Name: 单分子鱼的转录活性等位基因单细胞分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学习单分子RNA荧光原位杂交技术，用于单细胞水平定量分析RNA含量与空间定位。该方法可揭示细胞间及等位基因间的转录变异，帮助研究者深入理解基因表达动态与细胞对外界刺激的响应机制。

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MAM、FS 和 MGM 由美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）资助（项目 4，P42ES027704，项目负责人：Rusyn）。MAM、FS、RMM、MGM 和 PKS 还得到由癌症预防与研究机构（CPRIT）资助的 GCC 先进显微镜与图像信息学中心（RP170719）的支持。成像研究还得到了贝勒医学院综合显微镜核心设施的支持，资助来源包括美国国立卫生研究院（NIH）（DK56338 和 CA125123）、癌症预防与研究机构（CPRIT）（RP150578）、丹·L·邓肯综合癌症中心以及约翰·S·邓恩墨西哥湾沿岸化学基因组学联盟。

为确保最佳结果，本实验方案的湿实验部分在所有步骤中均需采取标准的RNase-free防护措施。例如，强烈建议使用带滤芯的移液器吸头、无菌容器和RNase-free缓冲液。建议使用钒酸核糖核苷复合物等RNase抑制剂，特别是针对丰度较低的目标RNA。
1. 细胞培养与实验设置
<ol>
	<li>在T75组织培养瓶中培养贴壁生长的MCF-7乳腺癌细胞（ATCC #HTB-22），使用不含酚红的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（仅激素刺激实验需要），并添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1 nM丙酮酸钠、50 I.U./mL青霉素和50 µg/mL链霉素。</li>
	<li>将经酸蚀处理并涂覆多聚-D-赖氨酸的圆形盖玻片（厚度0.16至0.19 mm，直径12 mm）放入24孔组织培养板中。 
	注：根据标准操作流程，使用1 M HCl对盖玻片进行酸蚀处理，并用无菌PBS（不含Ca++和Mg++的磷酸盐缓冲液）配制的1 mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液进行包被。</li>
	<li>移除细胞培养液，用5 mL无菌PBS（不含Ca++和Mg++的磷酸盐缓冲液）洗涤一次。使用2–3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化MCF-7细胞。待细胞脱落后，加入等体积的完全培养基中和胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>将含细胞的悬浮液转移至15 mL锥形离心管中，在391 × g条件下离心1分钟以收集细胞。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后用适量处理培养基重悬细胞。 
	注：处理培养基为不含酚红的DMEM，添加5%经炭吸附去除非甾体类物质并透析处理的FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 nM丙酮酸钠、50 I.U./mL青霉素和50 µg/mL链霉素。该培养基对于类固醇激素刺激实验至关重要，因为通过炭吸附处理可基本去除血清中的类固醇成分，并通过透析减少生长因子含量。</li>
	<li>在24孔板中，每孔加入500 µL处理培养基，接种60,000至70,000个细胞于盖玻片上。本实验中，处理开始时细胞汇合度应约为70–80%。根据细胞类型、增殖速率及实验持续时间优化接种密度，以避免细胞过度汇合，从而影响图像分析。 
	注：为获得最佳成像和图像分析效果，应避免细胞聚团。为此，在将细胞分装至各孔前，应通过移液器反复吹打（或短暂涡旋）充分混匀细胞悬液。在将培养板放回培养箱前，先在生物安全柜中静置约20分钟，有助于减少细胞聚团。</li>
	<li>在处理前至少培养两天，以实现细胞周期同步化，并降低因生长培养基中残留的信号分子（来自去除非甾体成分和透析处理后的血清）可能带来的背景干扰。</li>
	<li>在处理培养基中培养48小时后，用10 nM 17β-雌二醇（E2）及溶剂对照（DMSO）处理MCF-7细胞，处理时间为24小时。本实验采用饱和浓度的E2以诱导最大反应。建议通过时间进程和剂量-反应实验，根据不同的靶基因、细胞模型和处理类型，经验性地确定最佳实验条件。具体示例可参见我们近期发表的研究7。</li>
</ol>
2. 缓冲液的制备
<ol>
	<li>配制固定缓冲液时，将纯化的单体甲醛（电子显微镜试剂供应商出售的16%多聚甲醛）用无菌PBS（含Ca²⁺）稀释至4%++/毫克++ 磷酸盐缓冲液加 Ca++ 和 Mg++加入钒酸核糖核苷复合物（VRC），使固定缓冲液中终浓度为 2 mM，以延缓 RNA 降解。
	<ol>
