Name: 体外楔形切片准备模拟在Vivvo神经元电路连接 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 了解改良楔形脑片制备技术，用于保留完整突触前连接并模拟在体神经环路活动。该方法结合膜片钳记录与药理学手段，为听觉神经环路中的突触传递和神经元可塑性研究提供高分辨率电生理平台。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）院内研究项目资助，项目编号Z01 DC000091（CJCW）。

所有实验程序均经国家神经疾病和中风研究所/国家耳聋和其他沟通障碍研究所动物护理和使用委员会批准。
1. 实验准备
注意：关于脑片制备的细节，包括切片液、切片温度、脑片孵育温度及装置等，均针对本实验中进行的脑干制备条件而设定。脑片孵育的具体条件可根据各实验室的经验进行调整。
<ol>
	<li>准备用于膜片钳的内液。
	<ol>
		<li>配制电压钳制溶液，其成分（单位为 mM）如下：76 Cs-甲烷磺酸盐、56 CsCl、1 MgCl2、1 CaCl2、10 HEPES、10 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、5 Na2-磷酸肌酸、5 QX-314 和 0.01 Alexa Fluor-488 肼。用 CsOH 将 pH 值调节至 7.2。</li>
		<li>配制电流钳制溶液，其成分（单位为 mM）如下：125 K-葡萄糖酸盐、5 KCl、1 MgCl2、0.1 CaCl2、10 HEPES、1 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、1 Na2-磷酸肌酸和 0.01 Alexa Fluor-488 肼。用 KOH 将 pH 值调节至 7.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将 4 g 琼脂加入 100 mL 热水（接近沸腾）中，配制 100 mL 的 4% 琼脂溶液。置于加热磁力搅拌器上保持温度，并持续搅拌至完全溶解。将溶液倒入直径 100 mm 的塑料培养皿中，深度约为 1 cm，静置冷却。冷藏保存，待用时取出。</li>
	<li>配制 1 L 人工脑脊液（ACSF），其成分（单位为 mM）如下：124 NaCl、1.2 CaCl2、1.3 MgSO4、5 KCl、26 NaHCO3、1.25 KH2PO4 和 10 葡萄糖。用碳合气（5% CO2 / 95% O2）通气至少 10 分钟，必要时用 1 M NaOH 将最终 pH 值调节至 7.4。实验全程持续用碳合气通气，以维持溶液的氧合状态和 pH 值。</li>
	<li>在 ACSF 中加入 1 mM 犬尿酸，配制 200 mL 切片溶液。将溶液置于超声水浴中处理 10 分钟，直至犬尿酸完全溶解。持续用碳合气通气，并将溶液置于冰上。
	 
