Name: 眼部微血管血管生成前维沃胆球状芽分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习脉络膜出芽实验方法，用于研究年龄相关性黄斑变性中的微血管增殖机制。该实验利用野生型和基因修饰小鼠组织，可评估药物抗血管生成潜力及特定信号通路在脉络膜新生血管化中的作用。

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本工作获得了Manpei Suzuki糖尿病基金会（YT）、波士顿儿童医院OFD/BTREC/CTREC教师职业发展基金、波士顿儿童医院眼科基金会、BCH试点奖、BCH Manton中心博士后奖学金和Little Giraffe基金会（ZF）、德国研究基金会（DFG；资助BC [CA1940/1-1]）、NIH R24EY024868、EY017017、R01EY01717-13S1、EY030904-01、BCH智力与发育障碍研究中心（1U54HD090255）以及马萨诸塞州狮子会眼科基金会（LEHS）的资助。

所有所述动物实验均经波士顿儿童医院机构动物照护与使用委员会批准（ARCH方案编号19-04-3913R）。
1. 准备
<ol>
	<li>向500 mL含血清的完全经典培养基中加入5 mL青霉素/链霉素（10000 U/mL）以及5 mL和10 mL市售补充剂。最初分装50 mL培养基。 
	注意：为避免污染，切勿将任何培养基倒回原储备液中。</li>
	<li>将一份完全经典培养基置于冰上。</li>
	<li>使用70%乙醇清洁解剖显微镜、镊子和剪刀。</li>
	<li>准备两个细胞培养皿（10 cm），一个放在解剖显微镜下，另一个置于冰上；每个培养皿中加入10 mL完全经典培养基。</li>
</ol>
2. 实验步骤（图1）
<ol>
	<li>使用腹腔注射75-100 mg/kg的氯胺酮和7.5-10 mg/kg的赛拉嗪，在出生后（P）20天左右处死C57BL/6J小鼠。解剖前将眼球保存在冰上的完全经典培养基中。</li>
	<li>去除眼球上的结缔组织（肌肉和脂肪组织）以及视神经。</li>
	<li>使用显微剪刀在角膜缘后方约0.5 mm处做环形切割，移除角膜/虹膜复合体、玻璃体和晶状体。</li>
	<li>从切口边缘垂直朝向视神经方向做1 mm长的切口，并切割出一条宽约1 mm的环形组织带。分离该复合体的中央区与周边区，用镊子将视网膜从RPE/脉络膜/巩膜复合体上剥离下来。&#160;</li>
	<li>将周边部脉络膜组织带保存在冰上的完全经典培养基中；分离另一只眼球并重复上述步骤，获得第二条组织带。</li>
	<li>将环形组织带切成6个大小相近的方形小块（约1 mm × 1 mm）。 
	注意：切勿触碰任何边缘。</li>
	<li>按照生产商说明解冻基底膜提取物（BME）。将30 µL BME加至24孔细胞培养板每孔的中央位置，确保BME液滴在孔底形成凸起的圆顶状，且不接触孔壁。 
	注意：BME应在冰箱中过夜解冻。解冻后任何时候均需置于冰上。</li>
	<li>将组织置于BME的中央位置。 
	注意：不要压平脉络膜外植体；通常让组织在BME内自然展开。组织的方向（巩膜面朝上或朝下）不影响实验结果。</li>
	<li>将培养板在37 °C孵育10分钟，使凝胶固化。</li>
	<li>每孔加入500 µL完全经典培养基。</li>
	<li>每隔一天更换一次经典培养基（500 µL/孔）。3天后可在显微镜下观察到脉络膜出芽现象。 
	注意：如需进行生长因子处理，先对组织进行4小时的饥饿处理。将待试化合物稀释于低生长因子培养基中（以1:200增强，而非1:50）。</li>
</ol>
3. SWIFT-脉络膜计算机量化方法17（图2）
注意：采用计算机化方法测量血管生长所覆盖的面积。在进行定量分析之前，需要准备ImageJ软件的宏插件（详见补充信息）。
<ol>
	<li>使用 ImageJ 打开脉络膜出芽图像，并将图像类型设置为“图像 | 类型 | 8位”，采用灰度模式。</li>
	<li>进入“图像 | 调整 | 亮度/对比度 (Ctrl/shift/C)”，优化图像对比度。</li>
	<li>使用魔棒工具勾勒并去除图像中央出芽区域内的脉络膜组织（使用快捷键“F1”）（图2A,B）。 
	注意：将魔棒工具的容差率设置为 20–30%。</li>
	<li>使用自由选择工具去除图像背景（图2C）。进入“图像 | 调整 | 阈值 (Ctrl/shift/T)”，利用阈值功能将微血管出芽结构与背景及周边区域区分开来（图2D）。</li>
	<li>点击“F2”，系统将显示统计摘要。点击“保存”以保存所选区域的图像，并将文件保存至与原始图像相同的文件夹中，以便后续参考。</li>
	<li>完成一组样本的测量后，复制记录的数据用于数据分析。 
	注意：也可通过“分析 | 设置比例尺”功能，利用带有比例尺的图像来测量面积（µm²）。</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

