土壤中实验室、无机植物养分和污染物的二维可视化和量化
September 1st, 2020
此协议提供了多个阴唇无机养分和污染物溶胶物种的亚毫米 2D 可视化工作流程，使用薄膜 （DGT） 中的扩散梯度与质谱成像相结合。详细描述了在陆地植物的岩石圈中对溶解物进行定量测绘的索卢特采样和高分辨率化学分析。
土壤中元素的生物-化学循环在环境系统中起着至关重要的作用。通过该协议，可以使用 DGT 质谱成像在 2D 中对植物可用元素组分的分布进行成像。该方法的独特之处在于它能够在溶质界面上可视化和量化多种无机溶质种类的超痕量水平，大大超过了替代方法的空间分辨率。
除了研究土壤和沉积物中的劳动力和溶质通量外，该方法还可用于研究植物根系如何吸收营养和污染物元素。对于 DGT 凝胶制备，首先在玻璃板上涂上一层基于聚氨酯的混合阴离子和阳离子结合凝胶悬浮液薄膜，然后将板放入烘箱中，通过溶剂蒸发引发凝胶形成。重复应用和蒸发 3 次后，在水浴中水合所得的三层涂层玻璃板，以获得 0.1 毫米薄、防撕裂的混合阴离子和阳离子结合凝胶。
要组装根状管，请使用两个夹子将一个小的丙烯酸刀片固定在根状管上升的底部，夹子的压力指向根状管框架，这样板就不会向内弯曲。将 rhizotron 稍微向小塑料板倾斜，并在 rhizotron 中填充预先湿润的土壤，高度约为 4 厘米。稍微搅动根茎以均匀分布土壤，并使用压实工具轻轻将土壤压缩几毫米。
重复填充和压缩，直到根茎被土壤填满，在顶部留出 3 厘米的间隙。使用胶带小心地将一块 13 x 22 厘米的 PTFE 箔片一次一个角地固定在根柱框架上，施加张力以确保箔表面平整。当 PTFE 箔平坦并与土壤表面相连时，在根茎的下端贴上第二片箔，以相同的方式将上部 PTFE 箔片重叠一厘米。
固定第二块后，盖上保护性塑料箔盖。将前板放在填满土壤和铝箔覆盖的根茎上，并在根茎的每一侧放置一个导轨。然后用手拧紧螺钉，将前板中的导轨固定到根茎上，螺钉位置朝向根茎的封闭侧。
要给土壤浇水，请将移液器吸头推入饮水孔，让水在重力作用入土壤中。要种植植物，最多可将两棵幼苗种植到根茎中，并直接向幼苗中加入 5 毫升水以支持其生长。种植后的前两天，用透明的保湿膜覆盖根茎的顶部开口，并用铝箔包裹根茎以防止微生菌生长。
然后将种植的根茎放入生长室中，环境条件根据特定的植物要求进行设置，并将根茎倾斜 25 至 35 度，以确保通过引力沿前板根系发育。要涂覆制备的 DGT 凝胶，请将 10 微米厚、孔径为 0.2 微米的聚碳酸酯膜切割成凝胶每侧至少大于 1 厘米的宽度和长度，然后将膜放在凝胶上。加水去除堆栈中的气泡，并使用乙烯基电工胶带沿凝胶的所有四个边缘将膜固定在板上。
取下前板和保护膜后，将配备微距镜头的数码单镜头反光相机的取景器对准凝胶中感兴趣区域的中心，并在图像中包括一个比例尺，获取感兴趣区域的正交照片。然后将装有凝胶膜堆栈的板的一个边缘与开放的根状加速器的边缘对齐。轻轻地将板向土壤弯曲，并使用导轨和螺钉将板连接到根状加速器。
单独采样期后，将前板从根状辐射转移到层流罩中，凝胶膜堆栈侧朝上，并小心地取下覆盖凝胶的胶带和聚碳酸酯膜。加水以帮助凝胶自由漂浮在板上的一层薄水膜上，土壤接触面朝上，然后将凝胶转移到孔径为 0.45 微米的聚醚砜膜和印迹纸支架上。用保护膜覆盖凝胶膜组后，将凝胶膜组放入真空凝胶干燥器中。
当凝胶完全干燥后，使用双面胶带将干燥的凝胶与其他凝胶样品一起固定在玻璃板上。要对干燥的 DGT 凝胶进行激光烧蚀电感耦合等离子体质谱线扫描分析，首先将样品空白和标准品固定在激光烧蚀样品台上，然后将激光样品台锁定到激光烧蚀系统的烧蚀池中。在激光消融软件中，移动凝胶表面的感兴趣区域，并在凝胶标准品的表面上绘制一条大约 1 毫升长的线。
右键单击扫描模式窗口中的线，以验证是否已设置和采用激光烧蚀参数，然后使用重复扫描工具将此线复制四次，线间距离大于光斑直径。对每个凝胶标准品校准空白和方法空白重复这条线后，沿待分析凝胶样品矩形区域的顶部边缘画一条线，并复制这条线，为整个样品区域创建平行线，如图所示，使用 300 至 400 微米的行间距。验证每条线的每个起点和终点是否正确聚焦在凝胶表面，然后单击 analyze batch 在电感耦合等离子体质谱仪上启动样品序列。
单击激光能量窗口中的发射以为激光头充电。单击 run 以打开 run experiment 窗口并仅选择选定的模式。将清除延迟设置为 20 到 30 秒。
选中 enabled laser during scans 框，并将激光预热时间设置为 10 秒。然后单击 run and okay 开始线扫描分析，并在电感耦合等离子体质谱仪上实时监测每种同位素的原始信号强度（以每秒计数为单位）。每行都应以 gas blank 开头和结尾。
分析后，将每条烧蚀线的原始数据文件导入电子表格。原始数据表显示了每种同位素的电感耦合等离子体质谱读数（以每秒计数）和相应的时间点（以秒为单位）。列出不同列中彼此相邻的所有行。
根据线消融前记录的所有气体空白值计算每种同位素的平均气体空白，并从每种同位素的相应原始强度中减去平均气体空白，以校正背景信号。要应用内部归一化，请将每种同位素的气体空白校正信号强度除以每个数据点的内标碳 13 的气体空白校正信号强度，以校正烧蚀材料量和仪器漂移的变化。在每条消融线的开始和结束之前和之后裁剪数据，以去除气体空白背景信号，并转置数据表以获得网格矩阵，其中每行对应于一条消融线，每列对应于一个归一化同位素强度值。
然后应用从凝胶标准品分析中获得的校准函数，并将校准后的数据矩阵保存为文本文件。要生成图像，请将校准后的样品数据矩阵作为文本图像导入图像分析软件，并应用纵横比校正因子和查找表来可视化溶质图像中的化学梯度。调整图像色彩平衡以控制显示范围的下限和上限，添加校准条并将溶质图像另存为 TIF 文件。
使用复制到系统命令复制实体图像并将图像粘贴到 Desktop Publishing 软件中。然后，对纯色图像进行缩放、匹配、对齐和合成，其中包含感兴趣区域的照片和其他溶质图像。将溶质图像与感兴趣区域的摄影图像对齐表明，不同元素的亚毫米 2D 固体通量分布根据土壤结构和根系形态而高度可变。
