Name: 土壤中实验室、无机植物养分和污染物的二维可视化和量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 了解利用扩散梯度薄膜结合质谱成像技术对土壤中多种无机植物养分和污染物进行亚毫米级二维可视化和定量分析的方法。该技术可实现根际溶质的高分辨率定量成像。

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本研究由奥地利科学基金（FWF）：P30085-N28（Thomas Prohaska）以及奥地利科学基金（FWF）与下奥地利州联邦州共同资助：P27571-BBL（Jakob Santner）。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍的溶质成像方法是一种多功能技术，可用于可视化和量化土壤-植物环境中的二维养分和污染物通量。该方法的独特之处在于能够生成土壤-根界面处可移动溶质种类的亚毫米尺度多元素图像，其空间分辨率显著高于其他测定根际溶质梯度的方法4。结合高灵敏度的化学分析方法（如激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法，LA-ICP-MS），扩散梯度薄膜技术（DGT）的靶向原位采样策略可实现对生长于土壤或类似基质中单根植物周围溶质通量动态的详细研究。由于DGT采用基于“汇”的采样过程，所获得的图像反映了被成像溶质的可移动性，因而可作为其植物有效性的估计值10。尽管该方法本身对溶质通量的测量具有显著优势（例如可解释为植物可利用的养分组分），但通量测量结果远不如孔隙水浓度测量结果直观易懂。在大体积土壤应用中，标准DGT采样几何结构（特别是该设置中使用的0.8 mm厚扩散凝胶）允许将实际孔隙水浓度csoln与通过整体DGT测量得到的时间平均孔隙水浓度估计值cDGT进行比较，并据此参数解释某一溶质种类的补充动力学。然而，在使用极薄扩散层的成像型DGT应用中，无法进行此类比较，因为由此推导出的cDGT值极小，不符合实际情况34。因此，DGT成像结果并不总是易于快速解读，且通常无法与更传统的孔隙水浓度测量结果直接比较。
在应用该方法时，有几个关键步骤需要仔细考虑，主要涉及根际盒生长容器的填土和浇水过程。在将土壤填入根际盒的过程中，必须避免过度压实土壤，因为植物根系无法穿透高度压实的土壤，根系生长将受到抑制。我们观察到根系会避开高度压实的土壤，转而沿着根际盒生长容器的内边缘生长，因为这些区域的土壤通常压实程度较低。在这种情况下，位于根际盒中心区域的单个根系（该区域便于放置DGT凝胶）可能完全不发育，从而实质性地阻碍凝胶的成功应用。在本实验室的经验表明，当土壤干容重为1.0–1.4 g cm-3时，可实现根系的无障碍发育。此外，过度压实土壤还可能引起与氧化还原敏感性元素及其地球化学相关物种溶解度有关的假象。由于高度压实的土壤总孔隙体积减少，且孔径分布向更小孔径偏移，可供空气填充的大孔隙体积减少，可能导致局部出现还原条件。因此，MnIII/IV-和FeIII-氧化物可能被还原，导致Mn2+和Fe2+通量增加。而铁氧化物的溶解（其为磷酸盐和微量元素的重要吸附位点）可能释放被吸附和/或共沉淀的物质，从而导致地球化学相关物种的通量人为升高。如果生长容器浇水过多，也可能出现类似问题。由于生长容器顶部的土壤表面积较小，蒸发量低，种植后土壤可能持续处于水分饱和状态长达数周，这也可能引发氧化还原假象。
另一个重要的考虑因素是所制备的高分辨率扩散梯度（HR-DGT）结合凝胶的化学功能特性。按照本方案操作，可获得结合相分布均匀的薄凝胶。如果凝胶存在材料分布不均的区域（例如凝胶中的孔洞或结合相的团聚物），则需要去除这些区域；若不均匀范围过大，则必须重复凝胶制备流程。若制备得当，凝胶必须能够立即且定量地结合扩散进入凝胶的目标溶质种类27，这取决于分析物特异性的凝胶结合容量。在未受污染的土壤中，超过凝胶容量的问题较小，但在重金属污染土壤和盐渍土壤环境中应予以考虑。凝胶结合相的饱和不仅会损害溶质定量采样的准确性，还会导致溶质在凝胶内不同结合相之间发生侧向扩散，从而模糊小尺度溶质通量特征的空间定位。因此，若预期目标土壤环境中存在极高浓度的活性营养元素/污染物种类，应先进行预实验测试。为估算预期的DGT负载量，可采用整体土壤DGT活塞采样，随后进行凝胶洗脱及湿化学分析15,49。如有必要，可通过调整DGT部署时间来缩短凝胶接触时间，从而避免超过凝胶容量阈值导致的饱和。相反地，若预期溶质负载量极低，预实验也有助于确定所需的凝胶接触时间及/或激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）检测灵敏度，这对于在自然土壤背景水平下绘制痕量元素溶质分布图尤为重要15。此外，在将DGT凝胶投入实验应用之前，应通过在制备DGT LA-ICP-MS校准标准品过程中对凝胶进行受控加标，验证其功能是否正常。该凝胶标准品提供了一种基质匹配的参考分析物负载量，可用于评估LA-ICP-MS测定的样品凝胶负载量是否处于预期范围内。若无法获得明显区别于气体空白和方法空白背景噪声的信号，操作人员必须确认已正确执行痕量元素分析的实验室操作程序，并准确完成所有方案步骤。有时，在溶质采样后，DGT凝胶可能被意外翻转，使暴露于土壤并已负载溶质的一面朝向玻璃板而非激光束，这将导致信号强度降低，并在最终的溶质通量图像中出现错误翻转的特征。
