小鼠海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元在不同脑片培养体系中的单细胞电穿孔
2020年10月6日
本文介绍了一种单细胞电穿孔技术方案，可用于在不同体外培养年龄的海马脑片中，向兴奋性和抑制性神经元递送基因。该方法可实现单个细胞中基因的精确且高效的表达，可用于研究细胞自主性及细胞间功能。
基因转染是神经生物学研究中的一种重要方法。我们的电穿孔技术能够将目的基因转染至海马体脑片器官型培养物中的中间神经元，且未检测到明显副作用。与其它单细胞转染方法相比，该方案的转染效率显著更高，同时仍具有成本较低、操作简便的优点。
该技术对于研究神经元的特定分子和生理功能（包括细胞自主机制和跨突触蛋白相互作用）的研究人员将非常有用。为准备用于电穿孔的脑片培养物，将感兴趣的培养插件转移至含有900 µL培养基的3厘米培养皿中，并将培养物置于台式二氧化碳培养箱内。接下来，用每插件1 mL的新鲜脑片培养基在3.5厘米培养皿中对新鲜培养插件进行预孵育，时间不少于30分钟，并用10%次氯酸钠溶液对电穿孔装置的管路消毒5分钟。
灌流结束后，先用无菌去离子水冲洗管路至少30分钟，然后再用含有0.001毫摩尔河豚毒素的滤菌人工脑脊液进行灌流。将电穿孔仪的脉冲参数设置为：振幅负五伏、方波脉冲、持续时间为500毫秒的脉冲串、频率50赫兹、脉冲宽度500微秒。用五微升含质粒的细胞内液填充玻璃移液管，并轻轻弹动和轻敲管尖多次，以排除任何滞留的气泡。
使用解剖显微镜确认尖端未受损，并将移液器尖端牢固地安装到电极上。当尖端接触ACSF时，记录电穿孔仪显示的移液器电阻值。为分离切片培养物，用锋利的刀片切割培养插件膜，并使用尖头弯镊小心地将切片培养物转移至电穿孔室中。
然后用切片固定锚固定培养物的位置。对目标细胞进行电穿孔时，通过嘴部施加正压至移液管，并使用三维旋钮控制装置将移液管尖端移动至接近切片培养物表面。在显微镜下观察培养物，使移液管尖端接近目标细胞，持续施加正压，直至细胞表面形成凹陷。
观察到凹陷后，迅速通过嘴部施加轻微的负压，使移液管尖端与细胞膜之间形成松散的密封。此时细胞膜会略微进入移液管内。应观察到移液管初始电阻约为原来的2.5倍，表现为扬声器发出的音调升高。
迅速重新施加正压，使凹陷重新形成。随后立即重复至少两次上述压力循环，中间不要停顿。最后一次压力脉冲后，保持负压一秒钟。
当扬声器发出的声音音调达到稳定的最高点时，使用脚踏开关快速脉冲电穿孔仪。电穿孔后，轻轻将移液管从细胞撤回约100微米，期间不施加压力，然后重新施加正压，确认阻值与接近下一个细胞前的基线读数相近。当所有目标细胞完成电穿孔后，将脑片培养物转移至已准备好的新鲜培养插件之一，并将插件置于35摄氏度环境下培养，最长可培养三天。
在此代表性实验中，将EGFP转染至体外脑片培养不同时间（7天、14天和21天）的海马CA1区的5至20个锥体神经元中。在海马CA1区，小清蛋白和囊泡型谷氨酸转运蛋白3型中间神经元也可成功进行电穿孔转染。有趣的是，转染效率不受体外脑片培养天数的显著影响，且与CA1区锥体神经元中观察到的转染效率无差异。
神经元非常脆弱。在接近细胞、进行压力循环以及回撤移液管尖端时，必须格外小心和轻柔，以免造成严重损伤。电穿孔后，细胞可进行各种实验分析，包括电生理学和成像。
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概述
本文介绍了一种用于器官型海马脑片培养中兴奋性和抑制性神经元单细胞电穿孔的实验方案，可实现基因递送。该技术能够精确控制基因表达，有助于研究不同发育阶段的细胞自主性机制以及细胞间相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因转染
- 电生理学
背景
- 基因转染对于神经生物学研究至关重要。
- 电穿孔技术具有较高的转染效率且副作用极小。
- 与其他技术相比，该方法相对简单且成本较低。
- 理解神经元中的分子和生理功能是神经生物学的核心内容。
研究目的
- 建立一种在神经元群体中转染基因的有效方法。
- 研究兴奋性和抑制性神经元中的特定分子功能与机制。
- 评估不同年龄的脑片培养中转染效率。
使用的方法
- 对海马脑片组织培养物进行了电穿孔处理。