		<li>根据每孔24孔板需要300-500 µL固定液，计算所需固定缓冲液的总体积。将4%甲醛置于冰上保存，直至使用时取出。&#160;固定步骤。 
		注意：每次实验均需新鲜配制固定缓冲液。 
		警告：甲醛是一种可通过皮肤吸收的致畸剂。请根据所在机构的规定，在通风橱中使用该化学品，并穿戴适当的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于透化步骤，使用无核酸酶水配制70%乙醇。另一种可选方案是使用含0.5% Triton-X100的无菌PBS（含Ca²⁺）++/毫克++ 加入2 mM VRC。根据每孔500 µL缓冲液计算所需通透缓冲液的总体积。</li>
	<li>配制9 mL杂交缓冲液，将2 mL 50%硫酸葡聚糖储备液和1 mL 20× SSC（柠檬酸钠盐水）缓冲液加入6 mL无核酸酶水中，涡旋充分混匀。该缓冲液可在4 °C保存最多一周。</li>
	<li>共有五个独立的洗涤步骤需要使用2×盐酸钠柠檬酸钠（SSC）缓冲液。根据每个盖玻片每次洗涤步骤需500 µL缓冲液，计算所需2× SSC缓冲液的总体积。用无核酸酶水将20× SSC储存液稀释至所需浓度。可在洗涤步骤中加入2 mM VRC作为额外预防措施。该缓冲液可在室温下保存，供整个处理过程使用。</li>
</ol>
RNA FISH 的固定
<ol>
	<li>处理后，从孔中移除培养基，并用无菌的冷 PBS Ca++/Mg++ 洗涤一次。若使用低黏附性细胞模型，则不可使用真空抽吸去除液体；应使用手动移液器从孔壁侧边小心移除培养基，并省略初始洗涤步骤。每孔加入 500 µL 固定液，冰上固定 30 分钟。 
	注意：若样本易发生 RNA 降解，此时洗涤步骤应使用含 2 mM VRC 的无菌 PBS。</li>
	<li>移除固定液，并根据机构规定将其作为化学废弃物处理。用冷的无菌 PBS Ca++/Mg++ 洗涤细胞两次，每次 3 分钟。</li>
	<li>移除 PBS，每孔加入 500 µL 70% 乙醇。用石蜡膜密封 24 孔板，4 °C 条件下在旋转器上孵育至少 4 小时。最好将样本在 70% 乙醇中过夜孵育。此时可暂停实验流程，样本可在 70% 乙醇中保存最多一周。 
	注意：可选用含 2 mM VRC 的 0.5% Triton-X100 PBS 溶液作为替代。将样本在旋转器上室温孵育于 500 µL 该通透缓冲液中 20 分钟。若使用此通透缓冲液，则此时不可暂停实验流程，必须继续进行至杂交步骤。</li>
</ol>
4. RNA FISH 杂交
<ol>
	<li>移除通透化缓冲液，并在室温下用 500 µL 含 10% 甲酰胺的 2x SSC 缓冲液在旋转器上洗涤一次，持续 5 分钟。</li>
	<li>配制完全杂交缓冲液。每张盖玻片约需 30 µL 完全杂交缓冲液。向杂交缓冲液中加入甲酰胺，使其达到所需百分比。例如，若需要 500 µL 完全杂交缓冲液，则包含 450 µL 前述已配制的杂交缓冲液和 50 µL 分子生物学级甲酰胺，以达到 10%（v/v）。短暂涡旋混匀。 
	警告：甲酰胺是一种可通过皮肤吸收的致畸剂。请根据机构规定，在通风橱中使用适当的个人防护装备（PPE）操作此化学品。</li>
	<li>用杂交缓冲液将 GREB1 内含子（标记 Atto 647N）和 GREB1 外显子（标记 Quasar 570）探针按 1:300 稀释。通过移液器吹打混匀。避光保存，并立即使用。 
	注：探针的设计与制备详见 Stossi 等人7 的描述。这些探针通常以干燥的寡核苷酸探针混合物形式提供，需根据制造商说明书14 用无 RNA 酶的 TE 缓冲液重新溶解。这些探针的储存液浓度为 12.5 μM，因此工作浓度为 42 nM。</li>
	<li>为过夜杂交步骤准备一个保湿室。将一片石蜡膜（未接触面朝上）铺在已用表面去污剂清洁以去除 RNA 酶的玻璃培养皿内。将两张纸巾用无菌水浸湿后置于培养皿边缘，以提供湿度，防止干燥导致特异性标记受损。</li>
	<li>将含探针的杂交缓冲液以每点 30 µL 滴加到石蜡膜的洁净面上，进行分装。分配探针液滴时应确保各盖玻片之间互不接触。</li>
	<li>使用灭菌镊子，将盖玻片细胞面朝下轻轻翻转至玻璃培养皿中的探针液滴上。避免产生气泡，且不要对盖玻片施加压力。 
	注：请勿丢弃含有 2x SSC 缓冲液的组织培养板，后续步骤中仍需使用。</li>
	<li>用石蜡膜密封玻璃培养皿，并用铝箔包裹以避免荧光染料暴露于光照。在 37 °C 平面上静置孵育过夜，最长可达 16 小时。孵育时间可根据实验经验调整，但建议至少孵育 4 小时。 
	注：盖玻片在杂交缓冲液中孵育时容易滑动，可能导致盖玻片出现干燥区域，从而损伤样本。</li>
</ol>
5. 准备成像样品
<ol>
	<li>第二天，用镊子将盖玻片从湿化室中取出，并将其细胞面朝上放回24孔板中。加入500 µL新鲜的含10%甲酰胺的2x SSC缓冲液，以洗去多余的探针和非特异性杂交物。 
	注意：从此步骤开始需避免样品暴露于光照下。</li>
	<li>在37°C加热旋转仪上，用500 µL含10%甲酰胺的2x SSC缓冲液洗涤细胞两次，每次15分钟。</li>