在进行激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）分析时，会产生大量数据，评估这些数据需要耗费相当长的时间。在本实验室中，我们使用自行开发的数据处理脚本，结合标准电子表格软件，针对目标数据输出格式进行定制化处理。经过半自动化的数据排序与校准后，采用开源、开放获取的图像分析工具（ImageJ、Fiji50）进行图像绘制。该方法能够全面控制数据的排序、分析与呈现过程，这一点至关重要，因为所采集的数据对应的是矩形而非正方形像素，必须在生成的溶质分布图中准确显示。此外，在数据处理过程中，应谨慎避免任何像素插值操作。像素插值会导致化学图像中出现平滑的梯度，使元素分布特征变得模糊，通常呈现为圆形，从而对原始数据造成不期望的改变。尽管像素插值是许多图像处理软件中重缩放和重格式化操作的标准步骤，但通常可以选择关闭此功能。
总之，所述方法对于理解自然土壤-根际-植物系统中养分和污染物的动态过程具有重要意义。该方法不仅可以单独用于DGT分析，还可与其他基于扩散的成像技术结合使用，例如平面光极技术3,33,42,43,48,51和酶谱法20,21,22,23,24，并有望进一步发展以纳入更多元素和土壤参数。

作物植物对养分的获取是决定其生产力的关键因素。人们已对作物高效吸收养分的过程进行了深入研究，特别是土壤-根际界面（即根际）中调控养分对植物根系有效性和养分进入根系内部的机制，在作物养分获取中具有重要作用。植物养分吸收的重要过程包括：养分向根部的运输；土壤孔隙水中溶解态养分与固相土壤表面结合态养分之间的动态吸附平衡；微生物对养分的竞争；土壤有机质中所含养分的微生物矿化作用；以及养分进入根部共质体的内部化过程。无机痕量金属（类）污染物的吸收在很大程度上也受相同机制的控制。
根据养分和污染物的可利用性、植物需求以及在土壤中的扩散性，可以在根际观察到不同的养分分布模式。对于吸附性强且内部化速率相对较高的元素（如 P、Fe、Mn、Zn、As、Cd、Pb），其根际中可移动态（即可逆吸附态）元素含量较主体土壤降低，耗竭区宽度通常≤1 mm；而对于移动性较强的养分如 NO3-，耗竭区可延伸至数厘米1。此外，当某些元素（如 Al 和 Cd）的可利用性超过植物吸收速率时，已在根际中观察到其积累现象2,3。
鉴于根际过程在养分和污染物循环中的重要性，目前已开发出多种可在高空间分辨率下测定植物可利用元素形态的技术4,5。然而，由于多种原因，小尺度下活性溶质分布的测量仍面临挑战。主要难点在于，需要在活体植物根系周围特定位置采集极小体积（低至 µL 量级）的土壤和/或孔隙水样品，以解析根际中陡峭的养分梯度。解决该问题的一种方法是使用微孔负压抽吸装置提取孔隙水样品6。A. Göttlein、A. Heim 和 E. Matzner7 利用该方法，在约 1 cm 的空间分辨率下测定了欧洲栎（Quercus robur L.）根系附近土壤孔隙水中的养分浓度。分析 µL 量级土壤或土壤溶液样品的难点在于，这些微小样品体积，结合除主要营养元素外普遍较低的浓度，要求采用高灵敏度的化学分析技术。
另一种可分辨低至约 0.5 mm 尺度营养梯度的系统，是在土壤块表面培养一层根系垫，根系与土壤之间由一层薄的亲水性膜隔开8,9。在此配置中，溶质可穿过该膜，根系可从土壤中吸收养分和污染物，同时根系分泌物也可扩散进入土壤。在致密根层形成后，可对土壤块进行取样并切片，以获取用于后续元素形态提取的土壤样品。通过该方法，可分析在相对较大面积（约 100 cm2）上平均的一维养分和污染物梯度。
另一个挑战是获取不稳定的、植物可利用元素组分的样品，因为大多数化学土壤提取方法与植物吸收养分和污染物的机制存在显著差异。在许多土壤提取方案中，土壤与提取剂溶液混合，旨在建立溶解态与吸附态元素组分之间的（准）平衡状态。然而，植物会持续吸收养分，因此通常会不断耗尽根际土壤中的养分。尽管平衡提取法因其操作简便而被广泛用作土壤检测方法，但所提取的养分组分往往不能很好地代表植物实际可利用的养分部分10,11,12,13。相比之下，提出了一类能够持续从土壤中移除养分的“汇式”方法，这类方法被认为具有优势，因其可模拟根系吸收过程，更接近植物养分吸收的真实机制10,11,14,15。
除了上述方法之外，针对特定元素和土壤（生物）化学参数，已开发出能够测量连续参数图谱的真实成像应用，其分辨率可达 ≤100 µm，成像视野可达数 cm25。只要存在合适的放射性同位素，放射自显影技术即可用于成像根际中的元素分布16。平面光极技术可用于可视化重要的土壤化学参数，如 pH 和 pO217,18,19，而酶活性或总蛋白分布则可通过荧光指示剂成像技术（如土壤酶谱法20,21,22,23）和/或根系印迹法24进行绘图。尽管酶谱法和放射自显影技术一次仅能测量单一参数，但利用平面光极技术可同时进行 pH 和 pO2 的成像。较为传统的根垫技术仅能提供一维信息，而微型吸管技术则仅能提供点测量或低分辨率的二维信息，但这两种方法均支持多元素分析。最近，P. D. Ilhardt, 等人25 提出了一种新方法，利用激光诱导击穿光谱技术（LIBS），在经过精细样品制备以保持自然元素分布的土-根芯样品中，以约 100 µm 的分辨率绘制二维多元素总量分布图。
目前唯一能够以高空间分辨率对多种营养物质和污染物溶质进行靶向二维采样的技术是薄膜扩散梯度（diffusive gradients in thin films, DGT）技术，这是一种基于汇的采样方法，可在嵌入水凝胶层中的结合材料上原位固定活性态痕量金属（类）物种26,27。DGT最初被提出作为一种化学形态分析技术，用于测定沉积物和水体中的活性溶质，随后很快被应用于土壤研究28。该技术可实现亚毫米尺度的多元素溶质成像，最早在河流沉积物中得到验证29，并进一步发展用于植物根际环境的研究30,31,32,33。