作者没有财务披露。该计算机化方法可免费提供给学术机构，详情请联系作者。

脉络膜出芽实验有助于研究新生血管性年龄相关性黄斑变性（neovascular AMD）9,10,18,19,20。脉络膜外植体可从小鼠、大鼠以及人类中分离获得17,21。脉络膜外植体包含内皮细胞（ECs）、巨噬细胞和周细胞17。在该实验中，脉络膜内皮细胞与邻近细胞（如视网膜色素上皮细胞，RPE细胞）之间的相互作用有助于阐明脉络膜血管生长的相关机制17。此外，这种可重复且半自动化的评估方法可降低观察者间的变异度17。
<p class="jove_co...

脉络膜血管生成失调与新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）相关1。脉络膜是位于视网膜色素上皮（RPE）下方的微血管床。研究表明，脉络膜血流减少与AMD的进展相关2。血管内皮细胞、RPE、巨噬细胞、周细胞及其他细胞之间复杂的相互作用共同维持组织的稳态3,4,5。因此，建立可重复的模拟脉络膜微环境的实验模型对于研究新生血管性AMD至关重要。
离体血管生成实验和体外内皮细胞培养可作为体内微血管行为研究的补充，用于新药测试和发病机制研究。在眼科血管生成研究的体外实验中，常使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以及分离的原代动物脑或视网膜内皮细胞（ECs）6,7,8特别是人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）已被广泛用作体外脉络膜新生血管（CNV）的模型9 通过评估内皮细胞增殖、迁移、管状结构形成及血管通透性，以评价干预措施6,10然而，由于缺乏与脉络膜中其他细胞类型的相互作用，且大多数实验所用内皮细胞并非来源于脉络膜，因此培养中的内皮细胞作为脉络膜新生血管（CNV）模型存在局限性。小鼠脉络膜内皮细胞在体外难以分离和长期维持培养。
主动脉环实验被广泛用作大血管增殖的模型。来自主动脉外植体的血管 sprouts 包括内皮细胞（ECs）、周细胞和巨噬细胞11。主动脉环实验能很好地模拟大血管的血管生成过程12,13,14。然而，作为脉络膜新生血管化的模型，该方法存在局限性，因为主动脉环属于大血管组织，缺乏脉络膜特有的微血管环境，且来自大血管的 sprouts 可能不同于参与微血管病变的毛细血管网络所产生的 sprouts。最近有研究团队发表了一种离体视网膜实验模型15,16。尽管该模型适用于视网膜新生血管疾病的研究，但对于年龄相关性黄斑变性（AMD）中所见的脉络膜新生血管化而言，其适用性较差。
利用小鼠视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜和巩膜外植组织建立的脉络膜新生血管出芽实验，旨在更真实地模拟脉络膜新生血管（CNV）。该组织可轻松从小鼠（或其他物种）眼球中分离获得17。该实验方法可用于可重复地评估药物化合物的促血管生成和抗血管生成潜力，并利用基因修饰小鼠及对照小鼠的组织来研究特定信号通路在脉络膜新生血管形成中的作用18。该脉络膜出芽实验已被后续多项研究引用9,10,18,19,20。本文将演示该实验方法的具体操作步骤。

<table><tbody><tr><td>阿法沙龙（赛拉嗪）</td><td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>基底膜提取物（BME）Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>含血清和CultureBoost的完全经典培养基</td><td>Cell systems</td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>用于配制 70%</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>组织培养板（24孔）</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>维他克特 CIII（氯胺酮）</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