	注意：操作犬尿酸时应佩戴适当个人防护装备。</li>
	<li>按照制造商说明，将合适的刀片安装至振动切片机上。通过在切片室周围放置冰块，使其冷却。</li>
</ol>
2. 保留完整听觉神经根以进行刺激的脑组织摘除
注意：本实验所用小鼠通过将背景为 C57BL/6J 的 ChAT-IRES-Cre 转基因小鼠与 tdTomato 报告基因小鼠（Ai14）杂交获得。用于组织学和电生理实验的小鼠为听力开始后（P14-P23）的小鼠，相当于小鼠出生后约 P12 阶段。既往研究已证实，在该小鼠品系中，斜方体腹侧核（VNTB）表达 tdTomato 的神经元即为 MOC 神经元57。
<ol>
	<li>采用机构批准的程序对动物实施安乐死（例如，CO2 窒息法），并进行断头。</li>
	<li>使用剃刀刀片沿颅骨中线从鼻部至颈后部切开皮肤，向后剥离皮肤以暴露颅骨。</li>
	<li>使用小型剪刀从颅骨底部（靠近脊髓的尾端）沿中线开始剪开颅骨，并向前延伸至鼻部。</li>
	<li>在人字缝处，从颅骨中线向两侧耳部方向横向剪开颅骨。剥离颅骨以暴露脑组织。</li>
	<li>从脑的吻端开始，用小型实验铲或钝头镊子轻轻将脑组织从颅骨上抬起。剪断视神经，并继续轻柔地向后分离脑组织，暴露其腹侧面。</li>
	<li>用精细镊子在脑干腹侧面附近夹断三叉神经。 
	注意：操作需谨慎，因前庭蜗神经紧邻其下方，需保持完整以便后续刺激。</li>
	<li>将制备好的标本置于盛有冷切片液的玻璃培养皿中，将培养皿放置于解剖显微镜下，并用碳氧混合气（carbogen）轻轻通气。</li>
	<li>在靠近脑干处修剪面神经，暴露前庭蜗神经。</li>
	<li>使用精细镊子，将镊尖尽可能深入前庭蜗神经穿出颅骨的孔道内，夹断神经，使神经根仍附着于脑干。在另一侧重复此操作。</li>
	<li>当两侧神经根均游离后，清除脑桥附近腹侧面、靠近斜方体区域的脑膜和血管组织。</li>
	<li>通过夹断残留的脑神经和结缔组织，将脑组织完全从颅骨中分离，若可能，应尽量保留脊髓的完整性。</li>
</ol>
3. 将脑组织固定并安装到载片（磁性圆盘）上
<ol>
	<li>通过在视交叉水平处修整脑组织，制备用于固定到切片台表面的脑样本。
	<ol>
		<li>将脑组织腹面朝上，使用钝头工具轻轻固定脊髓，以防止在下一步操作中脑组织发生倾斜。</li>
		<li>在视交叉水平，使用张开的镊子插入脑组织直至培养皿底部，以创建修整平面。镊子插入角度约为垂直方向倾斜20˚，使镊尖从视交叉后方的脑背侧表面穿出。</li>
		<li>沿镊子边缘用剃刀刀片进行切割。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脑组织粘附至切片台表面。
	<ol>
		<li>准备一小块约1 cm3的4%琼脂块，用于支撑脑组织。</li>
		<li>在切片台上滴加少量胶水，并将其涂抹成矩形区域，以便同时固定脑组织和琼脂块。</li>
		<li>用镊子小心提起脑组织，用纸巾边缘轻轻吸去多余液体。将已修整的切面贴合于胶水上，确保在切片时腹面朝向刀片。</li>
		<li>轻轻将琼脂块紧贴于脑组织背侧表面，以在切片过程中提供支撑，并确保脑组织位置正确（即角度合适）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 切割脑组织以制备楔形脑片
注意：使用振动切片机制备脑片，使耳蜗神经根位于较厚的一侧，而内侧橄榄耳蜗（MOC）神经元和斜方体主核（MNTB）位于较薄的一侧。
<ol>
	<li>将附有脑组织的磁性圆盘放置在切片台基座上，并将其放入切片室中，使脑的腹侧朝向刀片。</li>
	<li>向切片室中加入冰冷的切片液，并用碳合气（carbogen）持续通气。</li>
	<li>将刀片降入溶液中，从目标区域尾侧开始切片，以确保切片对称。若切片显示不对称，可轻微倾斜切片台以获得对称性。 
	注意：刀片移动速度在 0.05–0.10 mm/s 范围内可有效切出健康的切片，具体速度可能因动物年龄和脑区不同而有所调整。</li>
