Name: 在自由行为鼠标的杏仁核中，使用头山小型显微镜成功进行体内钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习使用头戴式微型显微镜在小鼠杏仁核进行体内钙成像的技术方法。本方案提供病毒注射、GRIN透镜植入等关键步骤的详细操作指南，可同时监测多达150个活跃神经元的实时活动，为研究情绪行为的神经机制提供重要工具。

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本工作由三星科学技术基金会资助（项目编号 SSTF-BA1801-10）。

<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

熟练的手术技术对于在杏仁核等深层脑区成功开展基于头戴式微型显微镜的活体光学钙成像至关重要，正如本文所述。因此，尽管本方案为基板固定和GRIN透镜植入的优化手术流程提供了指导，某些关键步骤可能仍需进一步优化。如方案部分所述，手术中杏仁核的定位坐标、基板固定时的气流速度、图像采集参数（帧率、LED功率等）.钙成像中的变量（ICA 时间权重、事件最短衰减时间等）.) 在数据处理中需要优化。
基板安装步骤可以进行调整。头部固定板是必要的，因为它有助于在移动式家庭笼中固定清醒小鼠的头部，以便进行基板安装。然而，如果实验室未配备移动式家庭笼，则可选用异氟烷气体麻醉系统作为替代方案。对于这种替代方法，异氟烷气体的浓度可能尤为关键。我们观察到，在1.5%异氟烷麻醉条件下，小鼠杏仁核中的GCaMP信号极少被检测到。相反，在0.8%异氟烷条件下可检测到GCaMP信号，且小鼠处于接近清醒状态，头部无明显运动。因此，该麻醉条件允许在无需额外设备（如头部固定板和移动式家庭笼）的情况下完成基板安装。
颅骨螺钉、牙科水泥...

钙是一种普遍存在的第二信使，在几乎所有细胞功能中都发挥着关键作用8在神经元中，动作电位的发放和突触输入会引起细胞内游离[Ca2+]9,10因此，追踪钙瞬变可为监测神经元活动提供一种有效手段。GECIs 是功能强大的工具，可用于监测[Ca2+在定义的细胞群体和细胞内区室中11,12在众多基于蛋白质的钙离子指示剂中，GCaMP 是一种 Ca2+ 基于单个GFP分子的探针13是目前经过最优化且应用最广泛的GECI。经过多轮工程化改造，已开发出多种GCaMP变体12,14,15,16我们在此方案中使用了一种近期开发的GCaMP蛋白GCaMP7b。16GCaMP 传感器极大地促进了多种模式生物神经回路功能的研究，例如钙成像2+ 发育过程中的瞬时现象17在特定皮层中的活体成像18运动任务学习中神经回路动态的测量19 与海马体和杏仁核中关联性恐惧记忆相关的细胞群体活动的成像20,21.
GECI的光学成像具有多项优势22。遗传编码使GECI能够在由基因特征或特定解剖连接模式定义的特定细胞亚群中长期稳定表达。光学成像技术可在活体动物中对数百至数千个神经元进行长期同步监测。目前已开发出若干种光学成像系统，用于在自由活动的小鼠脑内对GECI进行活体成像与分析，这些系统结合了头戴式微型荧光显微镜21,23,24,25。尽管基于GECI、GRIN透镜和头戴式微型显微镜的活体光学成像技术是研究神经环路活动与行为之间关联的有力工具，但由于存在若干技术难题，将其应用于杏仁核仍具挑战性，这些问题包括：难以将GRIN透镜精准定位至表达GECI的杏仁核细胞，同时避免产生严重影响图像采集质量的运动伪影，以及难以可靠地识别表达GECI的细胞。本实验方案旨在为基板固定和GRIN透镜植入等关键手术步骤提供实用的操作指南，这些步骤对于成功实现杏仁核的活体光学钙成像至关重要。尽管本方案以杏仁核为靶区，但其中描述的大多数操作步骤同样适用于其他深层脑区。尽管本方案基于特定系统（例如Inscopix），但使用其他替代系统也可轻松实现相同目的。