- 实验中使用的主要生物模型为锥体神经元和中间神经元。
- 在不同培养时间（体外培养7、14和21天）的脑片中评估了转染效果。
- 详细步骤包括准备工作、移液技术以及电阻变化的监测。
- 通过精细操作，最大限度减少了实验过程中对细胞的损伤。
主要结果
- 在靶向神经元中实现了高效的基因转染，且不同年龄的脑片培养之间无显著差异。
- 电穿孔未对细胞活力产生不利影响，转染后仍维持了细胞完整性。
- 该方法可实现对神经元生理反应及潜在相互作用机制的深入研究。
- 还成功实现了对pars区及囊泡型谷氨酸转运体3型中间神经元的转染。
结论
- 本研究展示了一种在神经元培养物中进行基因转染的稳健方案，增强了神经生物学领域的研究能力。
- 该方法为深入探究神经元机制及细胞间功能奠定了基础。
- 理解这些过程对于揭示神经元可塑性及潜在的治疗应用至关重要。
常见问题
行业重要性概述
在海马脑片器官型培养物中进行单细胞电穿孔，可实现兴奋性和抑制性神经元中精确的基因递送，支持神经科学发现中的靶点验证和机制去风险化。该方法在不同发育阶段均具有高转染效率（约80%），可用于疾病相关神经元系统中通路研究的稳定表型筛选和检测方法开发。通过在疾病相关的神经元系统中实现可重复、定量的基因表达研究，该技术可降低早期靶点假设验证中的生物学不确定性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在海马体兴奋性神经元及特定类别的抑制性神经元中验证治疗假说。
- 科学价值：通过将基因表达与完整微环路中的生理读数关联，支持功能靶点的验证。
- 操作价值：实现高效转染，且无明显副作用，降低实验变异性。
- 操作价值：适用于不同培养时间的脑片（体外培养 7–21 天），可用于靶点作用的时间过程研究。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为后续的电生理学和成像分析制备经过验证的神经元系统。
- 科学价值：提供关于基因功能和蛋白质相互作用的定量、单细胞分辨率数据。
- 操作价值：使用标准的电生理学设备，可实现与现有工作流程的可扩展整合。
- 操作价值：在长期培养过程中维持转染效率，支持纵向筛选实验的开展。
转化与临床前研究
- 科学价值：提供与疾病相关的海马神经环路，用于在病理生理学背景下研究靶点机制。
- 科学价值：可评估跨突触蛋白相互作用及细胞自主性机制。
- 操作价值：通过维持转染后神经元的健康状态，促进从发现到临床前验证的连续性研究。
- 操作价值：在原代神经元培养中实现可靠且可重复的基因递送，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，可在化合物筛选前实现作用机制层面的风险消除。
- 发现生物学：支持在海马神经元群体中进行假设检验和通路解析。
- 筛选：提供即用型检测系统，具有可重复的转染效果和定量输出，用于化合物评估。
- 分析：实现基于电阻的监测和电生理信号读取，以关联基因表达与功能表型。
- 转化研究：通过在脑片组织切片中进行稳定转染，将基因功能研究与临床前研究连续性相连接。
- 企业级复用：利用现有的电生理基础设施，使该方法成为神经元靶点验证的可重复使用平台。
运营与企业影响
- 科学价值：通过高效、低毒性的原代神经元基因递送，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过一致的脉冲参数和压力循环方案，实现标准化与可重复性。
- 战略价值：减少神经元靶点结合中的机制性模糊，从而做出更优的“继续/终止”决策。
- 组合影响：通过在不同神经元类型及发育阶段中对基因功能进行可靠评估，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备电生理学和微移液管操作的专业知识，以实现单细胞靶向。
- 依赖玻璃电极、电穿孔仪以及含河豚毒素的无菌人工脑脊液（ACSF），以维持神经元活性。
- 需在不同操作者之间标准化压力脉冲序列和电阻监测流程。
- 适应性考虑因素包括针对不同神经元类型或基因大小调整质粒浓度和脉冲宽度。
- 实际限制：神经元较为脆弱，要求操作极为精细，以避免在压力循环过程中发生膜破裂。