进行DGT采样时，将一块尺寸约为3 cm × 5 cm的凝胶片贴附于生长在土壤块表层的单根植物根系上，凝胶与土壤之间由一层亲水性膜隔开。在接触期间，土壤中活性的养分和/或污染物会扩散进入凝胶，并立即被凝胶中所含的结合材料固定。通过这种方式，在采样期间于凝胶处建立起浓度梯度，从而形成并维持持续向凝胶方向的净扩散通量。采样结束后，可将水凝胶取下，并采用可实现空间分辨分析的分析化学技术进行检测。其中一种高度专业化且常用的技术是激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）。在一些早期研究中，也曾使用微束粒子诱导X射线发射技术（PIXE）29。DGT采样结合LA-ICP-MS分析可实现空间分辨率达~100 µm的多元素化学成像。若采用高灵敏度的ICP-MS技术（例如扇形磁场ICP-MS），可达到极低的检测限。在一项关于石灰施用对玉米吸收锌和镉影响的研究中15，我们成功在未受污染的土壤中对玉米根际活性镉进行了成像，其检测限低至每凝胶面积38 pg cm-2 Cd。DGT、平面光极（planar optodes）和酶谱法（zymography）均依赖目标元素从土壤向凝胶层的扩散过程，这一共性可被用于多种方法的联合应用，以同时或依次成像大量与植物养分及污染物吸收相关的参数。有关DGT成像的分析化学特性、DGT与其他成像方法联用的潜力及其应用的详细信息，已在参考文献34,35中进行了全面综述。
本文介绍了在非饱和土壤环境中，利用DGT技术对陆生植物根系进行溶质成像实验的操作方法，包括植物培养、凝胶制备、凝胶施用、凝胶分析及图像生成。所有步骤均进行了详细阐述，并包含关键步骤的注意事项和实验替代方案。

<table><tbody><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;（过硫酸铵；APS）</td><td>VWR</td><td>21300.260</td><td>&amp;ge;98.0%，分析纯</td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td>&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>丙烯酰胺溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058-100ML</td><td>40%，用于电泳</td></tr><tr><td>分析物盐</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>使用分析纯或更高纯度的水溶性分析物盐</td></tr><tr><td>布氏漏斗</td><td>VWR</td><td>511-0065</td><td>13 cm 板直径</td></tr><tr><td>化学平衡模拟软件</td><td>KTH 瑞典</td><td>n/a</td><td>Visual MINTEQ</td></tr><tr><td>夹具</td><td>本地仓库</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>桌面排版软件</td><td>Adobe 公司</td><td>n/a</td><td>InDesign CS6</td></tr><tr><td>DGT 交联剂</td><td>DGT Research Ltd</td><td>n/a</td><td>2%，琼脂糖衍生物</td></tr><tr><td>DGT 活塞式采样器</td><td>DGT Research Ltd</td><td>n/a</td><td>2 cm 直径暴露窗口</td></tr><tr><td>数码单反（DSLR）相机</td><td>佳能公司</td><td>n/a</td><td>Canon EOS 1000D</td></tr><tr><td>分散装置</td><td>IKA</td><td>3737000</td><td>Ultra-Turrax T10 Basic</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Tesa</td><td>56171</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34923</td><td>优级纯，无水，&amp;ge;99.8%</td></tr><tr><td>凝胶转印纸</td><td>Whatman</td><td>10426981</td><td>转印纸，Grade GB005，20 &amp;times; 20 cm，厚度 1.5 mm</td></tr><tr><td>凝胶干燥仪</td><td>UniEquip</td><td>n/a</td><td>UNIGELDRYER 3545</td></tr><tr><td>高压微波系统</td><td>Anton Paar</td><td>n/a</td><td>Multiwave 3000</td></tr><tr><td>HNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>1.00456.2500P</td><td>65%，ISO 分析级</td></tr><tr><td>水平摇床</td><td>GFL</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>HydroMed D4</td><td>AdvanSource Biomaterials Corp.