一种眼微血管新生的离体脉络膜出芽实验方法

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

病理性脉络膜血管生成是年龄相关性黄斑变性的显著特征，可导致视力损害甚至失明。利用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）或分离的原代视网膜内皮细胞（EC）进行的内皮细胞增殖实验，是研究视网膜血管生成的常用体外模型。然而，纯小鼠视网膜内皮细胞的分离在技术上具有挑战性，且视网膜内皮细胞的增殖反应可能与脉络膜内皮细胞不同，并具有不同的细胞间相互作用。为此，我们建立了一种高度可重复的脉络膜出芽培养实验模型，用于模拟脉络膜微血管增殖。该模型包含了脉络膜血管系统（内皮细胞、巨噬细胞、周细胞）与视网膜色素上皮（RPE）之间的相互作用。通过分离小鼠RPE/脉络膜/巩膜组织块，并将其接种于生长因子减少的基底膜提取物（BME）中（第0天），随后每隔一天更换培养基，并在第6天对脉络膜出芽数量进行定量分析。使用倒置相差显微镜拍摄各个脉络膜组织块的图像，并利用本实验室开发的ImageJ软件半自动宏插件对出芽面积进行定量。这种可重复的脉络膜出芽培养实验模型可用于评估潜在治疗化合物，也可用于微血管疾病研究，以利用野生型及基因修饰小鼠组织探究参与脉络膜微血管增殖的相关通路。

每日脉络膜出芽生长的比较
我们分离了带有巩膜的脉络膜，将其嵌入BME中并培养6天（图1）。利用显微镜观察C57BL/6J小鼠从第3天到第6天的脉络膜出芽情况，并使用ImageJ中的半自动定量方法SWIFT-Choroid进行量化。在一个代表性案例中，脉络膜出芽面积（即从组织块延伸出的血管部分，不包括组织块本身）在第3天为0.38 mm2（图3A），第4天为1.47 mm2（图3B），第5天为5.62 mm2（图3C），第6天达到10.09 mm2（图3D）。
游离脂肪酸受体（FFAR）4 抑制会加...

本方案介绍了脉络膜 sprouting 实验，这是一种微血管增殖的离体模型。该实验可用于评估参与脉络膜微血管增殖的相关通路，并利用野生型和基因修饰小鼠组织评估药物治疗效果。

病理性脉络膜血管新生是年龄相关性黄斑变性的显著特征，可导致视力下降和失明。内皮细胞……

该脉络膜检测方法具有高度可重复性，与脉络膜血管生成研究及年龄相关性黄斑变性（AMD）密切相关，可作为微血管行为体内研究的补充。该检测可用于筛选治疗新生血管性AMD的潜在化合物，或利用野生型及基因修饰小鼠组织评估参与脉络膜新生血管形成的通路。开始操作时，将五毫升青霉素、链霉素和10以及五毫升市售补充剂加入500毫升含血清的完全经典培养基中，然后分装50毫升培养基。在2至8摄氏度的冰箱中过夜解冻基底膜提取物（BME）。将一份完整的经典培养基置于冰上。用70%乙醇清洁解剖显微镜、镊子和剪刀。准备两块细胞培养皿，一块放在解剖显微镜下，另一块置于冰上。然后向每块培养皿中加入10毫升完全经典培养基。解剖前将眼球置于冰上，并浸没在完全经典培养基中。去除结缔组织和视神经，然后使用显微剪刀在角膜缘后方0.5毫米处做环形切口。去除角膜-虹膜复合体、玻璃体以及晶状体。从切缘垂直向视神经方向做一毫米切口，环向切割出一条一毫米宽的带状结构，然后分离该复合体的中央区与周边区。用镊子将视网膜从视网膜色素上皮层-脉络膜-巩膜复合体上剥离。将周边脉络膜带置于冰上，用完全经典培养基保存。分离另一只眼睛并重复上述步骤，切取第二条脉络膜带。将环形带切成五到六个大小相近的方形小片。在24孔组织培养板的每个孔中央加入30 µL解冻的BME。确保BME液滴在孔底部形成凸起的圆顶状，且不接触孔壁边缘。将组织置于BME的中央。不要压平脉络膜 X 植物。让组织在基底膜提取物（BME）中自然扩展。将培养板置于 37 °C 下孵育 10 分钟，使凝胶完全凝固，然后每孔加入 500 µL 完全经典培养基。每隔一天更换一次经典培养基。使用显微镜可在三天后观察到脉络膜新生血管 sprouting。使用 ImageJ 打开脉络膜新生血管图像，检查图像类型，将其转换为八位灰度图像。然后通过选择图像、调整亮度对比度并进行调节，以优化对比度。使用魔棒工具勾勒并去除存在于芽体中心的脉络膜组织。利用自由选择工具去除图像背景。接下来，转到图像，调整阈值，使用阈值功能在外周区域将微血管 sprouts 与背景分离。按下 F2 键，将显示摘要信息。点击保存，将所选区域的图像保存至与原始图像相同的文件夹中，以供日后参考。在测量完一组样本后，复制记录的数据以进行分析。本方案用于检测并定量分析C57黑六J小鼠从第3天到第6天的脉络膜新生血管 sprouting。在一个代表性案例中，脉络膜新生血管面积在第3、4、5和6天分别为0.38、1.47、5.62和10.09平方毫米。通过在FFAR4基因敲除小鼠和FFAR4野生型小鼠中进行脉络膜出芽实验，评估了FFAR4缺失对脉络膜血管出芽的影响。在第6天，FFAR4基因敲除小鼠的出芽面积较FFAR4野生型小鼠增大，表明脉络膜血管生长增加。此外，在第6天时，与未处理小鼠相比，经1 µM FFAR4激动剂处理后，脉络膜出芽面积减少。该实验可对药理学化合物的抗血管生成潜力进行可重复的评估，并利用基因修饰小鼠的组织研究特定通路在脉络膜新生血管形成中的作用变化。