	<li>当切片对称后，将切片台向一侧移动约 15˚（相当于切片台基座上约 3 个同心环的距离）。 
	注意：移动切片台时应远离需要在切片中保留的听觉神经根。</li>
	<li>继续小心切片，直至听觉神经根接近一侧表面，而面神经可在另一侧表面清晰可见。</li>
	<li>将切片台回转 15˚ 至原始位置。</li>
	<li>将刀片移离组织，旋转切片台基座 90°，使薄侧的外侧边缘正对刀片。将刀片下降数百微米，然后缓慢靠近组织边缘。重复此操作，直至刀片接触外侧边缘。随后将刀片降至所需薄侧厚度，此处额外下降 200 微米。 
	注意：理想情况下，在准备进行膜片钳记录的一侧，斜切片在腹侧斜方体核（VNTB）水平的厚度约为 300 µm。</li>
	<li>将刀片移离组织，再将切片台基座旋转回原位，使腹侧重新朝向刀片。</li>
	<li>进行切割，以确定楔形切片的头端表面。将切片转移到一片界面滤纸（1 cm2）上，尾端朝下。随后将切片转移至孵育室或其他合适的孵育装置中恢复 30 分钟（35 °C）。 
	注意：在切片头端表面的两个半球上均应可见面神经（见 图 1B）。</li>
</ol>
5. 电生理学装置设置与记录
<ol>
	<li>将楔形脑片放入记录室中，并使用网格固定器或稳定系统固定脑片。以持续灌流方式以7–10 mL/min的流速向组织灌注经碳合气饱和的温热人工脑脊液（ACSF，35 °C）。</li>
	<li>在斜方体内侧核（VNTB）中，使用561 nm发射滤光片进行落射荧光观察，识别基因标记的MOC神经元，用于膜片钳记录。若无合适可记录细胞，可翻转脑片。</li>
	<li>使用微分干涉差（DIC）光学系统，聚焦于脑片较厚一侧的听神经根，并使用显微操作器将双极钨刺激电极移至听神经根处，轻柔插入组织表面。 
	注意：其他实验室在听神经刺激实验中曾使用过吸吮电极。若适用于特定实验条件，也可采用Theta玻璃电极或光学刺激方法。</li>
	<li>将视野移回VNTB区域，选择一个MOC神经元作为膜片钳电生理记录的目标细胞。</li>
	<li>使用适合实验设计的内液填充记录电极。</li>
	<li>对MOC神经元进行全细胞膜片钳记录。根据需要补偿膜电容和串联电阻。</li>
	<li>调节听神经根的电刺激强度，以在MOC神经元中获得稳定的突触后反应。 
	注意：可能需要调整刺激电极的位置。</li>
	<li>运行适当的刺激程序，以观察MOC神经元中诱发的突触电流（电压钳）或动作电位模式（电流钳）。 
	注意：楔形脑片制备方法可与任何常规膜片钳技术联用，例如松散封接记录、药理学干预、光遗传学、钙成像、神经递质解笼锁等。</li>
</ol>
6. 脑干核团的组织学确认
注意：此步骤采用焦油紫染色法，在固定的重新切片的楔形切片上进行。该方法可用于观察切片中包含的细胞核。
<ol>
	<li>制备楔形切片后，将切片浸入固定液（4% PFA 的 PBS 溶液）中过夜。随后在摇床上用 PBS 室温漂洗 3 次，每次 10 分钟，再将切片置于含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 过夜以进行冷冻保护。</li>
	<li>在冷冻切片机上重新切片（40–70 μm），并将连续切片收集至24孔板中的磷酸盐缓冲液（PBS）内。</li>
	<li>将切片贴附于明胶包被的载玻片上，完全干燥。将载玻片放入切片架中。</li>
	<li>配制焦油紫溶液
	<ol>
		<li>将5 g乙酸克里西蓝与500 mL去离子水混合，配制1%乙酸克里西蓝溶液2O</li>
		<li>首先配制90 mL溶液A（540 mL冰醋酸 + 89.46 mL去离子水），用于制备乙酸盐缓冲液。2O) 和10 mL 溶液B（136 mg 醋酸钠溶于10 mL dH2O) 将溶液A与溶液B混合，得到乙酸盐缓冲液。</li>
		<li>将1%醋酸克里西尔紫与醋酸缓冲液按1:1比例混合，得到含0.5%醋酸克里西尔紫的醋酸缓冲液。使用前过滤。</li>