</td><td>n/a</td><td>醚类亲水性聚氨酯</td></tr><tr><td>ICP-MS 软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Syngistix</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>n/a</td><td>ImageJ Fiji，可从 https://fiji.sc/ 免费获取</td></tr><tr><td>刮刀涂布装置</td><td>BYK</td><td>5561</td><td>单棒 6&amp;Prime;，0.5 mils</td></tr><tr><td>LA 软件</td><td>Elemental Scientific Lasers</td><td>n/a</td><td>ActiveView</td></tr><tr><td>LA 系统</td><td>Elemental Scientific Lasers</td><td>n/a</td><td>NWR193</td></tr><tr><td>层流操作台</td><td>Telstar Laboratory Equipment B.V.</td><td>n/a</td><td>II 级生物安全柜</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>IKA</td><td>0003582400</td><td>C-MAG MS 7</td></tr><tr><td>保湿膜</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>PM999</td><td>Parafilm M，4&quot; × 250'</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-50ML</td><td>生物试剂，适用于电泳，~99%</td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229938-10G</td><td>99.995%，痕量金属基准</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1064980500</td><td>分析用颗粒</td></tr><tr><td>顶置式摇床</td><td>GFL</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>全氟烷氧基烷烃（PFA）瓶</td><td>Savillex</td><td>200-015-20</td><td>15 mL 标准瓶，圆底内腔</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-644-928</td><td>Orion 3-Star 台式 pH 计</td></tr><tr><td>pH 探头</td><td>Thermo Scientific</td><td>8157BNUMD</td><td>Orion ROSS Ultra pH/ATC 三合一电极</td></tr><tr><td>塑料切割器</td><td>DGT Research Ltd</td><td>n/a</td><td>使用 DGT Research Ltd 提供的空交联剂瓶</td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>Semadeni</td><td>602</td><td></td></tr><tr><td>油灰</td><td>本地文具店</td><td>n/a</td><td>基于石蜡和填充剂的不干型塑性建模材料</td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜圆片</td><td>Whatman</td><td>110606</td><td>Nuclepore 亲水膜，直径 25 mm，孔径 0.2 &amp;micro;m，厚度 10 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜片</td><td>Whatman</td><td>113506</td><td>Nuclepore 亲水膜，8 &amp;times; 10 英寸，孔径 0.2 &amp;micro;m，厚度 10 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>聚醚砜膜圆片</td><td>Pall Corporation</td><td>60172</td><td>Supor 450 膜圆片滤器，直径 25 mm，孔径 0.45 &amp;micro;m，厚度 0.14 mm</td></tr><tr><td>聚醚砜膜片</td><td>Pall Corporation</td><td>60179</td><td>Supor 