	<li>在室温下，于含1 µg/mL DAPI的2x SSC缓冲液中旋转染色10分钟，对DNA进行复染。</li>
	<li>在室温下用2x SSC缓冲液洗涤一次，持续5分钟。</li>
	<li>用纸巾吸去多余的2x SSC缓冲液，并用无核酸酶水快速洗涤以去除多余盐分后，将盖玻片用非硬化封片剂封固于载玻片上。最后，用透明指甲油密封盖玻片边缘。</li>
</ol>
6. 高分辨率显微镜与图像处理
<ol>
	<li>使用60倍或100倍油镜和sCMOS相机，在宽场落射荧光显微镜上对样品进行成像。有关本实验所用显微镜和物镜的具体信息，请参见材料表。
	<ol>
		<li>样品处理完成后应立即进行成像，以避免信号随时间发生降解。 
		注意：本实验使用折射率（RI）为1.516的浸油。应通过经验测试选择与特定样品匹配的浸油折射率，因为折射率不匹配会导致点扩散函数产生像差，从而影响图像去卷积效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集时的横向像素尺寸为0.10827 µm。</li>
	<li>使用预期信号最强的样品（即阳性对照），优化每个通道（本示例中为DAPI、TRITC、CY5滤光片）的光源照明强度（即透光率百分比）和曝光时间。在本实验中，E2处理的样品预期在两组GREB1探针中均具有较高信号强度。通常情况下，GREB1内含子和外显子探针的透光率为50–100%，曝光时间范围为0.25–0.60秒。</li>
	<li>此外，图像采集条件应避免光漂白和/或相机像素饱和。根据我们的经验，背景与信号强度之间应至少保持约十倍的差异。少数像素/视野的饱和可能由样品中的非特异性信号引起（例如盖玻片上的污垢、细胞外的探针聚集体），这种情况可以接受，但前提是饱和区域不得纳入定量分析。</li>
	<li>为设置z轴层扫采集，首先在DAPI通道中对焦样品。将z轴层扫的顶部和底部设定在DAPI染色细胞核开始失焦的位置。本实验中使用的z轴步长为每层0.25 µm，总z轴层扫范围应覆盖整个细胞（在MCF-7细胞中约为10 µm）。然而，z轴步长需根据所用物镜进行调整，并应符合奈奎斯特采样准则。 
	注意：内含子通常仅存在于细胞核中；而外显子则同时存在于细胞核和细胞质中。因此，按照上述方式设置z轴层扫可捕获大部分内含子和外显子标记，因为z轴层扫覆盖了整个细胞。</li>
	<li>在初步实验中，通常应至少对200个细胞进行成像，以便定量分析时获得细胞反应幅度及细胞间变异性的快照。</li>
	<li>部分成像细胞将被排除在最终分析之外（即脱落率），因为它们会在分析流程中被过滤掉（例如接触图像边界的细胞、凋亡/有丝分裂期细胞）。 
	注意：在选择成像区域时，需注意几个因素。应选择由DAPI标记的细胞核荧光定义的、分布均匀且不重叠的细胞区域。此外，应尽量选择图像区域边缘处细胞核数量最少的区域，以避免计入部分细胞。对于需要统计分析的实验，始终优先采用自动化的无偏成像方法。</li>
	<li>采集完成后，使用激进型恢复算法对图像进行去卷积处理，迭代次数为10次（即循环次数）。生成最大强度投影图像用于图像分析（若需特定三维分析，则省略此步骤）。根据所用相机的位深度保存所有投影图像；本实验中保存为16位TIFF灰度图像。RGB图像的位深度较低，会导致信息丢失；因此，RGB图像不适用于图像分析。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>阅读说明并从 GitHub 下载 Jupyter Notebook（https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis）。</li>
	<li>安装 Python Anaconda 发行版（https://www.anaconda.com/distribution/），版本需为 3.6 或更高。</li>
	<li>打开 Anaconda 命令提示符，输入安装命令以安装适用于 Anaconda 的 Simple ITK（https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk）。</li>
	<li>打开 Anaconda Navigator 并启动 Jupyter Notebook。浏览器将打开，显示目录和文件。浏览目录结构，找到从 GitHub 下载的 Jupyter Notebook 所在的目录。</li>
	<li>打开该 Notebook，通过同时按下 Shift 和 Enter 来逐个运行每个单元格。</li>
	<li>按照 Notebook 中提供的每个函数和步骤的详细说明进行操作。对于不同的图像数据集，可能需要调整某些参数值。 
	注意：简要说明如下，细胞核通过 DAPI 通道使用局部阈值法进行分割，块大小为 251 像素，填充空洞并移除小于 100 像素的对象。使用分水岭算法分割相互接触的细胞核。然后将核掩膜扩张 100 像素，并以细胞核为盆地使用分水岭算法分离相互接触的对象。为识别稳态 RNA（外显子），采用 Otsu 阈值法；对于转录活跃等位基因（内含子），首先应用高斯模糊（sigma=1），然后采用最大熵阈值法。</li>
</ol>