		<li>通过将100%乙醇与适量去离子水混合，配制95%和70%乙醇2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行焦油紫染色实验。将切片架依次移入各溶液容器中，在容器间用纸巾轻拍以去除多余液体：二甲苯 – 5 分钟；95% 乙醇 – 3 分钟；70% 乙醇 – 3 分钟；去离子水20 – 3 分钟；0.5% 焦宁蓝溶液 – 8–14 分钟，频繁观察，直至细胞核染成深紫色；去离子水2O – 3 分钟；70% 乙醇 – 3 分钟；95% 乙醇 – 1–2 分钟；100% 乙醇 – 载玻片浸入两次；二甲苯 – 5 分钟；二甲苯 – 25 分钟，直至进行封片。 
	警告：二甲苯仅可在通风橱中使用。</li>
	<li>一次从二甲苯中取出一张载玻片，并立即使用封片剂加盖盖玻片。让封片剂干燥（过夜）。</li>
	<li>图像切片。</li>
</ol>
7. 活体未固定组织中用于轴突顺行示踪的生物胞素标记
<ol>
	<li>按上述步骤（步骤 2-4）制备楔形切片。</li>
	<li>将切片转移至界面滤纸（约 1 cm2）。在解剖显微镜下，于切片较厚的一侧定位耳蜗神经核（CN）。</li>
	<li>用镊子卷起一张滤纸的角，小心吸除切片周围多余的 ACSF，以防止生物胞素扩散至切片其他区域，避免其被 CN 以外的细胞摄取。</li>
	<li>使用精细镊子选取少量生物胞素晶体，将其置于 CN 表面。轻轻按压晶体，使其与神经元充分接触，促进其进入胞体并被摄取。重复此步骤，以覆盖目标区域，本实验中为目标区域内的 T-星状细胞和巨听觉细胞（GBC）所在的 CN 区域。</li>
	<li>将切片放入孵育 chamber 中，在 35 °C 下孵育 2–4 小时，以允许生物胞素被摄取并运输。孵育结束后，用 ACSF 冲洗切片，去除残留的生物胞素颗粒。</li>
	<li>将切片置于固定液（含 4% 多聚甲醛的 PBS）中过夜固定，随后用 PBS 漂洗 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>将切片在含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中 4 °C 下过夜进行冷冻保护，直至切片沉底。</li>
	<li>使用冷冻切片机将组织重新切成 70–100 mm 的横切面。</li>
	<li>采用标准免疫组织化学方法，使用荧光标记的链霉亲和素对组织进行处理。 
	注意：若有助于标记突触前胞体、轴突、受体或其他对环路可视化重要的突触分子，可在切片上同时进行额外的免疫组织化学染色（即，一抗步骤不应影响生物胞素的二次显像）。</li>
	<li>对组织进行成像。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的切片方法称为楔形切片，该方法在保持突触前神经元环路完整的同时，便于利用脑片进行神经元功能分析。为最大限度地提高制备样本在环路分析中的可用性，初始阶段的多个步骤需格外谨慎。应通过组织学检查确认楔形切片的尺寸，这是验证突触前核团及其轴突投射是否均包含在所制备的楔形切片内的关键步骤。如果轴突投射被切断或仅有少量轴突到达目标核团，则可能需要调整切片几何形状。更普遍而言，振动切片机对楔形切片的最终切割步骤至关重要。优化的楔形切片制备需要一致使用振动切片机的配置，包括使用载物台基座上的同心圆标记，并结合已知脑部解剖标志对参数进行调整。在优化切片几何形状后，我们在18个楔形切片中的8个记录到耳蜗外侧丘系神经元（MOC神经元）中由电刺激听神经根所诱发的突触后电流（PSCs）。在我们之前的研究中，通过直接刺激MNTB轴突，可在约60%的MOC神经元中诱发抑制性PSCs57，这表明鉴于输入通路较长且需激活多突触环路，本研究的成功率仅略有下降。在制备切片时，建议略微增加切片厚度，因为较厚切片导致的可视性下降，优于因切片不完整或缺乏环路连接而无法使用的组织片段。只要切片能够置于记录显微镜物镜下，可被膜片...