450 膜圆片滤器，直径 293 mm，孔径 0.45 &amp;micro;m，厚度 0.14 mm</td></tr><tr><td>PTFE 薄膜</td><td>Haberkorn</td><td>n/a</td><td>厚度 50 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>PTFE 间隔片</td><td>Haberkorn</td><td>n/a</td><td>可提供不同厚度</td></tr><tr><td>PTFE 涂层剃须刀片</td><td>Personna GEM</td><td>62-0178</td><td>不锈钢单边刀片（涂层）</td></tr><tr><td>PTFE 涂层 Tygon 管</td><td>S-prep GmbH</td><td>SP8180</td><td>内径 0.32 cm</td></tr><tr><td>四极杆 ICP-MS</td><td>Perkin Elmer</td><td>N8150044</td><td>NexION 2000B</td></tr><tr><td>定量滤纸，454</td><td>VWR</td><td>516-0854</td><td>颗粒截留能力 12–15 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>电子表格软件</td><td>微软公司</td><td>n/a</td><td>Microsoft Excel 2016 (v16.0)</td></tr><tr><td>不锈钢切割器</td><td>本地锁具店</td><td>n/a</td><td>直径 2.5 cm</td></tr><tr><td>悬浮颗粒试剂-亚氨基二乙酸（SPR-IDA）</td><td>Teledyne CETAC Technologies</td><td>n/a</td><td>直径 10 &amp;micro;m 的聚苯乙烯微珠，10% (w/v) 微珠悬浮液</td></tr><tr><td>晶体管-晶体管逻辑（TTL）电缆</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>请咨询 ICP-MS 技术人员以确定适用于特定仪器的合适 TTL 电缆</td></tr><tr><td>双室池</td><td>Elemental Scientific Lasers</td><td>n/a</td><td>Two-volume cell 1</td></tr><tr><td>乙烯基电工胶带</td><td>3M</td><td>n/a</td><td>Scotch Super 33+</td></tr><tr><td>水纯化系统</td><td>Thermo Electron LED GmbH</td><td>n/a</td><td>TKA-GenPure</td></tr><tr><td>ZrOCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;times; 8H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Alfa Aesar</td><td>86108.30</td><td>99.9%，金属基准</td></tr></tbody></table>

土壤中不稳定的无机植物养分与污染物的二维可视化与定量分析

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

我们介绍一种用于在亚毫米级（约100 µm）空间分辨率下，对植物根系周围土壤（即“根际”）中不稳定态（即可逆吸附的）无机养分（如P、Fe、Mn）和污染物（如As、Cd、Pb）溶质种类的分布进行二维（2D）可视化与定量分析的方法。该方法结合了基于汇效应的溶质采样技术——薄膜扩散梯度法（DGT），以及空间分辨的激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）化学分析技术。DGT技术依赖于含有均匀分布的分析物选择性结合相的薄层水凝胶。多种可用的结合相使得通过简单的凝胶制备流程即可制备不同类型的DGT凝胶。在将DGT凝胶部署于根际时，植物被种植于扁平透明的生长容器（根际盒）中，从而实现对土壤中生长根系的最小侵入性接触。经过一段预培养期后，将DGT凝胶贴附于根际中选定的目标区域，进行原位溶质采样。随后回收DGT凝胶，并制备用于后续LA-ICP-MS线扫描成像对所结合溶质的化学分析。通过使用13C进行内部归一化，并利用基质匹配的凝胶标准品进行外部校准，可进一步实现对二维溶质通量的定量分析。该方法的独特之处在于能够生成土壤-植物环境中多元素溶质通量的定量、亚毫米尺度的二维图像，其空间分辨率显著优于其他用于测量根际溶质梯度的方法。本文展示了该方法在陆生植物根际中对多种阳离子和阴离子溶质种类成像的应用与评估，并强调了该方法与其他互补性溶质成像技术联用的可能性。

为了展示 DGT 成像方法的能力和数据细节，我们汇总了荞麦（Fagopyrum esculentum）和柳树（Salix smithiana）根际土壤中多种活性营养元素和污染物溶质的亚毫米级二维通量分布（图7）。本方案各主要操作步骤的大致所需时间见表1。