<ol><li>Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+PJ+%22iGenetics%3A+A+Mendelian+Approach%22">iGenetics: A Mendelian Approach</a>. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).</li>
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<li>Köhler, A., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exporting+RNA+from+the+nucleus+to+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).</li>
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<li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+transcription+at+individual+alleles+is+independent+of+receptor+level+and+active+conformation+but+can+be+modulated+by+coactivators+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity.</a> Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).</li>
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<li>Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+in+situ+RNA+profiling+by+sequential+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization.</a> Nature Methods. 11, 360-361 (2014).</li>
<li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
<li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+principles+and+uses+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16, 33-41 (2019).</li>
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<li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59, 209-221 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的smFISH方法基于先前已发表的方案7,12,14。在本方案中，我们详细说明了从湿实验环节（包括接种密度、固定时间、通透处理和探针浓度）到成像及图像分析等关键步骤的优化过程，为希望开展基因转录单细胞分析的研究实验室提供了一套完整的实验流程。
为了便于进行单细胞分析，细胞应处于亚融合状态且不相互重叠，以便在无需细胞边界标记的情况下准确估算细胞边界。我们建议在整个实验期间进行涵盖较宽接种密度范围的细胞增殖实验，以优化细胞密度。
确定最佳固定时间对于成功的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验至关重要。我们发现，将样品在含有VRC的无菌PBS中稀释的4%纯甲醛溶液中于冰上固定30分钟，可显著提高高质量smFISH图像的一致性，尤其是在需要通过针对目标因子的抗体联合进行结构分析时。甲醛通过交联大分子来固定样品，相比使用有机溶剂等其他固定方法...