在体内条件下，对神经环路功能的观察理想情况下应在保留天然感觉输入和反馈以及脑区之间完整连接的情况下进行。然而，在完整大脑中开展能够实现单细胞分辨率的神经环路功能研究，仍受限于技术上的挑战。尽管体内细胞外电生理记录或多光子成像方法可用于研究完整神经系统中的神经活动，但解析不同输入如何整合，或测量阈下突触输入仍然困难。体内全细胞记录可克服这些局限，但即使在易于接近的脑区，该技术的实施也颇具挑战性。对于位于大脑深部或空间分布弥散的特定神经元群体，单细胞分辨率实验的技术挑战进一步加剧，这些神经元通常需要借助遗传工具在体内定位细胞（例如，通道视紫红质的遗传表达结合光探针记录），或在记录位点标记后通过组织化学方法进行事后鉴定（例如，使用神经递质特异性标记物）。位于脑干腹侧表面附近且空间分布弥散的内侧橄榄耳蜗（MOC）神经元正面临上述种种限制1，使其在体内实验中极难被触及和研究。
脑片（厚度约100-500 µm）长期以来被用于研究脑内神经环路，包括听觉脑干环路，原因在于相互连接的神经元在物理上被保留在同一脑片内2,3,4,5,6,7,8,9。其他实验室已采用更厚的脑片（&#62;1 mm）来研究双侧输入如何在上橄榄复合体（SOC）区域（包括内侧上橄榄核）整合10,11。这些脑片制备时保留了听神经（AN）轴突的完整性，并通过电刺激诱发耳蜗核（CN）内的突触神经递质释放，以模拟第一级听觉神经元在响应声音时的活动。这类厚脑片的一个主要缺点是难以在全细胞膜片钳电生理记录（“膜片钳”）过程中清晰观察神经元。随着动物年龄增长，该区域大量轴突发生髓鞘化12,13,14,15，导致组织光学密度增加，即使在常规的薄脑片中也会遮蔽神经元。我们的目标是建立一种体外制备方法，既能更接近体内记录中的神经环路连接性，又能保留脑片中视觉引导的膜片钳电生理技术所具备的高通量和高分辨率记录能力。
本实验室研究听觉传出系统神经元的生理学特性，包括MOC神经元。这些胆碱能神经元通过调节耳蜗外毛细胞（OHCs）的活动，向耳蜗提供传出反馈16,17,18,19,20。先前的研究表明，这种调节在耳蜗增益控制21,22,23,24,25,26以及抗声损伤保护27,28,29,30,31,32,33中发挥重要作用。在小鼠中，MOC神经元弥散分布于脑干听觉通路中的斜方体腹侧核（VNTB）1。我们课题组利用ChAT-IRES-Cre小鼠与tdTomato报告基因小鼠杂交，结合落射荧光照明技术，在脑干切片中标记MOC神经元。我们发现，MOC神经元接受来自同侧斜方体中核（MNTB）的传入性抑制性输入，而MNTB本身则由对侧耳蜗核（CN）中的球状树突细胞（GBC）轴突兴奋34,35,36,37,38。此外，MOC神经元的兴奋性输入很可能来自对侧CN的T型星形细胞39,40,41。综上所述，这些研究表明MOC神经元同时接收来自同一只耳朵（对侧耳）的兴奋性和抑制性输入。然而，突触前神经元及其汇聚到MOC神经元上的轴突彼此之间的距离较远，难以在典型的冠状切片制备中保持完整。为了研究突触输入在MOC神经元上的整合如何影响其动作电位发放模式，并重点关注新近描述的抑制机制，我们建立了一种实验制备方法，能够在体外脑片实验的技术优势基础上，以尽可能接近生理真实的方式刺激单侧耳朵来源的多种MOC传入通路。
楔形切片是一种改良的厚切片制备方法，旨在研究耳蜗外毛细胞（MOC）神经元的环路整合（示意图见图1A）。在切片较厚的一侧，楔形结构包含听神经进入脑干后终止于耳蜗核（CN）的离断轴突（下文称为“听神经根”）。可通过电刺激听神经根诱发神经递质释放，并激活CN中完全完整的神经元突触42,43,44,45,46。这种刺激方式在环路分析中具有多个优势。首先，与直接刺激向MOC神经元提供传入输入的T型星形细胞和GBC轴突不同，我们选择刺激听神经（AN），从而激活CN中丰富的固有环路。这些环路可调节CN神经元向大脑多个靶区（包括MOC神经元）的输出46,47,48,49,50,51。其次，通过听神经至耳蜗核的多突触传入通路对MOC神经元上游环路进行激活，可实现更接近生理状态的激活时序，并允许这些突触在听觉刺激过程中如体内状态一般发生可塑性变化。第三，我们可以调节刺激模式以模拟听神经的自然活动。最后，楔形切片中MOC神经元的单耳兴奋性和抑制性传入通路均保持完整，可通过膜片钳电生理技术精确测量这些输入信号在MOC神经元上的整合。总体而言，与传统的脑切片制备相比，该激活方案为MOC神经元提供了更为完整的神经环路。此外，这种脑干楔形切片还可用于研究其他接受同侧MNTB抑制性输入的听觉区域，包括外侧上橄榄核、上橄榄核和内侧上橄榄核10,11,52,53,54,55,56。除本研究特定的制备方法外，该切片技术还可用于或经修改后用于评估其他神经系统，其优势在于可维持长距离传入连接的完整性，并改善神经元的可视化效果，适用于多种单细胞分辨率的电生理或成像技术。
本方案需要使用可倾斜约15°的振动切片机载物台或平台。此处我们采用一种市售的两件式磁性载物台，其中“载物台”为底部呈弧形的金属圆盘，放置于凹形的磁性“载物台底座”中。通过移动载物台可调节切片角度。载物台底座上的同心圆可用于重复、准确地估算角度。将载物台和载物台底座置于切片室中，磁性载物台底座亦可在其中旋转。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;实验准备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂，粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td>用于振动切片过程中稳定脑组织的4%琼脂块</td></tr><tr><td>AlexaFluor 肼 488</td><td>Invitrogen</td><td>A10436</td><td>用于内部溶液的荧光染料，以确认MOC神经元膜片钳制成功</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Geneses Scientific（Intramalls）</td><td>AV114</td><td>称量化学品</td></tr><tr><td>双面剃须刀片</td><td>Ted Pella</td><td>121-6</td><td>振动切片机切割刀片</td></tr><tr><td>犬尿喹啉酸（5g）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375-5G</td><td>用于在解剖和切片过程中降低神经元活性的ACSF添加剂，以改善组织健康状态，便于进行膜片钳实验</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>13-620-451</td><td>溶液pH测试仪</td></tr><tr><td>塑料培养皿 100 mm 直径 × 20 mm</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>12-556-002</td><td>4% 琼脂制备</td></tr><tr><td>搅拌加热板</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>11-500-150</td><td>4% 琼脂制备的加热</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;解剖与切片&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物胞素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261-250MG</td><td>用于轴突示踪的化学物质（与Streptavidin 488偶联）</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Amscope</td><td>SM-1BN</td><td>用于脑组织取出过程中的精细解剖</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11252-20</td><td>精细镊子解剖工具</td></tr><tr><td>经济型镊子 #3</td><td>WPI</td><td>501976</td><td>镊子解剖工具</td></tr><tr><td>玻璃培养皿 150 mm 