溶质图像在 图7 在三项不同的研究中，分别使用HR-MBG或HR-CBG结合凝胶生成。化学图像显示了空间分辨率为82-的二维溶质通量分布120 µm 沿x轴和300-400 µm 沿y轴方向，具体取决于所使用的LA-ICP-MS参数。由于在图像校准和重缩放过程中未应用插值，单个像素代表实测的数据点。将溶质图像与感兴趣区域（ROI）的照片图像对齐后可见，不同元素的亚毫米级二维溶质通量分布随土壤结构和根系形态表现出高度变异性。这可归因于这些元素在土壤-根际-植物系统中的不同生物地球化学行为，以及它们与土壤基质和植物根系的相互作用。
在图7A中，展示了在施加NH4NO3且不含碳酸盐的土壤中生长的幼嫩F. esculentum根周围不稳定的无机镁（Mg）、铝（Al）、磷（P）、锰（Mn）和铁（Fe）溶质通量的分布情况。亚毫米级的溶质分布显示，在较老的根段区域，由于根系吸收，Al、P和Fe的通量降低；而在根尖区域，由于F. esculentum根局部的磷活化过程，Mg、Al、P、Mn和Fe的通量显著升高。需要注意的是，根尖位置略低于土壤表面，因此在照片图像中几乎不可见。图7B展示了在中度受到Zn、Cd和Pb污染的土壤中生长的耐金属植物S. smithiana根周围不稳定微量元素（包括Mn、Fe、Zn、Cd和Pb）的分布情况。溶质图像显示，在紧邻根部的位置，Zn、Cd和Pb明显减少，表明S. smithiana根系在污染土壤中作为不稳定微量元素的局部汇。此外，还可观察到局部Zn、Cd和Pb通量的增加，表明这些微量元素在土壤-根界面处发生局部积累。
除了多元素溶质成像外，本方法还可与基于扩散的互补成像技术（如平面光极）相结合34。这一点在图7C中得到展示，其中利用一种结合式的单层平面光极-DGT阳离子结合凝胶33，将S. smithiana根际中活性微量元素的分布与pH分布进行了共定位。土壤基质施加了(NH4)2SO4肥料，导致根轴周围pH值相比主体土壤降低约1个单位。pH值的降低区域与Mn、Fe、Co、Ni、Cu和Pb的溶质通量增加区域共定位，表明金属的溶解是由pH变化所诱导的。
此外，这些示例结果展示了一些可能出现的成像伪影。例如，土壤结构的不均一性（如 图7A 中 ROI 图像下三分之一处观察到的水平线）可能导致土壤与结合凝胶之间的接触不连续，从而限制该位置溶质向结合凝胶中的扩散。相反，根际盒中土壤过度压实会导致孔隙度降低，进而人为地使土壤氧化还原状态向缺氧方向偏移。这一点在 图7B 中有所体现，溶质图像中大范围显著升高的锰（Mn）和铁（Fe）通量在视觉上与 ROI 图像中的致密土壤层相对应。这表明由于土壤过度压实导致土壤氧化还原电位降低，从而引起对氧化还原状态高度敏感的元素发生还原性溶解和溶出。因此，建议在填充根际盒时应谨慎操作，并在填充后立即对土壤表面进行目视检查。
<img alt="元素分布图；金属分析，pH 变化；光谱分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61661/61661fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：不同土-根界面中不稳定态养分与污染物溶质的亚毫米级二维分布。（A）在土壤含水量约为 75% WHC 的条件下，使用高分辨率膜扩散梯度技术（HR-MBG）采样 24 小时，获得幼嫩 F. esculentum 根周围阴离子态磷（P）和阳离子态镁（Mg）、铝（Al）、锰（Mn）及铁（Fe）溶质的分布图。Al、P 和 Mn 图像以校准后的 fDGT 值（pg cm-2 s-1）表示，而 Mg 和 Fe 图像则显示 13C 标准化强度。比例尺为 1 cm。本图改编自参考文献48。（B）在锌（Zn）、镉（Cd）和铅（Pb）中度污染的土壤中生长的 S. smithiana 根周围 Mn、Fe、Zn、Cd 和 Pb 的分布。在土壤含水量约为 80% WHC 的条件下，使用高分辨率阳离子结合膜（HR-CBG）采样 20 小时获取阳离子痕量金属溶质。所有图像均以校准后的 fDGT 值（pg cm-2 s-1）表示。比例尺为 0.5 cm。本图改编自参考文献3。（C）在添加了 Cd 的土壤中生长的 S. smithiana 根周围 pH 值及多种阳离子溶质的分布。通过改进的 HR-MBG 方法实现了 pH 与溶质动态的共定位分析，从而可同时进行溶质采样和平面光极成像33。Mn、Cu、Zn 和 Cd 图像以校准后的 fDGT 值（pg cm-2 s-1）表示，而 Fe、Co、Ni 和 Pb 图像则显示 13C 标准化强度。比例尺为 1 cm。本图改编自参考文献33。所展示的图像均根据 CC BY 许可协议从引用文献3,33,48 中复制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61661/61661fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61661/JoVE61661_Supporting%20Information_Updated%202021_.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了一种利用薄膜扩散梯度（DGT）结合质谱成像技术，对多种不稳定的无机营养元素和污染物溶质进行亚毫米级二维可视化的实验流程。文中详细描述了溶质采样及高分辨率化学分析方法，用于对陆生植物根际溶质进行定量分布图谱绘制。

我们描述了一种用于二维（2D）可视化和定量分析不稳定态（即可逆吸附的）无机物分布的方法...

