10 mm，悬浮型</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td>细菌培养用培养皿，用于液态弹珠培养</td></tr><tr><td>组织培养板，96 孔，标准型，F</td><td>Sarstedt</td><td>833924005</td><td>用于液态弹珠培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>用于成纤维细胞解离</td></tr><tr><td>离心管，15 ml，120×17 mm，聚苯乙烯材质</td><td>Sarstedt</td><td>62553041</td><td>用于细胞悬液离心</td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td>ESC 培养基核苷混合物组分</td></tr></tbody></table>

一种结合表观遗传修饰与生物力学信号的两步法策略以生成哺乳动物多能细胞

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

细胞表型可通过不同方法实现逆转或修饰，每种技术均有其特定的优势与局限性。本文介绍一种新策略，该策略结合化学表观遗传擦除与机械感应相关信号，以生成哺乳动物多能性细胞。该方法需经过两个主要步骤。第一步，将成年成熟（终末分化）细胞暴露于表观遗传擦除剂5-aza-胞苷中，以诱导其进入多能性状态。该部分方案的建立基于对调控细胞命运与分化的表观遗传机制的深入理解，涉及使用表观遗传修饰剂消除细胞的分化状态，进而诱导其进入一个短暂的高可塑性窗口期。
在第二步中，将已重编程的细胞封装在聚四氟乙烯（PTFE）微型生物反应器（也称为液态弹珠）中，以促进细胞三维重排，从而延伸并稳定维持所获得的高可塑性。PTFE是一种惰性的疏水性合成化合物，其应用可构建出传统二维培养系统无法实现的细胞微环境。该系统通过与生物机械感应相关的信号通路，促进并增强多能性的维持。
本文所述的技术流程是诱导并维持成年体细胞处于高可塑性状态的简单策略。该方案已在所有经过测试的哺乳动物物种中成功获得高可塑性细胞。由于该方法不涉及基因转染，且无需使用病毒载体，因此可能代表了转化医学应用中的一项重要技术进步。此外，微型生物反应器系统通过在体外重建特定的微环境，实现了干细胞类器官技术的显著进步，从而支持高可塑性细胞（如ESC、iPSC、表观遗传重编程细胞和MSC）的长期培养。

本方案描述了从成体体细胞生成并稳定维持哺乳动物多能性细胞所需执行的全部步骤。该方法已成功应用于分离自不同哺乳动物物种（即小鼠、猪和人）的成纤维细胞。此处报告的代表性结果来自所有细胞系，而不论其物种来源。
形态学分析显示，在与去甲基化试剂5-aza-CR共孵育18小时后，封装于PTFE微型生物反应器中的成纤维细胞（3D Post 5-aza-CR）发生聚集，并在所研究的三个物种中均形成了尺寸均一的三维球状结构。（图2A-C，3D Post 5-aza-CR）。高达86.31 ± 4.13%的封装细胞显著改变了其表型，表现出通常与高可塑性表型相关的特征8。相比之下，在二维标准条件下培养的5-aza-CR处理后细胞，尽管其典型的成纤维细胞细长形态被圆形或椭圆形所取代，但细胞体积明显更小，细胞核更大且呈颗粒状，并保持单层分布状态（图2）。这些形态学变化伴随着多能性相关基因在3D和2D Pos...

本文介绍一种结合化学表观遗传擦除与力学感应相关信号的方法，可高效生成哺乳动物多能细胞，且无需基因转染或逆转录病毒载体。因此，该策略在转化医学领域具有广阔前景，并代表了干细胞类器官技术的重要进展。