基因转录和翻译是生物学中心法则中的两个主要过程，即从DNA序列到RNA再到蛋白质1。在本研究中，我们重点关注转录过程中信使RNA（mRNA）的生成。新生的RNA分子包含非编码的内含子和编码的外显子。内含子在转录过程中被共转录剪接去除，然后mRNA进入细胞质，在核糖体上进行翻译2,3。
传统上，mRNA 的检测是在大量细胞群体（数百至数百万个细胞）中进行的，常用的经典方法包括 RT-qPCR 或 Northern 印迹杂交。尽管这些方法非常强大，但其应用存在局限性，因为它们无法提供细胞间变异（表型异质性）的信息，不能确定转录活性等位基因的数量，且更重要的是缺乏空间定位信息。近年来，全基因组范围的单细胞 RNA 测序（RNAseq）技术的发展开始弥合成像方法与测序技术之间的鸿沟4。然而，RNAseq 存在相对较低的检测效率问题，且其处理步骤会导致空间信息的完全丢失5。尽管单细胞 RNAseq 能够揭示同基因型细胞群体中的表型异质性，RNA 荧光原位杂交（RNA-FISH）则能够在空间层面以及逐个等位基因的基础上，更全面地探究目标基因的表达情况6,7。
RNA FISH 是一种用于在固定细胞中检测和定位目标 RNA 分子的技术。与早期繁琐的方法不同，目前先进的 RNA-FISH 技术利用商业化的核酸探针，这些探针与目标 RNA 序列互补，并通过沃森-克里克碱基配对与目标序列杂交8。早期的原位杂交技术采用了 Gall 和 Pardue 于 1969 年建立的类似方案，即使用能特异性与目标 RNA 杂交的核酸探针对样本进行处理9。该检测最初采用放射性或比色法进行检测；然而，20 世纪 80 年代荧光原位杂交（FISH）技术的发展，先应用于 DNA FISH，随后扩展至 RNA FISH，使得检测灵敏度显著提高，并具备了多重检测的潜力10,11。
RNA FISH 技术的进一步发展使得检测和定量单个 RNA 分子（smFISH）成为可能12,13。直接检测是一种将探针本身标记上荧光染料的方法。smFISH 的一个挑战在于，需要有足够的杂交探针/靶标结合，以产生可被识别为独立、衍射极限点状的荧光信号。为解决这一问题，可使用一组短的单链 DNA 寡核苷酸探针，这些探针互补于靶标 RNA 的不同区域8,12,14。多个探针的结合可增加局部荧光染料的密度，从而使 RNA 在荧光显微镜下呈现为独立的高强度亮点。该方法的优势在于，通过定量分析亮点的大小和强度，可将探针池中寡核苷酸的非特异性结合与真实的 RNA 信号区分开来，从而减少假阳性，提高分析的准确性12。
检测 mRNA 的替代方法包括经典的基于 BAC 克隆的缺口平移法以及近期开发的分支 DNA 系统。在基于 BAC 克隆的缺口平移法中，待标记的 DNA 通过酶切产生缺口，并在暴露的 3’ 末端添加新的核苷酸。DNA 聚合酶 I 的活性促使标记的核苷酸掺入，从而生成所需的探针15,16。分支 DNA 技术则采用成对杂交至 RNA 靶标的寡核苷酸探针，并利用多个信号放大分子对探针信号进行扩增。该方法可显著提高信噪比，但扩增过程可能导致定量结果失真，因为荧光信号点在大小和强度上可能存在极大差异17。
本方案以雌激素受体（ER）阳性乳腺癌细胞系 MCF-7 作为模型系统，该系统被完整应用于美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）超级基金研究计划中，用于量化加尔维斯顿湾/休斯顿航道中内分泌干扰物的影响。实验中，MCF-7 细胞经 ER 激动剂 17β-雌二醇（E2）处理过夜7,18,19。E2 可调控多种 ER 靶基因的表达，其中包括典型的 ER 靶基因 GREB17,20,21,22。本文所述的单分子荧光原位杂交（smFISH）方案采用两组光谱分离的探针靶向 GREB1，一组结合外显子，另一组结合内含子，从而可同时检测成熟 RNA 与新生 RNA7。随后，我们利用落射荧光显微镜结合去卷积技术对 smFISH 标记的样本进行成像，并通过图像分析程序量化每个细胞中活性等位基因的数量及成熟 RNA 的拷贝数。&#160;

