通过单分子荧光原位杂交对转录活性等位基因进行单细胞分析

SM FISH 可精确量化特定 RNase 的水平及其定位。该方法在分析细胞间以及等位基因间 RNA 的变异时尤为有用。基因转录是细胞生物学中的基本过程，SM FISH 能够在单细胞水平上研究 RNA 含量对外部刺激的响应，并提供空间信息。

使用雌激素受体激动剂处理后，用含钙和镁的冷灭菌 PBS 洗涤细胞，然后每孔加入 500 µL 固定缓冲液，于冰上固定 30 分钟。孵育结束后，用含钙和镁的冷灭菌 PBS 洗涤细胞两次，每次 3 分钟，随后向每孔加入 500 µL 70% 乙醇。然后用石蜡膜密封 24 孔板，并将板置于 4°C 旋转器上，固定至少 4 小时，最长可至 16 小时。

进行RNA FISH杂交时，在孵育结束时，将细胞在旋转器上用500微升含有10%甲酰胺的2X SSC缓冲液洗涤一次，室温下孵育5分钟。孵育期间，将一片石蜡塑料膜未暴露面朝上放入经RNA表面去污染剂清洁过的玻璃培养皿中，并在培养皿边缘放置浸有无菌水的饱和滤纸条。孵育结束后，将新配制的GREB1内含子和GREB1外显子探针缓冲液以30微升液滴均匀滴加在石蜡塑料膜的洁净面上，然后用无菌镊子小心地将一片细胞盖玻片细胞面朝下置于每个液滴上，避免产生气泡。

用石蜡塑料封口膜密封培养皿后，再用铝箔包裹，并在37摄氏度的平坦非旋转表面上过夜孵育。次日早晨，使用镊子将盖玻片移回24孔板中，细胞面朝上，在含有10%甲酰胺的500微升新鲜2X SSC缓冲液中，于37摄氏度旋转孵育器上进行两次每次15分钟的洗涤。第二次洗涤后，在旋转孵育器上用含1微克/毫升DAPI的2X SSC缓冲液对DNA进行复染，室温孵育10分钟，随后在室温下用2X SSC缓冲液洗涤5分钟。

使用纸巾去除多余的 2X SSC 缓冲液，并用无核酸酶水冲洗样品以去除过量盐分。然后使用非硬化封片介质将盖玻片封固在载玻片上，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。进行样品成像时，将预期信号强度最高的玻片置于配备 60 或 100 倍油镜和 sCOMS 相机的宽场落射荧光显微镜载物台上，并在物镜上滴加一滴浸油。

进行Z轴层扫采集时，先在DAPI通道中对样本进行聚焦，然后在DAPI染色的细胞核开始失焦的位置确定Z轴层扫的顶部和底部范围。利用样本调整光源照明强度以及各通道的曝光时间，在避免光漂白和相机像素饱和的条件下，采集所有样本的图像。采集完成后，使用10个循环的强效图像复原算法对图像进行去卷积处理，并根据所用相机的位深度保存所有投影图像。

进行图像分析时，首先从 GitHub 下载 Jupiter Notebook，并安装 Python Anaconda Distribution 3.6 或更高版本。打开 Anaconda 命令提示符，输入安装命令以安装适用于 Anaconda 的 SimpleITK。然后打开 Anaconda Navigator，启动 Jupiter Notebook。

浏览器将打开并显示目录和文件。浏览目录结构，找到包含从 GitHub 下载的 Jupiter Notebook 的目录。然后打开该笔记本，按住 Shift 键并按下 Enter 键以运行每个单元格。

在此代表性实验中，贴壁生长的乳腺癌细胞用雌激素受体激动剂或溶剂对照处理 24 小时。针对 GREB1 基因内含子和外显子序列的光谱分离探针组可同时实现新生 mRNA 和成熟 mRNA 的可视化与定量。重要的是，可标记每个细胞中转录活跃等位基因的数量，这些等位基因已被证实参与雌激素反应的时间进程。

通过计数重叠的内含子和外显子信号点，发现经E2处理的细胞中表现出两个或更多活跃GREB1等位基因的细胞比例是经溶剂处理细胞的四倍。由于内含子会在新生mRNA加工成熟过程中被剪切，最终形成的成熟mRNA仅包含外显子序列，因此可通过定量绿色信号点的数量来计数每个细胞中的成熟mRNA数量。绘制这些数据后，即可观察到E2处理后细胞群体中成熟GREB1 mRNA细胞分布的变化以及总体表达量的倍数变化。

C-FISH 可用于依次检测多种 RNA 分子，MERFISH 是一种条形码技术，可大规模提高多重检测能力，而 iFISH 则用于同时研究 RNA 和蛋白质。