例如，在对生长在无碳酸盐土壤中的幼荞麦根进行分析中，用硝酸铵施肥，亚毫米溶质分布显示，由于根的吸收，铝、磷和铁通量与老根部分一起减少，并且由于局部养分动员过程，根尖的镁、铝、磷、锰和铁通量高度增加。在这项分析中，可以在直接根部位置观察到锌、镉和铅的明显消耗，这表明耐金属柳树种 Salix smithiana 的根部是受污染土壤中不稳定痕量金属的局部汇。在该分析中，使用组合的单层平面 Optode-DGT 阳离子结合凝胶，不稳定痕量金属沿 Salix smithiana 根的分布与 pH 值的分布共定位。
该方法组合显示，锰、铁、钴、镍、铜和铅的溶质通量增加与 pH 值降低约一个单位相关，表明 pH 值诱导金属溶解。确保 DGT 工具和实体表面之间紧密稳定的接触以避免分析伪影至关重要。如有疑问，请重复凝胶应用程序。
该方法可以与其他基于扩散的固体成像技术（例如平面光学器件）结合使用，以同时评估植物元素吸收所涉及的一系列参数。
概述
本协议介绍了一种使用扩散薄膜（DGT）结合质谱成像的亚毫米二维可视化多种不稳定无机营养物和污染物溶质种类的工作流程。该方法允许定量映射陆生植物根际中的溶质。
关键研究组成部分
科学领域
- 环境科学
- 土壤化学
- 植物生理学
背景
- 土壤中元素的生物至化学循环对环境系统至关重要。
- 了解植物可利用元素分数的分布对营养管理很重要。
- 传统方法可能无法提供详细分析所需的空间分辨率。
- 本协议利用DGT质谱成像以实现增强可视化。
研究目的
- 在溶质界面上可视化和量化多种无机溶质种类的超微量水平。
- 调查土壤和沉积物中的劳动和溶质通量。
- 探索植物根系如何吸收营养和污染物元素。
使用的方法
- 使用聚氨酯基混合阴阳离子结合凝胶制造DGT凝胶。
- 组装用于土壤和植物生长的根部观察器。
- 应用DGT凝胶进行溶质采样。
- 激光消融电感耦合等离子体质谱用于DGT凝胶分析。
主要结果
- 成功二维成像营养物和污染物溶质种类。
- 实现了根际中溶质的定量映射。
- 与替代方法相比，空间分辨率得到增强。
- 对植物根系营养吸收机制的洞察。
结论
- DGT质谱成像方法有效用于研究土壤-植物相互作用。
- 本协议可应用于各种环境研究。
- 未来研究可以在这一方法基础上，用于土壤化学的更广泛应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables sub-millimeter 2D visualization and quantification of labile inorganic nutrients and contaminants in the rhizosphere, providing high-resolution spatial data on solute fluxes at the soil-plant interface. It supports mechanistic de-risking in early discovery by revealing localized nutrient mobilization and trace metal uptake patterns, which can inform target validation for agrochemical or phytoremediation strategies. The quantitative, multi-element imaging capability enhances predictive confidence in modeling plant-environment interactions for translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping labile nutrient and contaminant fluxes in plant-root systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of solute distribution changes associated with root morphology and soil chemistry.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying localized zones of elemental depletion or accumulation linked to plant physiological processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (rhizotrons with DGT gels) for downstream compound screening by establishing baseline solute flux profiles.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via internal normalization using 13C and external calibration with matrix-matched gel standards.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation through quantitative 2D imaging of multi-element solute fluxes at sub-millimeter resolution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase rhizosphere imaging to preclinical validation by co-localizing solute fluxes with physiological markers such as pH.