<table><tbody><tr><td>17&amp;beta; 雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td>CAS 编号 50-28-2</td></tr><tr><td>Ambion SSC (20X) 缓冲液，无 RNase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM 培养基（含 L-谷氨酰胺和 4.5 g/L 葡萄糖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>由 Invitrogen 生产</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>不含丙酮酸钠</td></tr><tr><td>右旋糖酐硫酸钠，50% 溶液，无菌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3730-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液（含 Ca++/Mg++）</td><td>Corning</td><td>21030CV</td><td>由 Calbiochem 生产</td></tr><tr><td>乙醇，200 证明（100%）</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 孔透明平底 TC 处理多孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>由 Decon Laboratories 生产</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)，500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-753-2978</td><td>由 Gemini Bio Products 生产</td></tr><tr><td>GE Healthcare DeltaVision LIVE 高分辨率去卷积显微镜</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 水，分子生物学级</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3053802</td><td></td></tr><tr><td>浸油 1.516</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29162940</td><td>由 GE Healthcare Bio-Science 生产</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005Cl</td><td>由 Corning 生产</td></tr><tr><td>MCF-7 细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>分子级甲酰胺</td><td>Promega</td><td>PAH5051</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 60x/1.42 NA 物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>52858-076</td><td>由 VWR 销售</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16% 溶液，电镜级</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3001Cl</td><td>由 Corning 生产</td></tr><tr><td>核糖核苷酸钒酸复合物</td><td>VWR</td><td>101229-716</td><td>由 New England Biosciences 生产</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Ambion</td><td>9780</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠，100 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-360-070</td><td>由 Gibco 生产</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 玻璃盖玻片，#1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100，100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>由 Fisher BioReagents 生产</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 抗荧光淬灭封片剂，10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9265087</td><td>由 Vector Laboratories 生产</td></tr></tbody></table>

