使用紫光激发的细胞通透性DNA结合染料分离小鼠生精细胞

这种从成年小鼠中分离精母细胞和精子细胞亚群的新型高效方法，可用于研究减数分裂和精子发生过程中潜在的分子机制。该方法采用一种低细胞毒性的DNA结合染料，具有宽广的激发光谱，适用于目前大多数常用的流式细胞分选仪（FACS）。该方法操作十分简便。

最具挑战性的环节是流式细胞术的设门，但详细的设门策略将有助于将该方案适配到其他细胞分选仪上。本实验操作将由 Satoshi Namekawa 实验室的研究助理 Yu-Han Yeh 演示。从一只八周龄雄性小鼠中取出两侧睾丸后，将组织置于含有两毫升冰上预冷的 PBS 的 60 毫米培养皿中，并去除白膜。

用镊子轻轻分离睾丸，使曲细精管略微散开。将曲细精管转移至100毫米培养皿中的一滴新鲜冰冷PBS液滴中。用镊子轻轻解开曲细精管，并如前所示，在另外三个PBS液滴中依次洗涤曲细精管。

最后一次洗涤后，将未缠绕的曲细精管放入一个15毫升离心管中，加入2毫升解离缓冲液，在37摄氏度下孵育20分钟。孵育结束后，使用1000微升移液器轻轻吹打组织20次，然后将离心管放回孵育箱中继续孵育6分钟。孵育结束后，再次吹打组织20次，然后将离心管放回孵育箱中。

三分钟后，轻轻吹打小管10次，或直至无可见组织块残留，然后加入10毫升FACS缓冲液终止消化。随后，使用额外的10毫升新鲜FACS缓冲液再洗涤一次，共离心两次，以去除精子及尽可能多的碎片。为进行流式细胞术分析染色，将细胞沉淀重悬于3毫升FACS缓冲液中。

将细胞悬液通过70微米的尼龙细胞滤网过滤至50毫升离心管中。计数后，取10%的细胞转移至冰上新的离心管中，作为未染色的阴性对照。将6微升DCV染液充分混入剩余的细胞悬液中。

在37摄氏度避光孵育30分钟，期间每10分钟轻轻振荡一次后，向细胞中加入5 µL DNase I。将细胞通过35 µm尼龙滤网过滤，收集至预冷的5 mL FACS管中。进行细胞流式分析时，在流式分析软件中新建实验，然后在工作表工具菜单下点击“新建密度图”，以创建前向散射面积与侧向散射面积的线性密度图。

单击“新建直方图”以创建对数刻度下的DCV蓝色直方图。然后单击“开始并记录”，以开始处理未染色样本。在样本运行过程中，单击“检测器和阈值设置”，调节前向散射和侧向散射的PMT电压，使未染色细胞位于前向与侧向散射图的量程范围内。

调整 jappy 通道的 PMT 电压，以在 DCV 蓝色直方图对数图的第一个十进制区间内定位 DCV 阴性群体的位置。然后，单击“停止”以卸载未染色样本。短暂涡旋并加载染色样本后，单击“下一个样本管”为此样本创建新的工作表。

设置流式细胞仪至少采集 1 × 10⁶ 个事件，然后点击“开始”并记录。接着，点击“新建密度图”，创建前向散射光高度（FSC-H）对前向散射光宽度（FSC-W）的密度图，以及DCV蓝光对DCV红光的密度图，均采用线性刻度。

在前向散射面积与侧向散射面积密度图上，使用多边形工具绘制一个名为“cells”的门，以包含大多数细胞并排除微小碎片。将此门应用于前向散射高度与前向散射宽度图，并使用矩形工具绘制单细胞门，以排除非单细胞。将单细胞门应用于DCV蓝色与DCV红色密度图，并调整比例以获取扩展的分布轮廓。

使用多边形工具绘制 DCV 门，以排除未染色细胞和侧群细胞，并将该门应用于线性刻度的 DCV 蓝色直方图。三个主要峰代表不同的 1C、2C 和 4C DNA 含量。创建第二个线性刻度下的 DCV 蓝色 vs DCV 红色密度图。

然后使用DCV门控反向选中图中的1C和4C细胞群。创建另一个DCV蓝色信号对DCV红色信号的线性密度图，并使用椭圆工具在1C细胞群上绘制门控。

使用多边形工具以连续曲线圈选 4C 群体。并在线性尺度上创建另一个 DCV 蓝色对 DCV 红色的密度图。使用多边形工具创建一个 4C 门。

在一幅新的前向散射与侧向散射点图中，使用椭圆工具创建粗线期、双线期以及细线期、合线期的精母细胞门控。当所有门控绘制完成后，在线性刻度上创建一个新的DCV蓝色对DCV红色的颜色点图，应用4C门控，以确保这三个群体在门控内呈连续排列。接下来，在线性刻度上创建一个新的前向散射面积对侧向散射面积的密度图，并选择细胞大小均一的群体作为纯圆形精子细胞群体。

分选后，经SYCP3和Gamma H2AX免疫荧光染色验证，分离得到的细线期、偶线期、粗线期和双线期精母细胞组分的代表性纯度通常在80%至90%之间。圆形精子细胞组分的纯度可通过DCV核染色结合Sp56与H1t染色进行确认，纯度通常也约为90%。分离细胞群体的存活率通常超过95%，单只成年小鼠获得的各细胞组分总产量通常足以满足多种下游分析需求。分选后的细胞可用于多种新一代测序分析，以更深入地研究精子发生过程中的基因表达与调控机制。