直径 × 15 mm 高</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>08-747E</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>界面滤膜（203 × 254 mm PCTE 膜，10 μm）</td><td>托马斯科学公司</td><td>1220823</td><td>切片孵育/生物胞素应用</td></tr><tr><td>Leica VT1200S 振动切片机</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>用于楔形脑片切片的振动切片机</td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-6872</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>单刃碳素钢刀片</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>12-640</td><td>解剖用剃刀刀片</td></tr><tr><td>样本圆盘，定位</td><td>徕卡</td><td>14048142068</td><td>用于可重复倾斜的专用振动切片机载物台</td></tr><tr><td>药匙</td><td>FisherSci</td><td>14-375-10</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Newegg</td><td>15187</td><td>用于将组织粘附至振动切片机载物台</td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;电生理学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1R 直立式共聚焦显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td>电生理学与成像显微镜，可使用任何兼容电生理学的显微镜</td></tr><tr><td>电极硼硅酸盐玻璃管，带细丝，外径1.5 mm，内径1.1 mm，长10 cm</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10</td><td>膜片钳电极玻璃管</td></tr><tr><td>电极填充液 MicroFil</td><td>WPI</td><td>CMF20G</td><td>膜片电极移液管填充器</td></tr><tr><td>在线溶液加热器</td><td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td><td>SH-27B</td><td>切片灌流系统加热器</td></tr><tr><td>多微操作器系统</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200 配 MP285</td><td>用于膜片钳和刺激电极定位的微操作器</td></tr><tr><td>P-1000水平玻璃微电极拉制仪</td><td>Sutter 仪器</td><td>FG-P1000</td><td>膜片钳移液器拉制仪</td></tr><tr><td>膜片钳放大器和软件</td><td>HEKA</td><td>EPC-10 / Patchmaster Next</td><td>可以是任意放大器/软件</td></tr><tr><td>记录室</td><td>华纳仪器</td><td>RC26G</td><td>切片 &quot;浴液&quot; 记录期间</td></tr><tr><td>记录室竖琴架</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>在电生理记录过程中稳定脑片</td></tr><tr><td>切片孵育室</td><td>定制构建</td><td></td><td>切片后恢复期间用于切片的加热且供氧的孵育室</td></tr><tr><td>刺激隔离单元</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>电生理学用刺激隔离单元</td></tr><tr><td>60毫升注射器</td><td>Fischer Scientific（Intramalls）</td><td>14-820-11</td><td>电生理灌流液处理</td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instruments（GSAdvantage）</td><td>TC-324C</td><td>切片灌流系统温度控制器</td></tr><tr><td>外径1/8、内径1/16的导管</td><td>Fischer Scientific（Intramalls）</td><td>14-171-129</td><td>电生理灌流液处理</td></tr><tr><td>钨同心双极微电极</td><td>WPI</td><td>TM33CCINS</td><td>电生理学刺激电极</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;组织学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>12-556006</td><td>组织学切片制备与免疫染色</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 链霉亲和素</td><td>杰克逊免疫实验室</td><td>016-540-084</td><td>用于生物胞素显色的二抗</td></tr><tr><td>康宁轨道摇床</td><td>Sigma</td><td>CLS6780FP</td><td>免疫组织化学振荡器</td></tr><tr><td>乙酸焦油紫</td><td>Sigma Aldrich（Intramalls）</td><td>C5042-10G</td><td>组织学细胞染色</td></tr><tr><td>一次性切片刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-210-052</td><td>滑动式切片机刀片</td></tr><tr><td>Nalgene 4 mm 醋酸纤维素滤器注射器，0.2 μm</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>09-740-34A</td><td>用于向记录电极填充内液的注射器滤器</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>免疫组织化学荧光封片剂</td></tr><tr><td>带支架的载玻片染色缸</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>08-812</td><td>焦油紫染色缸</td></tr><tr><td>Microm HM450 推拉式切片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>910020</td><td>用于组织学的冷冻切片机</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片：50 mm × 24 mm 矩形</td><td>Fisher Scientific（Intramalls）</td><td>12-543D</td><td>组织化学载玻片盖玻片</td></tr><tr><td>Permount封片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>焦宁蓝切片封片介质</td></tr><tr><td>Superfrost 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034980</td><td>组织学切片</td></tr></tbody></table>