通过单分子荧光原位杂交对转录活性等位基因进行单细胞分析

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

基因转录是细胞生物学中的一个基本过程，使细胞能够解读并响应内部和外部信号。传统的群体检测方法（如Northern印迹、PCR和RNA测序）虽然可以测量mRNA水平，但无法提供细胞间反应差异的信息。通过单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）技术，可实现对单个细胞及等位基因的精确可视化与定量分析。RNA-FISH通过将靶标RNA与标记的寡核苷酸探针进行杂交来实现。这些样本可在中高通量模式下成像，并通过图像分析流程，在单细胞水平上对成熟和新生RNA进行定量分析。本实验方案所描述的模式系统已在实验室中经过多年优化，针对固定、通透、杂交和成像等步骤建立了稳定可靠的方法，从而实现高质量的smFISH标记单细胞分析。样品制备与处理的主要目标是获得信噪比高的优质图像，以减少假阳性结果，并提高数据的准确性。本文提供了一套从样品制备到数据分析的完整操作流程，并结合具体建议和优化步骤，以适应不同样品的需求。&#160;

以分析激素反应为例，我们选择了在高通量检测中用于检测环境灾难中内分泌干扰物存在的雌激素受体（ER）模型，该研究是参与NIEHS超级基金研究计划的一部分7。在本实验中，贴壁生长的MCF-7乳腺癌细胞用ER激动剂17β-雌二醇（E2，10 nM）或溶剂对照（DMSO）处理24小时。针对GREB1基因内含子（Atto 647N，图1中红色）和外显子序列（Quasar 570，图1中绿色）的光谱分离探针组可实现新生mRNA与成熟mRNA的同步可视化与定量；尤为重要的是，可标记每个细胞中转录活跃的等位基因数量，该指标已被证实为雌激素反应时间过程的一部分7。
完成的实验方案将为每个感兴趣区域生成16位最大强度投影图像（TIFF）。核分割基于DAPI染色的细胞核进行，并通过扩展核掩膜来估计细胞边界。随后对GREB1内含子和外显子信号进行分割，并分配至各个单个细胞。<strong cl...

单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）是一种用于在单细胞水平上精确定量特定RNA表达水平及其定位的方法。本文中，我们报告了经过验证的实验室操作流程，包括湿实验处理、成像以及针对特定RNA的单细胞定量图像分析方法。

基因转录是细胞生物学中的一个基本过程，使细胞能够解读并响应内部和外部信号。传统的群体...

SM FISH 可精确量化特定 RNase 的水平及其定位。该方法在分析细胞间以及等位基因间 RNA 的变异时尤为有用。基因转录是细胞生物学中的基本过程，SM FISH 能够在单细胞水平上研究 RNA 含量对外部刺激的响应，并提供空间信息。使用雌激素受体激动剂处理后，用含钙和镁的冷灭菌 PBS 洗涤细胞，然后每孔加入 500 µL 固定缓冲液，于冰上固定 30 分钟。孵育结束后，用含钙和镁的冷灭菌 PBS 洗涤细胞两次，每次 3 分钟，随后向每孔加入 500 µL 70% 乙醇。然后用石蜡膜密封 24 孔板，并将板置于 4°C 旋转器上，固定至少 4 小时，最长可至 16 小时。进行RNA FISH杂交时，在孵育结束时，将细胞在旋转器上用500微升含有10%甲酰胺的2X SSC缓冲液洗涤一次，室温下孵育5分钟。孵育期间，将一片石蜡塑料膜未暴露面朝上放入经RNA表面去污染剂清洁过的玻璃培养皿中，并在培养皿边缘放置浸有无菌水的饱和滤纸条。孵育结束后，将新配制的GREB1内含子和GREB1外显子探针缓冲液以30微升液滴均匀滴加在石蜡塑料膜的洁净面上，然后用无菌镊子小心地将一片细胞盖玻片细胞面朝下置于每个液滴上，避免产生气泡。用石蜡塑料封口膜密封培养皿后，再用铝箔包裹，并在37摄氏度的平坦非旋转表面上过夜孵育。次日早晨，使用镊子将盖玻片移回24孔板中，细胞面朝上，在含有10%甲酰胺的500微升新鲜2X SSC缓冲液中，于37摄氏度旋转孵育器上进行两次每次15分钟的洗涤。第二次洗涤后，在旋转孵育器上用含1微克/毫升DAPI的2X SSC缓冲液对DNA进行复染，室温孵育10分钟，随后在室温下用2X SSC缓冲液洗涤5分钟。使用纸巾去除多余的 2X SSC 缓冲液，并用无核酸酶水冲洗样品以去除过量盐分。然后使用非硬化封片介质将盖玻片封固在载玻片上，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。进行样品成像时，将预期信号强度最高的玻片置于配备 60 或 100 倍油镜和 sCOMS 相机的宽场落射荧光显微镜载物台上，并在物镜上滴加一滴浸油。进行Z轴层扫采集时，先在DAPI通道中对样本进行聚焦，然后在DAPI染色的细胞核开始失焦的位置确定Z轴层扫的顶部和底部范围。利用样本调整光源照明强度以及各通道的曝光时间，在避免光漂白和相机像素饱和的条件下，采集所有样本的图像。采集完成后，使用10个循环的强效图像复原算法对图像进行去卷积处理，并根据所用相机的位深度保存所有投影图像。进行图像分析时，首先从 GitHub 下载 Jupiter Notebook，并安装 Python Anaconda Distribution 3.6 或更高版本。打开 Anaconda 命令提示符，输入安装命令以安装适用于 Anaconda 的 SimpleITK。然后打开 Anaconda Navigator，启动 Jupiter Notebook。浏览器将打开并显示目录和文件。浏览目录结构，找到包含从 GitHub 下载的 Jupiter Notebook 的目录。然后打开该笔记本，按住 Shift 键并按下 Enter 键以运行每个单元格。在此代表性实验中，贴壁生长的乳腺癌细胞用雌激素受体激动剂或溶剂对照处理 24 小时。针对 GREB1 基因内含子和外显子序列的光谱分离探针组可同时实现新生 mRNA 和成熟 mRNA 的可视化与定量。重要的是，可标记每个细胞中转录活跃等位基因的数量，这些等位基因已被证实参与雌激素反应的时间进程。通过计数重叠的内含子和外显子信号点，发现经E2处理的细胞中表现出两个或更多活跃GREB1等位基因的细胞比例是经溶剂处理细胞的四倍。由于内含子会在新生mRNA加工成熟过程中被剪切，最终形成的成熟mRNA仅包含外显子序列，因此可通过定量绿色信号点的数量来计数每个细胞中的成熟mRNA数量。绘制这些数据后，即可观察到E2处理后细胞群体中成熟GREB1 mRNA细胞分布的变化以及总体表达量的倍数变化。C-FISH 可用于依次检测多种 RNA 分子，MERFISH 是一种条形码技术，可大规模提高多重检测能力，而 iFISH 则用于同时研究 RNA 和蛋白质。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