- Mechanistic De-risking: Reveals pH-induced metal solubilization patterns, reducing ambiguity in trace metal uptake mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking root-mediated solute fluxes to environmental contamination or nutrient mobilization phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical work, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in soil-plant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing spatial relationships between root morphology and solute fluxes of nutrients and contaminants.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible DGT gel deployment and LA-ICP-MS line-scan imaging for quantitative solute mapping.
- Analytics: Provides normalized, calibrated isotope intensity data enabling cross-condition comparison of labile solute species.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by correlating solute fluxes with environmental parameters like pH, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multi-element rhizosphere imaging across diverse plant species and soil conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nutrient and contaminant uptake pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sub-millimeter 2D solute flux measurements.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in agrochemical or phytoremediation development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, spatially resolved solute flux data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DGT gel fabrication, rhizotron assembly, and LA-ICP-MS operation.
- Depends on access to laser ablation systems, mass spectrometers, and clean lab environments for gel preparation and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation, deployment, and imaging protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations across plant species, soil types, and contaminant profiles to maintain solute flux accuracy.
- Practical limitations include the need for close and stable DGT gel-soil contact to avoid analytical artifacts, as noted in the source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) Gel Fabrication and Rhizotron Preparation
3:06
Plant Cultivation
3:47
Solute Distribution Sampling
4:48
Gel Retrieval and Chemical Analysis Preparation
5:38
Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Line Scan Analysis
7:39
Data Processing and Calibration
9:03
Image Generation
9:48
Results: Representative Sub-mm 2D Solute Flux Distribution of Multiple Nutrients and Contaminants Across Different Soil-Root Interfaces
11:24
Conclusion