土壤中元素的生物化学循环在环境系统中起着至关重要的作用。通过本实验方案，可利用DGT质谱成像技术对植物可利用元素组分的二维分布进行成像。该方法能够可视化并定量溶质界面处多种无机溶质物种的超痕量水平，在空间分辨率上显著优于其他替代方法。除了可用于研究土壤和沉积物中的溶质通量外，该方法还可用于探究植物根系对营养元素和污染物的吸收过程。对于DGT凝胶的制备，首先将一层基于聚氨酯的混合阴离子和阳离子结合凝胶悬浮液涂覆在玻璃板上，并将玻璃板放入烘箱中，通过溶剂蒸发启动凝胶形成。重复涂覆和蒸发过程三次后，将所得的三层涂覆玻璃板置于水浴中进行水化，以获得厚度为0.1毫米、抗撕裂的混合阴离子和阳离子结合凝胶。组装根际观察室时，使用两个夹子将一片小型亚克力板固定在根际观察室上升部分的底部，夹子的压力应作用在根际观察室的框架上，以防止板材向内弯曲。将根际观察室略微向小型塑料板倾斜，并用预湿润的土壤填充至约四厘米高度。轻轻晃动根际观察室，使土壤均匀分布，然后使用压实工具将土壤轻轻压实数毫米。重复填充和压实过程，直至根际室被土壤填满，在顶部留出三厘米的间隙。使用胶带将一块13厘米×22厘米的PTFE膜逐角小心固定在根际室框架上，施加张力以确保膜表面平整。当PTFE膜平整并与土壤表面紧密贴合后，以相同方式在根际室的下端固定第二块膜，使其与上方的PTFE膜重叠一厘米。当第二块部件固定后，覆盖一层保护性塑料薄膜。将前面板放置在已填满土壤并覆盖塑料薄膜的根际观察室上，并在根际观察室两侧各安装一条导轨。然后用手拧紧螺丝，将导轨通过螺丝固定在前面板上，螺丝位置应朝向根际观察室的封闭侧。为土壤浇水时，将移液器吸头插入浇水孔中，让水在重力作用下流入土壤。种植植物时，将最多两株幼苗种入根际盒中，并直接向幼苗添加5毫升水以支持其生长。种植后的前两天，用透明保湿膜覆盖根际盒的顶部开口，并用铝箔包裹根际盒，以防止微生物生长。然后将种植好的根际观察装置放入生长室中，环境条件设置为特定植物生长所需参数，并将根际观察装置倾斜25至35度，以通过向重力性确保根系沿前板生长。为应用制备好的DGT凝胶，用孔径0.2微米的聚碳酸酯膜裁剪出厚度为10微米、每边长度和宽度均比凝胶至少大1厘米的膜片，并将其放置在凝胶表面。加入水以去除层间气泡，并使用乙烯基电工胶带沿凝胶四边将膜片固定在板上。取下前板和保护膜后，将配备微距镜头的单反数码相机取景器对准凝胶中目标区域的中心，并在图像中包含比例尺，拍摄目标区域的正交照片。然后将装有凝胶膜堆叠的板的一边与打开的根箱（rhizotron）的一边对齐。轻轻将板向土壤方向弯曲，并利用导轨和螺丝将板固定到根箱上。在隔离取样期结束后，将根际盒的前板转移至超净工作台，使凝胶膜堆叠面朝上，小心移除覆盖在凝胶上的胶带和聚碳酸酯膜。加入水使凝胶在板上形成一层薄水膜，并让凝胶的土壤接触面朝上自由漂浮，然后将凝胶转移至带有0.45微米孔径的聚醚砜膜及吸水纸支撑的装置上。用保护箔覆盖凝胶膜堆后，将整个膜堆放入真空凝胶干燥仪中。当凝胶完全干燥后，使用双面胶带将干燥的凝胶与其他凝胶样品固定在玻璃板上。为了对干燥的 DGT 凝胶进行激光剥蚀电感耦合等离子体质谱线扫描分析，首先将样品空白和标准品固定在激光剥蚀样品台上，并将激光台锁定到激光剥蚀系统的剥蚀室中。在激光剥蚀软件中移动凝胶表面的目标区域，并在凝胶标准品表面绘制一条长约一毫米的直线。在扫描模式窗口中右键单击该线条，以确认激光消融参数已设置并生效，然后使用“复制扫描”工具将此线条复制四次，线间距需大于光斑直径。