体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

体外脑片电生理技术能够以精确的电学和时间分辨率测量单个细胞的活动。为了便于使用膜片钳或成像技术对神经元进行观察和操作，脑片必须足够薄；然而，体外对脑环路的研究也因此仅限于急性脑片中实际存在的结构。为了在保留体外脑片实验优势的同时，保存更大范围的突触前核团，我们开发了一种新型脑片制备方法。这种“楔形脑片”专为膜片钳电生理记录而设计，用于表征脑干中介橄榄耳蜗（MOC）神经元所接收的多种单耳声驱动输入。这些MOC神经元的主要传入兴奋性和抑制性输入，来源于对侧耳及其相应耳蜗核（CN）中被刺激激活的神经元。该楔形脑片在某一侧半球的外侧边缘处沿前后方向最厚，并向对侧半球的外侧边缘逐渐变薄。在较厚的一侧，脑片包含了将听觉刺激信息传入大脑的听神经根、耳蜗核内部环路，以及汇聚到对侧MOC神经元上的双突触兴奋性传入通路和三突触抑制性传入通路。记录则在脑片较薄的一侧进行，此处的MOC神经元可通过微分干涉差（DIC）光学系统清晰观察，适用于常规膜片钳实验。通过在听神经进入听觉脑干的部位施加直接刺激，可引发耳蜗核内部环路的活动以及MOC神经元上游突触的突触可塑性变化。利用该技术，可在脑片条件下尽可能真实地模拟体内环路的激活状态。这种楔形脑片制备方法也可应用于其他脑环路研究，尤其适用于那些需要在保留上游连接性和长程输入的同时，结合体外脑片生理学技术优势的研究场景。

楔形切片的组织学检查 
为了研究听觉脑干神经元的功能，我们设计的楔形切片包含听神经根以及与记录目标MOC神经元对侧的耳蜗核（示例切片见图1B）。初步组织学检查对于确认切片是否包含激活神经回路所必需的核团以及轴突投射是否完整至关重要。耳蜗核内的两种细胞类型向MOC神经元传递声音信息。T型星形细胞被认为为MOC神经元提供兴奋性输入39,40,41,58。球形树突细胞（GBC）通过特化的Held氏大突触，兴奋对侧半球的斜方体旁核（MNTB）神经元34,36,37,<sup class=...

整合神经元对多种突触输入的响应，最佳方法是采用一种能够保留所有突触前核团、以维持自然时序和环路可塑性的实验体系；然而，脑片通常会切断大量连接。我们开发了一种改良的脑片制备方法，可在保持体外实验可行性的同时，模拟体内环路的活动状态。

体外脑片电生理技术能够以精确的电学和时间分辨率测量单个细胞的活动。脑片必须相对...

