小鼠结膜共生菌的分离与鉴定

该方法可鉴定存活的眼部结膜微生物，由于眼部环境具有较强的抑制性，此类微生物的鉴定具有挑战性。该方法有助于解答眼部微生物组是否存在，以及细菌在眼病中的定植情况如何变化。与能够检测存活和非存活微生物的DNA测序技术相比，该方法仅鉴定存活的微生物，从而更清晰地揭示眼部共生微生物群落的真实组成。

研究表明，一些难以诊断的眼部疾病，例如非自身免疫性和自身免疫性干眼症，具有独特的眼表细菌存在特征。该方法可用于诊断具有特异性微生物特征的眼部疾病。首先，根据需采样的小鼠数量，将适量的棉絮和棉签进行高压灭菌处理；然后剪取约0.5厘米长的棉絮片段，通过拉扯边缘将其分离成一层扁平、单层且多孔的结构，注意操作至棉絮即将散开前停止。

将棉签的一端轻轻夹住拉伸的棉絮，并在旋转牙签尖端的同时将其缠绕在其中一个尖头上。制备完成的采样棉签将在尖端处形成一层非常薄的棉层，棉层延伸至距离尖端约0.5至1厘米处。将棉签采样端朝下插入小烧杯中，盖上盖子后进行高压灭菌。

使用消毒剂清洁工作区域，以尽量减少污染，并将0.5毫升无菌脑心浸液（BHI）培养基分装至已标记的1.5毫升无菌微量离心管中。将管子盖好盖子后放入试管架中，并将试管架置于冰上。工作流程从左到右设置，起始于小鼠麻醉站，该区域包括装有实验小鼠的笼子、一个空的无菌笼子、室温麻醉剂、25号针头和1毫升注射器。

接下来，准备一个眼部拭子取样工作站，其中包含置于冰上的分装BHI培养基、无菌眼部拭子、润滑型滴眼液、生物危害废物容器、干净的纸巾和70%异丙醇喷雾剂。最后，设置接种工作站，配备室温下的血琼脂平板、10微升移液器、10微升无菌一次性吸头以及生物危害废弃物容器。通过轻捏小鼠后肢足垫确认其已充分麻醉。

若无活动，方可继续操作。一只手用于处理麻醉后的小鼠，另一只手用于处理眼拭子和培养物。将小鼠从笼中取出，放置于操作台面上，使其侧卧，暴露左眼。

用异丙醇喷洒戴手套的手，并用纸巾擦干。用专用的手取下标记好的BHI微量离心管管盖，并将管盖和管子一同放回架中。将棉拭子头部浸入BHI培养基中，然后在取出拭子的同时，将拭子头在管内壁旋转两次，以去除多余液体，随后完全取出拭子。

用一只手轻轻抓住小鼠颈部的皮肤以固定小鼠。另一只手将眼拭子的尖端置于左眼的内侧结膜区域。轻压眼球，并在下眼睑与眼球之间以擦窗方式来回移动拭子10次，保持恒定压力。

在不接触毛发的情况下，将拭子垂直于插入方向轻轻取出。将拭子带棉部分朝下，直接放入含有BHI培养基的已标记微量离心管中。向擦拭过的眼睛滴加一滴眼药水。

如有需要，可采集皮肤或毛发拭子作为对照样本，每次采样之间应适当消毒手套。操作完成后，将小鼠放回笼中。将拭子置于冰上静置10至15分钟，然后消毒戴着手套的双手，在培养基中旋转拭子尖端10圈，使其充分混匀。

通过将拭子尖端在试管内壁旋转五圈来撤出拭子，并将其丢弃至生物危害容器中。对每只小鼠重复此操作。将试管在37摄氏度下静置孵育1小时，以富集样本。

孵育期间，为每只小鼠眼拭子或对照拭子标记一个室温的TSA平板，并将其分为两半。从培养箱中取出增菌后的样品，置于冰上。短暂涡旋混匀样品，然后取10 µL样品滴加到TSA平板上，倾斜平板形成条带。

重复此步骤两次。在平板分界线的另一侧，用每份10微升的样品创建10个点样。将平板置于洁净的培养室中，于37°C分别孵育18小时、两天和四天，以防止琼脂平板干燥。

计数条带中的菌落。注意菌落形态，并计算形态相似分离株每拭子的菌落形成单位。观察条带中未捕获到独特微生物的点位。

为了便于观察，我们在中间和右侧的培养皿中密集接种了细菌。通常情况下，我们在眼拭子培养皿中观察到的细菌数量要少得多。需要注意的是，有时眼拭子可能无法分离出可培养的细菌。

图中显示了来自一只C57黑六小鼠的代表性眼拭子平板，其上具有形态各异的分离菌株。针对每种不同的分离菌株，统计了划线区域内的菌落数量，并计算和绘制了相对丰度。为进行微生物学表征，从各小鼠眼拭子平板上分别挑取细菌，制备主TSB平板。

当观察到菌落生长后，进行了额外的检测以对微生物进行特征分析或鉴定。使用主培养板提供足够的接种物以扩增相应的分离株。为鉴定分离株，将分离物划线接种于TSA平板，过夜培养后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。

此处展示的分离株被鉴定为嗜酸链球菌（Streptococcus acidominimus）和绿色气球菌（Aerococcus viridans）。从雄性和雌性C57黑六小鼠中分离出的共生微生物数量存在显著差异。从C57黑六N小鼠中分离出嗜酸链球菌（Streptococcus acidominimus）、绿色气球菌（Aerococcus viridans）、凝固酶阴性葡萄球菌以及大肠杆菌（E.coli）。

进行本方案时，需注意应将拭子涂布得较薄，并在眼部取样步骤中留出充足时间。若无法及时使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），则可通过微生物学和生化试验对分离株进行鉴定。