牛卵巢皮质组织培养

该方案可实现对卵巢微环境的体外深入研究，使用户能够确定卵泡的生长与发育，以及类固醇生成和免疫分子的丰度。该技术的一个优势在于能够直接评估卵巢微环境及新生卵泡的变化，并分析添加特定激素后所引起的独特相互作用。

该技术可用于研究多种导致卵泡发育停滞的生殖系统疾病，例如多囊卵巢综合征。由于我们能够在体外直接评估卵巢微环境，因此本实验操作将由我实验室的本科研究人员 Brooke Bell 演示。

使用带齿的颌钳固定卵巢，将其切成两半，并开始去除外层组织。确保切除的卵巢表面深度不超过一到两毫米，以免采集到髓质。用手术刀切割出三到四条薄的卵巢皮质条带，并将这些条带放入第三个盛有 PBS 的培养皿中。

使用手术刀片将组织条切割成大小为0.5至1立方毫米的小方块。在培养皿下方放置直尺，以确保所切组织块大小和厚度相近，从而获得一致的卵巢皮质组织块。使用弯头镊子在三个PBS以及含抗生素的培养皿之间转移卵巢皮质组织块，进行清洗。

将皮质组织块依次经过一系列LB-15洗涤，最后置于盛有LB-15的培养皿中。在皿盖上标记动物编号及卵巢侧别。每侧卵巢收集四块卵巢皮质组织，其中部分用于零天组织学固定，其余组织冻存以用于RNA纯化。

使用剩余的组织块进行培养。准备生物安全柜以进行最终的组织清洗和培养制备。在将物品放入生物安全柜之前，使用70%乙醇对其表面进行消毒。

将所有拟用于培养的卵巢皮质组织块转移至生物安全柜中，并在盛有LB-15的培养皿中再次清洗一次。每孔加入350微升Waymouth培养基至24孔细胞培养板中。用镊子将未包被的培养小室插入每个孔中，确保插入底部时无气泡产生。

将四块卵巢皮质组织小心轻柔地放置于每个插入物的网状膜上，避免刺穿网膜。将组织在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。每天更换卵巢皮质培养基，确保使用预热的Waymouth培养基。

换液时，用镊子轻轻将小室从孔中取出，收集培养的沃恩斯（Waymouth）培养基至 0.5 毫升离心管中。将小室放回孔中，并沿小室与孔壁之间的间隙加入 350 微升新鲜培养基。将组织培养收集的培养基在 -20 摄氏度保存。

培养七天后，使用带有相机和计算机成像软件的解剖显微镜对卵巢皮质组织块进行成像。每孔取两个卵巢皮质组织块，用Bouin's溶液固定用于组织学分析，并将剩余卵巢皮质组织块在液氮中速冻以提取RNA用于cDNA合成。对所有含组织的孔重复此步骤，然后收集第7天的培养基，于-20°C保存。

将卵巢皮质组织块浸入Bouin's溶液中约1.5小时，然后用70%乙醇洗涤三次，将组织保存在70%乙醇中，并每日更换溶液直至溶液不再呈黄色。采用苏木精-伊红染色法对原始卵泡、早期初级卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡进行染色。为评估卵泡发生情况，对培养前和培养后固定的卵巢皮质组织进行卵泡分期分析。

通过胶原沉积所确定的形态学差异可提示卵巢皮质是否存在纤维化，样本来源于阶梯式饲养或对照组小母牛。此处展示了对照组与阶梯式饲养小母牛之间，每单位卵巢皮质中嗜银苦味酸红染色阳性区域平均面积的比较。为评估类固醇激素产生的变化，每隔一天收集一次培养基，并将三天的样本混合后采用放射免疫分析法进行检测。

还测定了每只动物卵巢皮质培养组织在连续四天培养期间合并的单孔培养基中的类固醇代谢物和细胞因子产生情况。组织放置时间越长，越难操作，可能需要练习进行精确切割。

该技术用于研究信号转导通路对过量类固醇生成的挽救作用，以确定过量类固醇对细胞因子和趋化因子产生的影响，并确定其对卵巢组织内卵泡发育进程或停滞的影响。