脑片实验能够以高电学和时间分辨率研究神经元功能，但这类脑片通常会切断大量突触前连接。楔形脑片则可保留更为完整的突触前环路。这种改良的脑片在维持更接近体内神经元环路完整性的同时，兼具体外实验的优势，例如可视化引导的膜片钳记录、药理学干预以及活动成像。可以根据神经回路中神经元在图谱中的位置来估算精确的楔形切片几何形状，但突触前结构和轴突的完整性需通过组织学方法来确定。首先使用剃刀刀片从鼻部至颈部后方沿颅骨中线切开皮肤。将皮肤向两侧剥离以暴露颅骨，然后从颅骨基部开始，朝向鼻部方向，使用小型剪刀沿中线在颅骨上进行剪切切口。在人字缝处，从正中线向两侧耳部方向在颅骨上做切口，以便剥离颅骨并暴露脑组织。从脑的前端开始，使用小型实验铲轻轻抬起脑组织，以便切断视神经。继续轻柔地向后分离脑组织，暴露其腹侧面，并用精细镊子小心夹住脑干腹侧面附近的三叉神经，将其剪断。将制备好的样本置于装有冷切片液的玻璃培养皿中，并将培养皿放在解剖显微镜下。在靠近脑干处修剪面神经，以暴露前庭蜗神经。用精细镊子将镊尖尽可能深入地推入前庭蜗神经穿出颅骨的孔道中。用镊子夹断两侧的神经，保留神经根与脑干相连。清除脑干腹侧近梯形体处的脑膜和血管。然后夹住剩余的脑神经和结缔组织，将脑完全从颅骨中分离，注意尽可能保留残余的脊髓。将脑组织腹面朝上放置，以钝器轻轻固定脊髓，从而稳定脑组织，为将其固定于载物台做准备。将张开的镊子以约20度角从脑组织上方插入，直至培养皿底部，使镊子尖端从视交叉后方的脑背侧穿出，然后沿镊子边缘用刀片进行切割。接下来，准备一块1立方厘米的4%琼脂块，并在载物台上涂抹一小滴胶水成矩形。使用镊子小心提起脑组织，并用纸巾边缘轻轻吸去多余液体。然后将切块的表面置于胶水上，使腹侧面朝向切片时的刀片方向，并轻轻将琼脂块推向背侧面作为支撑。为了获得楔形切片，使较厚的一侧包含耳蜗神经根，较薄的一侧包含内侧橄榄耳蜗神经元和斜方体的内侧核，将附着脑组织的磁盘放置于载物台夹持器上，并将夹持器放入振动切片机的切片室中，使脑组织的腹侧面朝向刀片。用冰冷的切片液填充切片室，并将刀片降至通有碳酰气的溶液中。从目标区域尾侧开始切片，以确保切片对称。然后将切片台向一侧旋转约15度。继续小心切片，直到一侧的听神经根接近表面，而另一侧的切片表面可见面神经。将载物台向后旋转15度，回到原始位置，并将刀片移离组织。将载物台底座旋转90度，使薄侧的侧缘朝向刀片，先将刀片下降数百微米，再缓慢将其移近组织边缘。将刀片略微回缩，调整至所需切片薄缘的厚度。将刀片从组织移开，反向旋转底座，使腹侧朝向底座。进行一次切割，以标记楔形切片的头端面，并将切片转移至一块1平方厘米的界面滤纸上，尾端面朝下。在切片的吻端表面，应能在两个半球均观察到面神经。随后将切片转移至35摄氏度的孵育箱中，恢复30分钟。为进行电生理分析而准备楔形切片时，将样本放入记录室中

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

体外楔形切片准备模拟在Vivvo神经元电路连接

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为了快速评估基因在大脑皮层发育过程中的功能，我们描述了涉及以下内容的方法 离体...

神经元形态发生研究方法 离体 胚胎小鼠大脑皮层中的RNAi电穿孔技术

本视频展示了在实验室环境中制备楔形脑片的过程。使用振动切片机，从小鼠脑组织中制备出不同厚度的楔形切片。该切片在一端较厚，包含听觉神经根，而与听觉相关的神经元则位于较薄的一端。...

制备用以观察听觉神经元的楔形脑切片

该视频介绍了在小鼠脑切片中对视网膜-外侧膝状体突触和皮层-外侧膝状体突触进行电生理记录的方法。包含背侧外侧膝状体核（dLGN）的脑切片被置于记录室中。刺激电极可放置于视束上，以刺激视网膜神经节细胞（RGCs）并研究视网膜-外侧膝状体突触；或放置于丘脑网状核，以刺激皮层神经元并研究皮层-外侧膝状体突触。刺激后，RGCs...

小鼠脑切片中视网膜丘脑和皮层丘脑突触的电生理学研究

本视频演示了一种在小鼠脑片切片中刺激听觉神经根并记录内侧耳蜗橄榄核神经元突触后电流的实验方案。...

小鼠脑楔形切片中听神经根刺激与突触后电流记录

本文介绍了一种利用脑片组织培养技术研究海马体出生后神经发生的实验方法。该方法可实现 体外...

用于研究出生后神经发生的器官型脑片培养

在急性脑切片中对突触连接的神经元进行膜片钳记录和同时的细胞内生物胞素填充，可实现其结构与功能特性的相关联分析。本方案的目的是描述从神经元微环路进行电生理记录及其后续形态学分析的关键技术步骤。...

利用成对膜片钳记录技术对急性脑切片中神经元微环路的电生理学与形态学特征进行表征

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In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

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急性小鼠脑切片以研究海马区自发性网络活动

我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

了解改良楔形脑片制备技术，用于保留完整突触前连接并模拟在体神经环路活动。该方法结合膜片钳记录与药理学手段，为听觉神经环路中的突触传递和神经元可塑性研究提供高分辨率电生理平台。

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