在对每种凝胶标准校准空白样和方法空白样重复此操作后，沿待分析凝胶样品矩形区域的上边缘绘制一条直线，并复制该直线以生成整个样品区域的平行线列，线间距设置为300至400微米，如示例所示。确认每条线的起点和终点均已在凝胶表面正确聚焦，然后单击“分析批次”以在电感耦合等离子体质谱仪上启动样品序列分析。在激光能量窗口中单击发射以重新充电激光头。单击运行以打开实验运行窗口，并仅选择选定的模式。将冲洗延迟设置为20至30秒。在扫描过程中选择启用的激光选项，并将激光预热时间设置为10秒。然后点击运行和确定，开始线扫描分析，并实时监测电感耦合等离子体质谱仪上每种同位素的原始信号强度（单位：每秒计数）。每次扫描线的起始和结束均应包含一段气体空白。分析完成后，将每条烧蚀线的原始数据文件导入电子表格。原始数据表显示了每个同位素的电感耦合等离子体质谱读数（单位为每秒计数）以及对应的时间点（单位为秒）。将所有线条的数据并列列在不同的列中。根据所有在刻线消融前记录的气体空白值，计算每种同位素的平均气体空白值，并从每种同位素对应的原始强度中减去该平均气体空白值，以校正背景信号。为进行内部归一化，将每个数据点中每种同位素经气体空白校正后的信号强度除以碳13（内标）经气体空白校正后的信号强度，以校正消融物质数量的变化及仪器漂移。裁剪每条刻线消融开始前和结束后阶段的数据，以去除气体空白背景信号，并对数据表进行转置，得到一个网格矩阵，其中每一行对应一条消融线，每一列对应一个归一化后的同位素强度值。然后应用通过凝胶标准品分析获得的校准函数，并将校准后的数据矩阵保存为文本文件。为生成图像，将校准后的样品数据矩阵作为文本图像导入图像分析软件，应用纵横比校正因子和查找表，以可视化溶质图像中的化学梯度。调节图像色彩平衡以控制显示范围的下限和上限，添加校准标尺，并将溶质图像保存为TIF文件。使用系统复制命令复制固体图像，并将该图像粘贴至桌面出版软件中。随后，对固体图像与目标区域照片及其他溶质图像进行比例匹配、对齐和组合。将溶质图像与目标区域的照片对齐后可见，不同元素的亚毫米级二维固体通量分布随土壤结构和根系形态表现出显著差异。例如，在对生长于无碳酸盐土壤中并施加硝酸铵肥料的幼嫩荞麦根系进行分析时，亚毫米级溶质分布显示，在较老的根段区域，由于根系吸收，铝、磷和铁的通量降低；而在根尖区域，由于局部养分活化过程，镁、铝、磷、锰和铁的通量显著升高。在该分析中，锌、镉和铅在根际紧邻位置明显耗竭，表明耐金属的柳树物种Salix smithiana的根系在污染土壤中作为活性痕量金属的局部汇。在该分析中，使用结合单层平面光极与DGT阳离子结合凝胶的技术，实现了Salix smithiana根系周围活性痕量金属分布与pH分布的共定位分析。该方法组合表明，锰、铁、钴、镍、铜和铅的溶质通量增加与 pH 值降低约一个单位相关，提示 pH 值降低可诱导金属溶解。确保 DGT 工具与固体表面之间保持紧密且稳定的接触至关重要，以避免产生分析假象。如有疑问，应重复凝胶涂覆步骤。该方法可与其他基于扩散的固体成像技术（如平面光学传感器）结合使用，以同时评估植物元素吸收过程中涉及的多种参数。

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土壤中不稳定的无机植物养分与污染物的二维可视化与定量分析

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