细胞表型可通过不同方法进行逆转或修饰，每种技术均有其特定的优势与局限性。本文描述了……

本视频展示的方案首次将化学表观遗传擦除与生物力学信号相结合，用于诱导并维持成年终末分化细胞的多能性。该方案的主要优势在于无需使用转基因或病毒载体。此外，该方法具有稳健性强、高度可重复且灵活的特点。该技术无需使用基因转染，因此在转化医学和细胞治疗领域代表了一项显著的技术进步，同时支持高可塑性细胞的长期培养。本实验操作将由本实验室的助理教授 Georgia Pennarossa 和博士生 Teresina De Iorio 演示。首先，配制新鲜的 1 毫摩尔 5-aza-CR 储存液。称取2.44毫克5-aza-CR，溶于10毫升高糖DMEM中。通过涡旋振荡重新悬浮粉末，并使用0.22微米滤器对溶液进行除菌。取1微升储备液加入1毫升成纤维细胞培养基中稀释，制备5-aza-CR工作液。按照文稿中的描述用胰蛋白酶处理细胞，并通过轻柔吹打使细胞脱落。随后收集细胞悬液并转移至锥形管中。使用计数板在光学显微镜下对细胞进行计数。将细胞悬液在150 × g条件下离心5分钟。随后，弃去上清液，并将沉淀重悬，以获得含有40,000个细胞的30 µL成纤维细胞培养基，该培养基中添加有1 µM的5-aza-CR。用聚四氟乙烯（PTFE）粉末填充一个35 mm的培养皿以形成粉末床，然后将30 µL细胞悬液滴加到粉末床上。轻轻旋转培养皿，使其呈圆周运动，确保聚四氟乙烯（PTFE）粉末完全覆盖液滴表面，形成液态弹珠微反应器。使用已剪裁至适合液态弹珠直径的1000微升移液枪头，拾取该液态弹珠微反应器。将其接种至洁净的细菌学培养皿中，以保持稳定。然后，将微型生物反应器从培养皿转移至96孔板中。从孔的边缘缓慢加入100 µL培养基。微型生物反应器应漂浮在培养基表面。将液体弹珠微反应器置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育18小时。孵育结束后，使用1000微升移液器吸头收集液体弹珠微反应器，并将其转移至新的35毫米细菌培养皿中。用针头刺破液体弹珠并使其破裂。在体视显微镜下，使用剪去尖端的200微升移液枪头回收形成的类球体。为洗去5-aza-CR残留物，将类器官转移至含有ESC培养基的培养皿中。准备一个新的含有聚四氟乙烯（PTFE）粉末床的35毫米培养皿，用剪去尖端的200微升移液枪头将单个类器官以30微升ESC培养基液滴的形式 dispense 到粉末上。轻轻旋转培养皿，使其呈圆形运动，形成新的液态弹珠微反应器，并将其转移至96孔板的孔中。从孔的边缘加入100 µL培养基，缓慢浸润液态弹珠。将液态弹珠微反应器置于37 °C、5% CO₂条件下培养。形态学分析显示，在与去甲基化试剂5-aza-CR共孵育18小时后，三种哺乳动物物种的成纤维细胞在PTFE微型生物反应器中聚集并形成了具有均匀尺寸几何形状的三维球形结构。在三维条件下，86.31%的包封细胞显著改变了其表型。相比之下，在二维标准条件下培养的经5-aza-CR处理后的细胞体积明显更小，细胞核呈颗粒状，并保持单层分布。形态学变化伴随着多能性相关基因表达的启动，这在3D和2D条件下经5-aza-CR处理后的细胞中均有观察到。在未经处理的成纤维细胞中不存在的POU家族五类同源框基因1（POU class five homeobox one）、NANOG同源框基因（NANOG homeobox）、ZFP42锌指蛋白（ZFP42 zinc finger protein）以及性别决定区Y框蛋白2（sex-determining region Y box 2）均出现了转录活性。与培养在2D标准塑料培养皿中的细胞相比，3D条件下经5-aza-CR处理的细胞中还观察到10-11易位2（10-11 translocation 2）、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule）以及钙黏蛋白1（cadherin 1）基因的显著上调。同时，在三维（3D）和二维（2D）条件下经5-aza-CR处理后的细胞中均检测到成纤维细胞特异性标志物Thy1细胞表面抗原的表达下调。ELISA检测证实，三维和二维条件下经5-aza-CR处理的细胞中甲基化水平均显著降低。与二维培养的细胞相比，三维培养的5-aza-CR处理细胞中DNA甲基化水平显著更低。此外，经5-aza-CR处理后的三维培养细胞在28天内保持了获得的三维球形结构、多能性相关基因的高表达水平以及低DNA甲基化水平，此后培养终止。微型生物反应器还可用于维持前体细胞培养的最佳条件，并提高终末分化效率。

a-two-step-strategy-that-combines-epigenetic-modification

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

结合表观遗传修饰和生物力学线索的两步策略，以产生哺乳动物多能细胞

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS...

利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。...

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

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一种可化学诱导DNA羟甲基化与表观遗传重塑的工程化分裂型TET2酶

染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。...

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

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基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

当细胞达到汇合状态时，必须进行传代培养。本视频将演示贴壁细胞和悬浮细胞的传代培养操作步骤。...

胰蛋白酶消化与哺乳动物细胞传代培养

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。...

染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

了解如何通过化学表观遗传擦除与生物力学线索相结合的两步策略，在液体大理石微生物反应器中从成纤维细胞诱导哺乳动物多能性。该方法无需病毒载体，可稳定维持细胞特性超过28天。

一种结合表观遗传修饰与生物力学信号的两步法策略以生成哺乳动物多能细胞

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