<table><tbody><tr><td>26G针头</td><td>BD</td><td>302002</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&amp;alpha;-GFP</td><td>定制</td><td></td><td>外科手术</td></tr><tr><td>丙烯酸-牙科水泥（Ortho-jet Acrylic Pink）</td><td>Lang</td><td>1334-粉红</td><td>外科手术 &amp;和底板连接</td></tr><tr><td>气流控制器</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>基板连接</td></tr><tr><td>阿莫西林</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>底板</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>基板连接</td></tr><tr><td>基板盖</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>基板连接</td></tr><tr><td>行为学实验装置（实验箱）</td><td>Coulbourn仪器</td><td>测试笼</td><td>行为测试</td></tr><tr><td>行为学实验装置（软件）</td><td>Coulbourn仪器</td><td>定格画面</td><td>行为测试</td></tr><tr><td>碳笼</td><td>Neurotar</td><td>180 mm × 70 mm</td><td>基板连接</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>数据处理软件</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX 数据处理软件</td><td>基板连接 &amp;amp; 行为测试</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>钻孔</td><td>Seyang</td><td>马拉松-4</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>钻头</td><td>ELA</td><td>US1/2，Shank104</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>玻璃针</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>GRIN透镜（INSCOPIX Proview Lens Probe）</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>汉密尔顿注射器</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>头板</td><td>Neurotar</td><td>模型 5</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>六角扳手</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>基板连接</td></tr><tr><td>笔记本电脑</td><td>三星</td><td>NT950XBV</td><td>外科手术 &amp;和基板连接</td></tr><tr><td>透镜固定器，立体定位杆（INSCOPIX proview 植入套件）</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>显微镜抓手</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>基板连接</td></tr><tr><td>显微镜，数据采集软件，硬件</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>基板连接 &amp;amp; 行为测试</td></tr><tr><td>移动式家养笼</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>基板连接</td></tr><tr><td>电动臂</td><td>Neurostar</td><td>定制化</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>电动臂软件</td><td>Neurostar</td><td>定制化</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>NI板</td><td>国家仪器</td><td></td><td>行为测试</td></tr><tr><td>可移除环氧键</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>树脂水门汀（Super-bond）</td><td>Sun医疗</td><td>Super bond C&amp;& B</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>颅骨螺钉</td><td>斯托尔廷</td><td>51457</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>立体定位电极夹持器</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>斯托尔廷</td><td>51600</td><td>外科手术</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>斯托尔廷</td><td>51600</td><td>基板连接</td></tr></tbody></table>

在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

在自由活动的动物体内实时监测神经元活动是将神经元活动与行为联系起来的关键方法之一。为此，已开发出一种体内成像技术，该技术利用基因编码的钙指示剂（GECIs）、微型荧光显微镜和梯度折射率（GRIN）透镜来检测神经元中的钙瞬变，并已成功应用于多种脑结构1,2,3,4,5,6。该成像技术特别强大，因为它能够对基因定义的细胞群体进行长期慢性同步成像，持续时间可达数周。尽管该技术具有实用性，但将其应用于位于大脑深部的脑区（如杏仁核）仍存在困难，而杏仁核是情绪处理和联想性恐惧记忆的关键脑结构7。有多个因素导致该成像技术难以应用于杏仁核。例如，在较深脑区进行成像时，通常更容易出现运动伪影，因为植入大脑深部的头戴式显微镜相对不稳定。另一个问题是侧脑室靠近植入的GRIN透镜，其在呼吸过程中的移动可能引起高度不规则的运动伪影，这些伪影难以校正，从而难以获得稳定的成像视野。此外，由于杏仁核中的细胞在静息或麻醉状态下通常活动较弱，因此在基板定位过程中很难发现并聚焦表达GECI的目标细胞，以供后续成像使用。本实验方案为如何高效地利用头戴式微型显微镜靶向杏仁核中表达GECI的细胞提供了有益的指导，以实现在此类深部脑区成功进行体内钙成像。需指出的是，本方案基于特定系统（例如 Inscopix），但并不局限于该系统。

GRIN透镜植入的验证 
在通过粘合将基板长期固定于脑组织之前，需对GRIN透镜的植入效果进行验证。在透镜植入成功动物中，可在显微镜物镜与植入的GRIN透镜之间距离所决定的焦平面范围内，清晰观察到表达GCaMP的细胞和血管（图2A和B）。相比之下，在植入位置偏离目标区域的动物中，焦平面范围内无法观察到清晰的GCaMP表达细胞图像（表现为失焦或超出视野）。在失焦情况下，血管图像清晰，但细胞在焦平面范围内仅呈现模糊影像（图2C和D）；在超出视野的情况下，大多数情况下无法观察到血管，且焦平面范围内未检测到荧光信号（图2E）。此外，与其他情况不同，植入的GRIN透镜边缘呈现明亮光环（图2F）。仅对经验证为GRIN透镜准确植入目标区域的动物进行基板固定操作。
<p class="jove_cont...

在体微型内窥镜钙成像是一种不可或缺的工具，可实现对自由活动动物神经元活动的实时监测。然而，将该技术应用于杏仁核一直存在困难。本方案旨在为在小鼠中成功利用微型显微镜靶向杏仁核细胞提供一项实用的操作指南。