单分子鱼的转录活性等位基因单细胞分析

本文介绍了一种从大鼠原代神经元培养物中分离单细胞并利用aRNA扩增技术进行后续转录组分析的简单方法。该方法可推广应用于任何细胞类型。...

单细胞转录组分析

荧光原位杂交（FISH）可用于鉴定单个细胞中的mRNA转录本，从而分析多基因活性，例如在恶性疟原虫感染的红细胞中同时转录var多基因家族中的多个成员1。该技术具有可适应性，可应用于不同类型的基因、细胞和生物体。...

单细胞基因转录的RNA荧光原位杂交（FISH）分析

我们描述了一种利用直接标记的荧光探针，通过三维DNA荧光原位杂交（3D DNA...

使用直接标记探针的稳定3D DNA FISH方法

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

该单分子荧光原位杂交实验方案经过优化，可用于定量营养生长和减数分裂期间芽殖酵母中的RNA分子数量。...

单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

CUT&amp;#38;RUN 及其变体可用于确定蛋白质在染色质上的占据情况。本实验方案描述了如何利用单细胞 uliCUT&amp;#38;RUN...

使用超低输入量靶向切割与核酸酶释放技术进行染色质上单细胞因子定位

本文介绍了一种在完整斑马鱼胚胎中对正常和异常胞嘧啶甲基化进行快速、高效时空监测的实验方案。...

完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

Drosophila 是研究调控肌生成关键分子的成熟模型。然而，现有方法尚不足以确定合胞体内部 mRNA...

在单分子尺度上研究肌肉转录动态 黑腹果蝇

本文介绍了一种快速简便的ATAC-seq实验方案，仅需30 µL线虫沉淀，即可应用于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

学习单分子RNA荧光原位杂交技术，用于单细胞水平定量分析RNA含量与空间定位。该方法可揭示细胞间及等位基因间的转录变异，帮助研究者深入理解基因表达动态与细胞对外界刺激的响应机制。

通过单分子荧光原位杂交对转录活性等位基因进行单细胞分析

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