利用免疫反应增强技术的超高速蛋白质印迹法

Western blot 是一种在转印膜上检测抗原的成熟方法，广泛应用于生物医学研究，但完成整个实验流程通常需要数小时甚至数天。通过将免疫增强技术与循环引流和补充相结合，一旦获得封闭膜，整个流程可在短短20分钟内完成，且不牺牲检测灵敏度。由于 Western blot 被应用于众多不同的研究领域，该方法具有广泛的适用性，可显著加快科研进程。

该实验方案的成功实施依赖于对抗体稀释比例、免疫反应增强试剂及孵育时间的优化。首先，将PVDF膜置于适当的封闭缓冲液中，在室温下振荡孵育1小时。在膜孵育的同时，使用蒸馏水配制10%免疫反应增强剂一溶液（IRE1），充分涡旋混匀，然后用10% IRE1稀释一抗，轻柔且充分地混合。

用镊子夹起PVDF膜，短暂沥干封闭液。将膜放入含有初级抗体的锥形管中，确保整张膜紧贴管壁，且原先与凝胶接触的一面朝向管内。盖紧管盖。

将试管放入杂交炉的玻璃瓶中，并打开杂交炉。以每分钟6转的速度孵育膜至少5分钟。停止旋转，用镊子小心地从试管中取出PVDF膜。

将膜放入含有50毫升PBST的容器中冲洗，然后在装有蒸馏水的容器中继续冲洗，直至无气泡出现，以去除大部分抗体。将膜转移至含有250毫升PBST的 Salad Spinner 中。将滤篮放入 Spinner 内，确保盖子已牢固盖好，然后启动 Spinner，运行20至30秒。

弃去溶液，并用蒸馏水短暂冲洗旋转器内部。向旋转器中加入 250 毫升 PBST，重复离心操作，然后按照文本稿件中的描述，用二抗孵育膜并再次洗涤。将一片半透明的柔性薄膜平铺于平坦表面上。

将化学发光底物的两种组分加入5毫升离心管中混合，并立即取1.5毫升混合后的底物溶液加入半透明膜上。将PVDF膜置于溶液上，再将剩余的底物溶液转移至膜上。用混合后的底物孵育PVDF膜1分钟。

用镊子夹起PVDF膜，短暂沥干底物溶液。将膜夹在两张透明膜之间，在化学发光模式下进行成像。此处显示了用于Western印迹化学发光检测所需的抗原和抗体各自的数量。

在静态和CDR孵育条件下，使用IRE溶液均提高了检测灵敏度。同样，抗6s His标签抗体的最低使用浓度在静态条件下从100纳克/毫升降低至50纳克/毫升，在CDR条件下从100纳克/毫升降低至12.5纳克/毫升。与静态孵育相比，5分钟或10分钟的CDR孵育显著降低了检测限。

此外，CDR 与 IRE 联用在 Western 印迹中表现出更高的灵敏度，即使在极短的孵育时间内也是如此。本文展示了该方法在荧光检测 Western 印迹中的成功应用。与化学发光检测相比，荧光检测具有独特的优势，能够在同一印迹上同时检测多个靶标，而无需 stripping 和重新孵育抗体。

使用双色荧光染料同时检测细胞裂解液中的His标签碱性磷酸酶和β-肌动蛋白。CDR与IRE的孵育不仅加快了检测速度，还提高了检测灵敏度。孵育过程中，膜应始终贴附在管壁上。

应将试管水平旋转，使溶液持续流过膜表面。该方案显著加快了我们的研究进度，而研究进度在很大程度上依赖于蛋白质印迹（Western blotting）实验流程。