在自由活动的动物体内实时监测神经元活动是将神经元活动与行为关联起来的关键方法之一。为此……

在使用微型显微镜对杏仁核进行活体钙成像时，可能会遇到诸多挑战。本方案提供了节省时间的操作指南，以实现成功的活体钙成像。活体钙成像技术能够长期连续地同时观察遗传学定义的细胞群体，成像时间可长达数周，而这一过程在此前是无法实现的。进行AAV注射时，将麻醉后的小鼠固定在立体定位仪上，调整前囟（bregma）和后囟（lambda）的高度与定位针齐平，确定暴露并消毒后的颅骨上开颅的位置。使用配备0.6毫米钻头的钻机，以18,000转/分钟的转速小心地进行直径1.6毫米的开颅，并用无菌PBS冲洗颅骨。从前囟至暴露脑表面的背腹向距离中减去4.2毫米（以前囟为基准的晶状体植入背腹向坐标），计算出A距离。随后，将3微升矿物油和0.7微升浓度大于1×10¹³病毒基因组/毫升的AAV溶液吸入玻璃移液管中。从立体定位探针架上取下固定针，以便将移液管固定在支架上，并将移液管置于已准备好的注射位点上方。待出血完全停止后，从前后囟的背腹坐标将玻璃移液管尖端插入脑组织4.3毫米，使用注射泵注入全部病毒体积，然后缓慢撤出移液管。当所有病毒注射完成后，再按照示范方法在颅骨上钻两个孔，以便植入两枚颅骨螺钉，并用PBS冲洗颅骨碎片。接下来，将经70%乙醇灭菌的螺钉尽可能深地植入，并在立体定位仪上安装电动手术臂。将所需硬件连接至已安装控制软件的笔记本电脑，并使用套管固定器将26号针头稳定地固定在立体定位仪上。计算针头插入位置的坐标后，使用立体定位操纵器将针尖置于暴露的脑组织表面，并用两到三滴PBS润湿脑组织。将适当的背腹侧和外侧杏仁核坐标输入软件，然后点击“GoTo”以降低针头。当针头完全停止后，在起始位置框中输入45毫米，并点击“GoTo”以抬升针头。当针头停止移动后，移除脑表面的PBS，并从立体定位仪架上卸下针头和套管固定装置。将镜头支架连接到立体定位杆上，并将GRIN镜头固定在镜头支架中。用70%乙醇对镜头进行消毒，然后将立体定位杆安装到立体定位仪框架上。将GRIN镜头尖端置于脑表面的指定位置，并从脑表面的背腹向坐标中减去A的绝对值，以确定镜头植入的背腹向坐标。向脑组织再滴加两到三滴 PBS 以保持湿润，使用电动臂将下降深度设置为 1,000 微米，上升高度设置为 300 微米。当 GRIN 透镜到达目标位置后，吸除 PBS，并在 GRIN 透镜、螺钉及螺钉侧壁周围小心涂抹树脂牙科水泥。待牙科水泥硬化后，将透镜夹持器从透镜上取下，并在颅骨表面涂布丙烯酸水泥。接下来，将透镜支架替换为水平固定在杆尖端的头板。缓慢下放杆，直到头板位于透镜套管顶部，再将头板向下移动 1,000 微米，使透镜位于头板内环的右边缘。使用丙烯酸水泥将头板固定在水泥层上，并用石蜡膜覆盖植入的GRIN透镜表面以防止灰尘污染，然后在石蜡膜上涂抹可移除的环氧胶，将膜固定在透镜表面，之后将动物放回笼中，并持续监测直至其完全恢复卧姿。为了评估GRIN透镜植入的质量，将麻醉后的小鼠置于移动式鼠笼系统的头固定杆上的碳笼中，并打开气流，使笼子能够无摩擦地自由移动。使用显微镜夹持器和立体定位仪将微型显微镜垂直对准框架，然后缓慢下降显微镜，直至在软件的视野中看到植入的GRIN透镜表面。将植入的GRIN透镜中心与视野中心对齐，拍摄GRIN透镜表面的图像，随后在观察图像中出现表达GCaMP的细胞时，缓慢提升显微镜的物镜。在成功植入透镜的动物中，可在同一焦平面范围内清晰观察到表达GCaMP的细胞和血管。相比之下，在透镜植入位置偏离目标区域的动物中，焦平面范围内无法观察到清晰的GCaMP表达细胞图像，尽管血管仍可勉强观察到。对于透镜位置超出视野的情况，则既无法观察到血管，也无法观察到表达GCaMP的细胞，仅可在植入的GRIN透镜上观察到明亮的边缘。在GRIN透镜成功植入的动物中，即使不给予声音刺激，外侧杏仁核视野范围内通常也有大约50至150个可能自发活动的细胞表现出显著的荧光变化。当给予声音刺激时，仅少数细胞表现出与声音特异性相关的GCaMP信号变化，该结果由ΔF图像分析确定。当对注射表达GFP的AAV作为对照的小鼠进行相同分析时，可在焦平面范围内检测到表达GFP的细胞，但无论有无声音刺激，均无细胞表现出显著的荧光变化。组织学验证显示GCaMP表达和GRIN透镜定位处未见组织损伤迹象，表明GRIN透镜周围脑组织无炎症反应。若进针或植入透镜的速度不均匀，可能导致运动伪影和图像质量下降。使用电动手术臂可有助于解决此问题。如果在基板安装步骤期间移动式家庭护理系统尚未准备就绪，可使用低浓度异氟烷气体对小鼠进行麻醉。

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