an-ex-vivo-choroid-sprouting-assay-ocular-microvascular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

眼部微血管血管生成前维沃胆球状芽分析

角膜的独特之处在于其缺乏血管组织。然而，通过强效的促血管生成因子，可在角膜中诱导出显著的血管生长与存活。因此，角膜可为我们提供一种研究血管生成的宝贵工具。本方案展示了如何开展小鼠角膜囊袋实验模型，以及如何利用该模型评估促血管生成因子所诱导的血管生成。...

用于血管生成研究的角膜囊袋实验小鼠模型

本视频展示了一种改良的基于微载体珠的实验方法，该方法结合了周细胞以研究血管生成早期阶段的内皮细胞出芽。该实验提供了一种体外模型，用于理解血管生成的分子机制以及抗血管生成治疗药物的作用。...

用于早期血管生成评估的微珠出芽实验：一种体外微珠模型，用于研究周细胞存在条件下的内皮细胞出芽

本视频展示了脉络膜出芽的ex...

体外研究眼微血管增殖的脉络膜出芽实验

新生小鼠视网膜为血管生成提供了一个特征明确的生理学模型，可在体内环境中研究不同基因或药物对血管生成的调控作用。准确可视化血管丛的免疫荧光染色对于此类研究的成功至关重要。...

对新生小鼠视网膜进行整体免疫荧光染色以研究血管生成 在体内的

本方案描述了在小鼠中建立的角膜微囊实验方法。...

角膜微囊实验：小鼠眼部血管生成模型

血管生成涉及多种细胞和多系统的相互作用，需要在生理相关的环境中进行研究。本研究的目的是展示大鼠肠系膜培养模型在血管生成过程中对完整的微血管网络进行延时比较的能力。...

一个 离体 延时成像培养大鼠肠系膜微血管网络的方法

本文介绍了一种全面的评估流程 体外...

全面评估的综合流程 体外 使用球体出芽实验评估假定性血管母细胞瘤新生血管形成能力

本方法描述了在标准化的微流控平台上培养由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内皮细胞，形成40条可灌注的三维微血管。该平台能够以可扩展且高通量的方式研究三维环境中由浓度梯度驱动的血管生成出芽过程，包括出芽的吻合及稳定化。...

体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

该实验利用小鼠胚胎干细胞分化形成的类胚体，将其培养在三维胶原凝胶中，以在体外分析调控出芽型血管生成的生物学过程。in...

体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

本研究介绍了二维（2D）划痕伤口迁移实验和三维（3D）球状体出芽实验，以及相应的下游分析方法，包括RNA提取和免疫细胞化学，这些实验是研究血管生成的适宜方法 体外.

利用划痕伤口迁移实验和球体出芽实验在功能和分子水平上研究血管生成

血管新生是发育和疾病中的基本过程，涉及复杂的分子和力学机制。本文介绍一种多功能的2.5D ex vivo...

2.5D 模型 离体 活体组织中出芽式血管生成的力学表征

学习脉络膜出芽实验方法，用于研究年龄相关性黄斑变性中的微血管增殖机制。该实验利用野生型和基因修饰小鼠组织，可评估药物抗血管生成潜力及特定信号通路在脉络膜新生血管化中的作用。

一种眼微血管新生的离体脉络膜出芽实验方法

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